高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定蝦肉中四種獸藥殘留及其熱穩(wěn)定性分析

沈可伊,鄒曉霜,王軍

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京,100083)

近30年來,水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模年均增長(zhǎng)已達(dá)到6%[1]。中國(guó)的水產(chǎn)品產(chǎn)量占全球產(chǎn)量的60%以上,成為了世界水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)[2]。2000—2014年,中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量從2 460萬t增長(zhǎng)到4 750萬t,增長(zhǎng)率為93.1%[3],由此可見,中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)量呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢(shì)。在水產(chǎn)養(yǎng)殖和運(yùn)輸?shù)倪^程中,一些獸藥會(huì)被用于治療或預(yù)防疾病,因此有時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)獸藥濫用的現(xiàn)象。近些年,在水產(chǎn)品消費(fèi)中蝦類占比較大,為了確保食品安全,需要對(duì)蝦中可能殘留的一些獸藥進(jìn)行分析。

氟喹諾酮類藥物于1980年代首次引入并迅速成為最受歡迎的抗生素藥物之一[4]。氟喹諾酮類藥物可以治療人類呼吸道、泌尿道和消化道感染,這也有助于擴(kuò)大這類藥物在預(yù)防動(dòng)物感染方面的應(yīng)用。與其他抗生素相比,氟喹諾酮類藥物不易分解,并且與土壤的相互作用有高度特異性[5]。食品中殘留的氟喹諾酮類藥物會(huì)引起過敏反應(yīng)、中毒反應(yīng)以及抗菌素的耐藥性等,從而對(duì)人體健康造成潛在危害[6]。在農(nóng)業(yè)部2292號(hào)公告中明確禁止諾氟沙星和氧氟沙星作為獸藥使用。但是由于諾氟沙星和氧氟沙星價(jià)格便宜、效果好,存在養(yǎng)殖人員違規(guī)使用這2種獸藥的風(fēng)險(xiǎn),從而引發(fā)食品安全問題。地西泮和安眠酮是重要的抗精神病藥。地西泮用于治療焦慮癥[7]和作為抗腫瘤抗生素[8]。安眠酮可以用于治療失眠癥狀[9]。在水產(chǎn)品的運(yùn)輸過程中,地西泮和安眠酮有減輕壓力、抑制水產(chǎn)品活動(dòng)、催眠、降低代謝的作用,以防止水產(chǎn)品身體損傷和體重減少[10]。但是殘留在蝦中的地西泮和安眠酮可能會(huì)對(duì)人體健康造成危害,我國(guó)已經(jīng)規(guī)定在蝦中不能檢出安眠酮和地西泮。近些年,在國(guó)家食品安全抽檢中,多次被檢測(cè)出這4種獸藥,因此這幾種物質(zhì)成為重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的獸藥殘留物。目前為止,高效液相色譜[11-13]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜[14-17]以及氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜[18-20]已經(jīng)應(yīng)用于分別檢測(cè)安眠酮、地西泮、諾氟沙星以及氧氟沙星,但目前仍然缺乏能靈敏、準(zhǔn)確地同時(shí)分析這4種需要重點(diǎn)監(jiān)控獸藥的方法,使得在實(shí)際檢測(cè)當(dāng)中需要用到2種及以上的分析方法才能對(duì)這4種獸藥進(jìn)行全面的分析檢測(cè)。

因此,本文建立了一種同時(shí)檢測(cè)蝦肉中安眠酮、地西泮、諾氟沙星以及氧氟沙星的方法,為蝦肉中這些獸藥殘留風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供有效的技術(shù)手段。本研究使用的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)比液相色譜法更加靈敏,且具備可以同時(shí)檢測(cè)蝦肉中這4種獸藥化合物的優(yōu)勢(shì),從而縮短了分析時(shí)間并提高了分析效率。同時(shí),分析了蝦肉中這些殘留物在加熱過程中是否存在分解或者轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象,對(duì)了解這4種獸藥殘留的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)化規(guī)律可提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氧氟沙星(ofloxacin,純度98%)標(biāo)準(zhǔn)品、諾氟沙星(norfloxacin,純度98%)標(biāo)準(zhǔn)品(均為固體)、甲醇、甲酸(均為色譜純),百靈威科技有限公司;地西泮(diazepam,溶于甲醇,100 μg/mL)、安眠酮(methaqualone,溶于甲醇,100 μg/mL),天津阿爾塔科技有限公司;乙腈(色譜純),美國(guó)Thermo Fisher Scien- tific公司;鹽酸(分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無水硫酸鈉(分析純),上海麥克林生化科技有限公司;C18固相萃取柱(500 mg/6mL),天津博納艾杰爾科技有限公司;超純水系統(tǒng),美國(guó)Millipore公司;蝦肉,北京市各大超市。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 infinity-6460高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,美國(guó)安捷倫科技公司;ME204/02電子天平(萬分之一天平220 g/0.1mg),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;QL-861渦旋振蕩器,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;OSB-2100/N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海愛朗儀器有限公司;H1750R醫(yī)用離心機(jī),湘儀離心機(jī)儀器有限公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋,榮華儀器制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取適當(dāng)氧氟沙星和諾氟沙星,用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液,溶解較慢可加入適量甲酸并超聲輔助溶解。取適量安眠酮和地西泮的液體標(biāo)準(zhǔn)品、氧氟沙星和諾氟沙星的單一標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液,用甲醇配制成為1 μg/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液,儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中備用。

稱取空白蝦肉樣品5 g,分別加入適量單一標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,按照1.3.2與試樣同時(shí)進(jìn)行提取和凈化,得到質(zhì)量濃度為0.05～40 ng/mL的基質(zhì)混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品預(yù)處理

1.3.2.1 提取

將蝦肉用絞肉機(jī)絞碎成肉泥后,稱取5 g蝦肉泥于50 mL離心管中,加入2 g無水硫酸鈉和25 mL乙腈,將混合物渦旋提取30 s,充分分散混勻后,超聲提取15 min,3 500 r/min離心5 min,取出上清液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中,重復(fù)上述步驟1次,合并上清液,上清液在50 ℃條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。

1.3.2.2 凈化

取C18固相萃取柱,先后用5 mL甲醇和5 mL水進(jìn)行活化,用5 mL 0.01 mol/L的鹽酸水溶液溶解1.3.2.1 中圓底燒瓶中的上清液殘留物,將殘留物混合液通過C18固相萃取柱,流速控制在1 mL/min內(nèi),棄去濾液。再用5 mL 0.01 mol/L的鹽酸水溶液溶解圓底燒瓶中的剩余物,將溶解后的混合物溶液通過C18固相萃取柱,棄去濾液。用10 mL 0.01 mol/L的鹽酸甲醇溶液洗脫固相萃取柱,收集洗脫液,經(jīng)50 ℃ 條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,加入1 mL甲醇復(fù)溶,用0.22 μm尼龍針頭過濾器進(jìn)行過濾,濾液用于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.3.3 陽(yáng)性樣品制備

稱取空白蝦肉5 g(精確至0.01 g),用研磨缽研磨至肉泥狀,注射標(biāo)準(zhǔn)品溶液,制備成為諾氟沙星加標(biāo)量為60 μg/kg、氧氟沙星加標(biāo)量為30 μg/kg以及安眠酮和地西泮加標(biāo)量為10 μg/kg的樣品。將加標(biāo)后的蝦肉樣品放置在4 ℃冰箱中平衡6 h,模擬樣品被獸藥污染,備用。

1.3.4 加熱處理

將1.3.3中平衡6 h后的蝦肉樣品,加入10 mL超純水,放入90 ℃水浴中分別加熱15、30、45、60 min,取出后冷卻、研磨,加熱后的蝦肉樣品按照 1.3.2 進(jìn)行處理,蝦肉水煮液用濾紙過濾去除部分雜質(zhì)。蝦肉提取液經(jīng)過C18固相萃取柱除雜之后,將對(duì)應(yīng)的蝦肉水煮液加入相同的固相萃取柱過濾,棄去濾液,隨后按照1.3.2.2中方法處理,得到濾液,備用。

將1.3.3中平衡6 h后的蝦肉樣品,加入10 mL超純水,放入90 ℃水浴中分別加熱15、60 min,取出后冷卻、研磨,加熱后的蝦肉按照1.3.2進(jìn)行處理,得到濾液,備用。

1.3.5 HPLC-MS/MS條件

1.3.5.1 色譜條件

Eclipse XDB-C18柱(2.1 mm×150 mm,3.5 μm);流速為0.2 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量10 μL;流動(dòng)相:A相為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液,B相為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸甲醇溶液,洗脫梯度如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution conditions

1.3.5.2 質(zhì)譜條件

選擇電噴霧離子源,正離子模式(electrospray ionization,ESI+);所有分析物檢測(cè)均在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM)模式下進(jìn)行;碰撞氣體和鞘氣均為高純氮?dú)?霧化器壓力為310.3 kPa;鞘氣溫度為400 ℃ ;鞘氣流量為12 L/min;毛細(xì)管電壓為3 800 V。4種化合物在該色譜以及質(zhì)譜條件下的MRM色譜圖如圖1所示。

a-安眠酮;b-地西泮;c-諾氟沙星;d-氧氟沙星圖1 四種獸藥基質(zhì)加標(biāo)溶液的MRM色譜圖Fig.1 The MRM chromatograms of four veterinary drugs in spiked sample matrices

1.3.6 C18固相萃取柱凈化條件優(yōu)化方法

稱取4份5 g空白樣品,以安眠酮0.1 μg/kg、地西泮0.1 μg/kg、諾氟沙星3.8 μg/kg、氧氟沙星2.4 μg/kg的濃度進(jìn)行加標(biāo),經(jīng)過1.3.2.1步驟提取后,4份加標(biāo)樣品分別用不同的洗脫液進(jìn)行復(fù)溶、洗脫,洗脫液包括:甲醇-水(1∶4,體積比)、甲醇-水(1∶9,體積比)、0.01 mol/L甲酸甲醇溶液和0.01 mol/L鹽酸水溶液,除洗脫液不同外,其他凈化步驟與1.3.2.2中一致,隨后將凈化后的4份樣品溶液用HPLC-MS/MS方法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器參數(shù)的優(yōu)化

2.1.1 色譜參數(shù)的優(yōu)化

根據(jù)這4 種化合物的分子極性差異,當(dāng)用甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí),地西泮和安眠酮的保留時(shí)間較長(zhǎng)[21],而諾氟沙星氧氟沙星的保留時(shí)間明顯較地西泮和安眠酮短,因此流動(dòng)相比例選擇先用高比例水相對(duì)2種沙星進(jìn)行分離,再用高比例甲醇洗脫出地西泮和安眠酮,通過優(yōu)化的色譜條件能夠有效地將這4種獸藥進(jìn)行色譜分離。同時(shí)在流動(dòng)相中加入0.1%甲酸,有助于4種化合物分子在正離子模式下進(jìn)行離子化。因此,通過優(yōu)化后選擇0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇溶液作為流動(dòng)相,當(dāng)洗脫梯度如表1所示時(shí),4 種獸藥物質(zhì)的分離效果較好。

2.1.2 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

對(duì)4種化合物分子通過質(zhì)譜PRODUCT模式進(jìn)行分析,首先確定母離子后再通過二級(jí)質(zhì)譜掃描,對(duì)母離子碎裂后產(chǎn)生的子離子進(jìn)行篩選,選擇響應(yīng)最強(qiáng)、靈敏性好的子離子作為定量離子,與特征結(jié)構(gòu)相關(guān)的子離子作為定性離子。4種化合物的母、子離子以及相應(yīng)的碰撞能量和碎裂電壓詳見表2。

表2 四種分析物的MRM模式分析參數(shù)Table 2 MRM conditions for four analytes

2.2 C18固相萃取柱凈化條件優(yōu)化

為了分析確定目標(biāo)化合物在C18固相萃取柱上的保留率,對(duì)凈化步驟中的洗脫液進(jìn)行了優(yōu)化。經(jīng)4種不同洗脫液凈化后的加標(biāo)回收率如表3所示。結(jié)果表明,對(duì)諾氟沙星和氧氟沙星而言,使用0.01 mol/L 鹽酸水溶液進(jìn)行洗脫后的回收率高于使用其他3種溶液洗脫后的回收率;對(duì)安眠酮和地西泮而言,使用0.01 mol/L鹽酸水溶液進(jìn)行洗脫后的回收率也高于使用甲醇-水(1∶4,體積比)以及甲醇-水(1∶9,體積比)進(jìn)行洗脫后的回收率,同時(shí),采用0.01 mol/L鹽酸水溶液進(jìn)行洗脫后,4種獸藥殘留加標(biāo)回收率為90.75%～103.99%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)值為1.23%～3.91%,因此,本研究選擇0.01 mol/L鹽酸水溶液作為凈化步驟中的洗脫液。在該洗脫液條件下,不僅能夠起到凈化作用而且目標(biāo)化合物保持了良好的回收率。

表3 不同洗脫液中4種獸藥分析物的回收率 單位：%

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

為了消除蝦肉中存在的基質(zhì)效應(yīng),利用空白蝦肉加標(biāo)制作為質(zhì)量濃度在0.05～40 ng/mL的5個(gè)基質(zhì)混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,按照確定的HPLC-MS/MS參數(shù)進(jìn)行分析,混標(biāo)中各個(gè)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線以工作溶液濃度為x,以定量離子的峰面積為y。結(jié)果表明,4種獸藥質(zhì)量濃度在0.05～40 ng/mL線性關(guān)系良好,R2均>0.99。將基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液不斷稀釋,通過信噪比S/N=3和S/N=10分別計(jì)算該方法的檢出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantita- tion,LOQ),4種獸藥的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)R2、LOD以及LOQ如表4所示。

表4 線性方程、線性范圍、R2、LOD以及LOQTable 4 Calibration curve, linear range, R2,limit of detection, and limit of quantitation

2.4 準(zhǔn)確度和精密度

在空白蝦肉中,根據(jù)LOD的3、5、10倍(低、中、高濃度)為加標(biāo)水平進(jìn)行回收率驗(yàn)證,回收率和RSD見表5。方法的平均回收率為78%～119%,RSD為1.14%～4.76%,該方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足蝦肉中安眠酮、地西泮、諾氟沙星以及氧氟沙星的檢測(cè)需求。

表5 基質(zhì)加標(biāo)回收率和RSD(n=3)Table 5 Average recoveries and relative standard deviation(n=3)

2.5 樣品分析

在北京市3家不同的超市購(gòu)買到5種蝦,應(yīng)用優(yōu)化的樣品前處理方法和液質(zhì)分析方法對(duì)這5種蝦肉進(jìn)行檢測(cè),在這些樣品中均未檢測(cè)出安眠酮、地西泮、諾氟沙星以及氧氟沙星。此外,本研究利用質(zhì)量控制的方法來驗(yàn)證這些樣品分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。在這5種蝦肉中以4種獸藥的5倍LOD加標(biāo)水平進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果如表6所示。4種化合物的加標(biāo)樣品回收率為(106.22±0.89)%～(117.89±1.21)%,加標(biāo)回收率良好,進(jìn)一步驗(yàn)證了樣品分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表6 樣品回收率Table 6 The average recoveries in samples

2.6 加熱過程中穩(wěn)定性分析

蝦肉常用烹飪方法多為白灼,因而選擇在90 ℃下進(jìn)行水浴加熱,研究不同加熱時(shí)間對(duì)于4種獸藥殘留物含量的影響。按照1.3.3中的方法制備蝦肉樣品,按照1.3.4中的方法處理后,經(jīng)過提取、凈化以及HPLC-MS/MS方法分析,得到安眠酮、地西泮、諾氟沙星以及氧氟沙星的濃度隨時(shí)間變化的結(jié)果,結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出,隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng),4種化合物在蝦肉中的含量保持穩(wěn)定。蝦肉中的安眠酮、地西泮、諾氟沙星以及氧氟沙星在90 ℃加熱15、30、45、60 min后的含量與未加熱處理蝦肉中的含量沒有顯著性差異(P>0.05)。同時(shí),由表7中數(shù)據(jù)可推斷,蝦肉與蝦肉水煮液合并檢測(cè)相對(duì)于只測(cè)定蝦肉中的獸藥殘留數(shù)值沒有顯著性差異(P>0.05),表明在水煮過程中,蝦肉中的這4種獸藥不易遷移到蝦肉水煮液中,大部分仍保留在蝦肉中,說明通過水煮加熱的方式并不能除去蝦肉中的這些獸藥殘留。蝦肉基質(zhì)中的安眠酮、地西泮、諾氟沙星以及氧氟沙星在食品常用的水煮烹飪方式下,表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性,很難因?yàn)榉纸饣蛘吲c蝦肉中的蛋白等基質(zhì)相互作用而減少。

王綪[22]研究了在水浴60、80、100 ℃加熱條件下,牛肉中沙拉沙星和二氟沙星的降解率分別為30.75%～37.00%以及3.5%～9.50%。雞肉中的鹽霉素和莫能菌素在100 ℃水煮條件下,降解率可以達(dá)到72.5%和61.4%,但當(dāng)溫度在20～80 ℃時(shí),鹽霉素的降解速率會(huì)變低[23]。本研究中的4種獸藥在蝦肉中的熱穩(wěn)定性較高,與這些化合物的穩(wěn)定環(huán)狀結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

表7 加熱后4種獸藥在蝦肉中的含量 單位：μg/kg

3 結(jié)論

本研究建立了以乙腈為提取溶劑,C18固相萃取柱凈化,同時(shí)對(duì)蝦肉中安眠酮、地西泮、諾氟沙星和氧氟沙星進(jìn)行檢測(cè)的高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜的分析方法,在0.05～40 ng/mL的線性范圍內(nèi),相關(guān)系數(shù)R2均>0.99,LOD為0.01～0.38 μg/kg,4種化合物的回收率為78%～119%,RSD為1.14%～4.76%,該方法適合蝦肉中這4種獸藥殘留的分析,為蝦肉中同時(shí)分析氟喹諾酮類藥物以及鎮(zhèn)靜類藥物提供了參考方法。此外,利用建立的分析方法,對(duì)模擬水煮烹飪條件下蝦肉中安眠酮、地西泮、諾氟沙星和氧氟沙星的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了研究,結(jié)果表明蝦肉中這4種獸藥在90 ℃水煮條件下,加熱15、30、45、60 min后的含量相較于未經(jīng)過加熱處理樣品的含量沒有顯著變化(P>0.05),證明這4種獸藥在蝦肉中的熱穩(wěn)定性較高,不能通過水煮加熱的方式除去蝦肉中的這些殘留物。