基于氣相色譜-離子遷移譜結(jié)合化學計量學分析大鯢肉冷藏期間揮發(fā)性成分

劉俊霞,趙萍,金晶,金文剛*,姜鵬飛

1(陜西理工大學 生物科學與工程學院,秦巴生物資源與生態(tài)環(huán)境省部共建國家重點實驗室,陜西 漢中,723001) 2(陜西理工大學,陜西省資源生物重點實驗室,陜西 漢中,723001)3(陜西理工大學,陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,陜西 漢中,723001)4(大連工業(yè)大學 食品學院,國家海洋食品工程技術(shù)研究中心,遼寧 大連,116034)

大鯢(Andriasdavidianus)為我國特有珍稀物種,是現(xiàn)存?zhèn)€體最大的兩棲動物,也是《人工繁育國家重點保護水生野生動物名錄》(第一批)物種[1]。大鯢食用和藥用價值較高,具有極大的開發(fā)利用前景[2]。目前,研究人員已經(jīng)在大鯢營養(yǎng)組成[2]、活性肽[3]、膠原蛋白/明膠[4]、分割加工與貯藏保鮮[5-6]等方面進行了應(yīng)用開發(fā)。活體大鯢宰殺程序復(fù)雜,隨著大鯢分割加工的產(chǎn)業(yè)化,特別是分割鮮肉及其速凍產(chǎn)品的上市,擴大了銷售范圍[7]。水產(chǎn)魚類營養(yǎng)成分豐富,但水分含量較高,在貯藏和銷售過程中易發(fā)生腐敗變質(zhì),產(chǎn)生不良氣味導致品質(zhì)劣變,故揮發(fā)性氣味物質(zhì)也是魚肉新鮮度評價的指標之一[8]。

近年來,水產(chǎn)品揮發(fā)性成分檢測技術(shù)日趨成熟,如氣相-質(zhì)譜儀、氣相色譜-嗅聞儀、電子鼻和氣相-離子遷移色譜(gas chromatograph-ion mobility spectrometer,GC-IMS)等[4，7]。與揮發(fā)性成分定性定量主流技術(shù)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)相比,GC-IMS具有樣品準備簡便、高靈敏度、高分辨率和可視化等優(yōu)勢,也被逐漸應(yīng)用于肉類冷藏過程[9]揮發(fā)性成分分析中。徐永霞等[10]通過研究4 ℃冷藏過程中大菱鲆的感官品質(zhì)、揮發(fā)性鹽基氮(total volatile base nitrogen,TVB-N)和揮發(fā)性成分,確定貯藏20 d時已達腐敗階段。周明珠等[11]對鮰魚4 ℃冷藏過程中的揮發(fā)性成分進行分析,發(fā)現(xiàn)4 ℃冷藏過程中的特征風味物質(zhì)主要為己醛、壬醛、苯甲醛和1-辛烯-3-醇。張晶晶等[12]對不同冷藏期間鯧魚肉和草魚肉的氣味變化進行分析,貯藏期間鯧魚和草魚分別鑒定出22種和19種揮發(fā)性物質(zhì)。BAI等[13]對鲯鰍和黃鰭金槍魚腐敗變質(zhì)的揮發(fā)性化合物進行研究,鑒定和量化了鲯鰍中20種和黃鰭金槍魚中16種揮發(fā)性化合物,發(fā)現(xiàn)一些醛、酮、醇和二硫類化合物與魚類的腐敗變質(zhì)有很強的相關(guān)性。

前期已利用GC-IMS分析了大鯢肉不同部位[7]的揮發(fā)性成分分析。迄今,有關(guān)大鯢分割肉氣調(diào)保鮮、微凍和冷凍貯藏過程中理化品質(zhì)的研究已有報道[5-6],而大鯢肉冷藏過程中感官、理化指標并結(jié)合揮發(fā)性氣味成分相關(guān)性研究,還鮮見報道。為此,本研究以4 ℃冷藏大鯢肉為對象,通過GC-IMS技術(shù)對不同冷藏時間大鯢肉揮發(fā)性氣味物質(zhì)進行分析,采用主成分分析(principal component analysis,PCA)、正交偏最小二乘-判別分析(orthogonal partial least squares- discriminant analysis,OPLS-DA)等多元統(tǒng)計方法,結(jié)合感官評價和TVB-N含量變化,探究冷藏過程中大鯢肉品質(zhì)及揮發(fā)性氣味物質(zhì)的相關(guān)性,以期為大鯢冷鮮肉銷售及品質(zhì)控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康子代大鯢三尾,體重(2.64±0.54)kg,為同齡大鯢,漢中市龍頭山大鯢養(yǎng)殖基地;妙潔保鮮膜,潤裕購物超市;三氯乙酸,阿拉丁公司;甲基紅、亞甲基藍,北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司;氧化鎂,天津市百世化工有限公司;硼酸,天津市福晨化學試劑廠;鹽酸,杭州匯普化工儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BCD-649 WE冷凍冷藏箱,青島海爾股份有限公司;FlavourSpec?氣味分析儀,德國G.A.S公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同冷藏時間大鯢肉樣品制備

大鯢經(jīng)熱燙、放血、刮去皮膚黏液、去除內(nèi)臟、分割獲得大鯢胴體,將大鯢肌肉切成3 cm×2 cm×1 cm大小的塊狀,分裝于托盤中,并用保鮮膜密封,于4 ℃冰箱冷藏備用。分別于宰后第0、2、4、6、8天定期取樣進行分析。

1.3.2 感官評價

對冷藏期間大鯢肉品質(zhì)進行感官評價,審評小組人員的招募、篩選、培訓參考GB/T 16291.2—2010《感官分析 選拔、培訓和管理評價員一般導則》,由10名食品科學專業(yè)碩士研究生(5男,5女)組成,評分前進行感官評價、肉品質(zhì)評價能力等培訓,在食品感官評價實驗室內(nèi)[室溫(25±1) ℃]參考GB/T 37062—2018 《水產(chǎn)品感官評價指南》進行感官評價,每個評價項目采用10分制,總分50分。參考WANG等[14]方法,制定感官評分標準見表1。

表1 感官評價標準Table 1 Sensory evaluation criteria

1.3.3 TVB-N的測定

按照GB 5009.228—2016 《食品安全國家標準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》半微量定氮法測定TVB-N。

1.3.4 大鯢肉貯藏過程中揮發(fā)性氣味成分分析

1.3.4.1 樣品處理

定時取出不同貯藏時間的大鯢肉樣品,精密稱取5.0 g,放入20.0 mL頂空進樣瓶中,每個肉樣平行測定3次。

1.3.4.2 GC-IMS分析

采用GC-IMS對不同貯藏時間大鯢肉樣品揮發(fā)性有機物進行分析。分別取貯藏過程中大鯢肉樣品由儀器軟件獲得揮發(fā)性有機物差異譜圖;再通過儀器自帶的NIST和IMS數(shù)據(jù)庫進行揮發(fā)性成分定性分析,詳細參數(shù)如下:

自動頂空進樣單元參數(shù)[7]:孵育溫度60 ℃,孵育時間10 min;轉(zhuǎn)速500 r/min,進樣針溫度85 ℃,進樣體積500 μL。

GC-IMS參數(shù):色譜柱類型為MXT-5,15 mL,0.53 mm ID,1 μm FT,柱溫60 ℃,載氣/漂移氣為高純N2(純度≥ 99.999%),IMS溫度為45 ℃,分析時間為20 min。E1：150 mL/min;E2：0～2 min(2 mL/min),2～20 min(100 mL/min)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用氣味儀Laboratory Analytical Viewer(LAV)和Reporter、Gallery Plot插件分析數(shù)據(jù),由內(nèi)置GC×IMS Library Search NIST和IMS數(shù)據(jù)庫對樣品氣味成分定性。用Excel處理實驗數(shù)據(jù),使用SPSS軟件進行顯著性分析,多重比較采用Duncan法(P<0.05),采用Origin 2021進行繪圖。SIMCA-P14.1軟件進行PCA和OPLS-DA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鯢肉冷藏過程中感官品質(zhì)及TVB-N的變化

感官評價主要通過人的視、觸、味、嗅覺等來感知水產(chǎn)品感官質(zhì)量的常用方法[15]。圖1為不同冷藏時間的大鯢肉的感官評價得分圖,隨著冷藏時間的延長,各感官特性評分均呈下降趨勢。第0天及第2天的感官評分相對較高,第4天顯著下降(P<0.05),具體表現(xiàn)為大鯢肉色澤不均勻,由白色變?yōu)槲⒓t色,光澤度下降、外表濕潤,不粘手,切面微濕潤,肉質(zhì)略疏松、彈性變差。冷藏第6天感官評分低,肉發(fā)黏并伴有少量汁液流失,已處于腐敗狀態(tài)。這可能是在貯藏前期,溫度較低,微生物繁殖速度較慢,隨著時間延長,優(yōu)勢菌種大量繁殖,導致大鯢肉品質(zhì)下降;同時,水產(chǎn)品在貯藏過程中蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)易被分解為氨、三甲胺等產(chǎn)物,從而產(chǎn)生水產(chǎn)品腐敗特征臭味,導致后期感官評定分值快速降低[16]。

TVB-N也是衡量肉制品和水產(chǎn)品新鮮度的重要理化指標,可表征肉品在微生物和內(nèi)源性酶的作用下,分解蛋白質(zhì)和非蛋白產(chǎn)生腐敗性物質(zhì)概況[17]。由圖1可知,大鯢肉的TVB-N含量隨著冷藏時間延長呈上升趨勢,其增長趨勢呈“J”型。根據(jù)GB 2733—2015《食品安全國家標準 鮮、凍動物性水產(chǎn)品》規(guī)定,TVB-N值<20 mg/100g為新鮮肉。冷藏第0天、第2天、第4天的TVB-N值從初始的6.6 mg/100g增加到11.47 mg/100g,可界定為新鮮大鯢肉。TVB-N值在第4天顯著上升(P<0.05),第6天TVB-N值達到28.13 mg/100g,此時,大鯢肉的TVB-N值進入快速增加階段。第8天大鯢肉TVB-N含量幾乎是第0天的8倍。在冷藏過程中大鯢肉TVB-N含量不斷增加是由于附著在肉表面的腐敗微生物不斷繁殖產(chǎn)生的脫羧酶、脫氨酶等酶類以及內(nèi)源性蛋白酶分解的肽類、氨基酸類等發(fā)生脫羧脫氨反應(yīng)生成氨和胺類等物質(zhì)[18]。

綜合分析,大鯢肉冷藏第6天感官評分降幅達50%以上,感官品質(zhì)迅速劣變,且TVB-N值超出國標限量,故大鯢肉在4 ℃冷藏條件下第0天、第2天和第4天相對新鮮,第6天和第8天不新鮮。該結(jié)果與趙萍等[19]研究大鯢肉冷藏期間感官評分、菌落總數(shù)和TVB-N值的結(jié)果基本一致。

圖1 不同冷藏時間大鯢肉的感官評價及揮發(fā)性鹽基氮含量Fig.1 Sensory evaluation and TVB-N of giant salamander meat at different cold storage time注:柱和折線圖上方不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 大鯢肉冷藏過程中GC-IMS氣味成分譜圖分析

利用GC-IMS技術(shù)對冷藏大鯢肉的揮發(fā)性成分進行分析與鑒定。圖2-a中,橫坐標為離子遷移時間,縱坐標為保留時間。橫坐標1.0處紅色豎線為反應(yīng)離子峰,反應(yīng)離子峰的兩側(cè)的每1個點都代表著一種揮發(fā)性氣味物質(zhì),信號峰顏色越深,濃度越大[9]。圖2-b是對圖2-a的差異化分析,以未經(jīng)冷藏處理的大鯢肉樣品為參照,紅色代表該物質(zhì)濃度高于參照樣品,藍色則代表低于參照樣品[20]。由圖2-b可看出,不同冷藏時間大鯢肉揮發(fā)性成分的差異主要體現(xiàn)在信號峰的數(shù)量、濃度和時間上。隨著冷藏時間的延長,微生物滋生,肉質(zhì)分解,導致肉質(zhì)的腐敗變質(zhì),主要揮發(fā)性成分具有一定程度的不同[19]。

a-俯視圖;b-對比圖圖2 不同冷藏時間大鯢肉GC-IMS二維譜圖Fig.2 Two dimensional GC-IMS spectra of giant salamander meat at different cold storage time

2.3 不同冷藏時間大鯢肉揮發(fā)性成分指紋圖譜

為闡述不同冷藏時間大鯢肉揮發(fā)性氣味物質(zhì)的差異性,運用Gallery Plot將不同冷藏時間大鯢肉平行3次測試的GC-IMS圖譜中所有揮發(fā)性有機物的信號值生成指紋圖譜。由圖3可知,大鯢肉在冷藏期間揮發(fā)性氣味物質(zhì)的變化波動較大。冷藏第0天和第2天大鯢肉中的揮發(fā)性氣味物質(zhì)水平相對較低,以少量的醛和酸類為主,如乙酸、丙酸、正己醛、庚醛、正辛醛等,隨著冷藏時間的延長,含量逐漸減少。第4天開始,揮發(fā)性化合物開始大量增加,大部分醇、醛類物質(zhì)相對含量在第4天和第6天達到最高,如苯甲醛、2-甲基丁醛、異戊醛、異戊醇、乙醇、丙醇等,二烯丙基硫醚、烯丙基甲基硫醚、3-甲硫基丙醛等相對含量也在第4天和第6天達到極大。冷藏第8天,酯類物質(zhì)含量大量增加,如丁酸乙酯、丙酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、己酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丙酸甲酯、甲酸庚酯、2-甲基丁酸丙酯、乙酸己酯等。

圖3 不同冷藏時間大鯢肉揮發(fā)性成分Gallery指紋譜圖Fig.3 Gallery fingerprint of volatile organic compounds of giant salamander meat at different cold storage time

2.4 不同冷藏時間大鯢肉GC-IMS揮發(fā)性氣味成分定性分析

為進一步分析冷藏過程中大鯢肉揮發(fā)性氣味物質(zhì)的變化,根據(jù)離子遷移時間、保留時間、保留指數(shù)等,應(yīng)用GC×IMS Library Search中內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫對揮發(fā)性氣味物質(zhì)進行定性分析。從不同冷藏時間的大鯢肉中鑒定出46種物質(zhì),如表2所示,包括13種酯類、12種醛類、10種酮類、6種醇類、3種醚類、2種酸類化合物。

表2 不同冷藏時間大鯢肉揮發(fā)性成分Table 2 Volatile compounds in giant salamander meat at different cold storage time

續(xù)表2

大鯢肉冷藏過程中各類揮發(fā)性化合物所占比例見圖4,冷藏第0天大鯢肉中揮發(fā)性氣味物質(zhì)主要為醛類(37.65%)、酯類(24.19%)、酸類(14.90%)和酮類(11.75%)。冷藏第2天酯類、醛類和酮類物質(zhì)相對含量仍占主要地位。在第4天,除酸類外,其他類物質(zhì)相對含量占比均高于10%。冷藏第6、8天,酯類、酮類、醇類物質(zhì)相對含量較高,其中酯類最高,達69.69%。冷藏初期,大鯢肉表面微生物含量少,體內(nèi)生化反應(yīng)緩慢,蛋白質(zhì)降解和脂肪氧化速率低,大鯢肉的揮發(fā)性氣味變化程度低。隨著冷藏時間的延長,微生物含量增多,蛋白質(zhì)降解和脂肪氧化速率劇增,導致酯類、酮類、醇類、醚類等揮發(fā)氣味物質(zhì)增多,最終產(chǎn)生不良風味。

圖4 不同冷藏時間大鯢肉中各類揮發(fā)性化合物相對含量變化Fig.4 Changes of relative contents of volatile components in meat of giant salamander at different cold storage time

酯類化合物主要來源于肉中游離脂肪酸和醇的酯化反應(yīng)[21],酯類物質(zhì)相對含量隨著冷藏時間的延長而增加,這與李婷婷等[22]研究三文魚冷藏后期酯類物質(zhì)含量增加結(jié)果一致。大鯢肉冷藏期間,酯類含量由第0 d的24.19%增加至第8天的69.69%,從第6天開始顯著增加,其中2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯二聚體、異丁酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸乙酯等占較高比例。2-甲基丁酸乙酯、異丁酸乙酯和丁酸乙酯單體閾值低,相對含量較高,對大鯢肉氣味有貢獻作用。乙酸乙酯具有果香、酒香,其相對含量隨著冷藏時間的延長呈上升趨勢,并在第4天、第6天和第8天占最大比重。楊蕭吟等[23]研究表明乙酸乙酯是假單胞菌引發(fā)托盤包裝肉腐敗氣味的關(guān)鍵揮發(fā)性有機物,游離脂肪酸和脂肪氧化的相互作用可能會導致其含量增加,進一步引發(fā)肉品腐敗。2-甲基丁酸乙酯具有強烈的蘋果味和菠蘿味,其相對含量在冷藏第0天和第2天保持穩(wěn)定,第4天降低,第4天后隨著冷藏時間的延長而上升。丙酸乙酯有強烈的菠蘿香味,冷藏期間含量不斷增多。異丁酸乙酯具有果香,閾值低,冷藏第0天,含量較低,其相對含量在冷藏第6天和第8天突然增多,對大鯢肉氣味具有一定的輔助作用。本實驗中,檢測到的乙酯類物質(zhì)主要有乙酸乙酯、正己酸乙酯單體和二聚體、2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯單體以及二聚體、異丁酸乙酯、丙酸乙酯等。除丁酸乙酯單體以及二聚體外,其他乙酯類化合物相對含量均隨著冷藏時間的延長呈增加趨勢。有研究報道發(fā)酵酸肉中酯類物質(zhì)主要以乙酯類為主,且乙酯類物質(zhì)的形成主要與發(fā)酵相關(guān)[24]。酯類物質(zhì)的增加可能是水產(chǎn)品內(nèi)源酶和微生物代謝所致[25],增加的酯類可能是大鯢肉冷藏后期異味的來源之一。

醛類是氨基酸斯特勒克爾降解或脂質(zhì)氧化的主要產(chǎn)物,氣味閾值普遍較低,被認為是水產(chǎn)品中重要的氣味成分[25]。醛類物質(zhì)相對含量隨冷藏時間的延長總體呈下降趨勢,庚醛單體及二聚體、正辛醛、正己醛、異戊醛單體及二聚體在第4天前后變化較明顯。庚醛和正己醛具有青草味、酸敗味和魚腥味,閾值低,對大鯢肉特征氣味起著重要作用。其相對含量在冷藏期間保持減少趨勢,這是由脂肪氧化程度的加深,油酸、亞油酸和花生四烯酸氧化加劇而導致[25]。正辛醛能賦予肉品油脂氣味,冷藏過程中相對含量逐漸降低;異戊醛稀釋后有果香味,異戊醛二聚體相對含量在冷藏第2天增加至6.01%后,逐漸減少。醛類物質(zhì)不穩(wěn)定,很容易與其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生不同氣味的化合物[12]。隨著庚醛、正辛醛等醛類物質(zhì)含量的降低,大鯢肉中酯香和腥味降低,刺激性氣味增加,新鮮度下降。

酮類物質(zhì)主要來自脂肪酸的自動氧化和氨基酸降解。酮類物質(zhì)相對含量在冷藏第4天達到22.71%后逐漸減少。冷藏期間,丙酮相對含量從6.17%增至10.46%后降至3.06%,波動幅度較大。2-丁酮有肉的氣息,閾值高,對大鯢肉氣味特征貢獻較小,冷藏第0天和第2天相對含量較低,冷藏第4天、第6天和第8天含量增多。2-庚酮單體相對含量先增加后降低,2-庚酮二聚體含量總體上呈增加趨勢。有研究表明2-酮類物質(zhì)對肉類的風味有重要貢獻[26]。2-丁酮是真空包裝牛肉腐敗進程中的典型揮發(fā)性化合物,也被作為鰱魚貯藏過程中的腐敗標志物[27]。2-庚酮與煙熏鮭魚貯藏過程中產(chǎn)生的酸臭味密切相關(guān)[28]。

醇類物質(zhì)主要來源于氨基酸代謝和不飽和脂肪的氧化[10],閾值相對較高,對大鯢肉整體風味貢獻較小。冷藏過程中含量處于不斷上升狀態(tài),但在第8天稍有降低。乙醇具有刺激性辛辣味,相對含量呈增加趨勢,第4天增加至4.13%。這與高氧氣調(diào)包裝豬肉貯藏第10～14天,乙醇含量隨著腐敗加速而快速上升結(jié)果類似[29]。丙醇相對含量不斷增加并在第6天達到最高。1-戊烯-3-醇有蘑菇味和青草味,閾值較高,作為脂質(zhì)的次級氧化產(chǎn)物與水產(chǎn)品風味聯(lián)系緊密[25],冷藏過程中相對含量波動較小,對冷藏期間大鯢肉整體氣味影響不大。含硫化合物主要是通過氨基酸為前體的酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化得來[23],也可通過微生物降解含硫氨基酸獲得。二甲基三硫醚和二烯丙基硫醚有大蒜味,冷藏期間相對含量波動較小。有研究表明,牛肉和雞肉中貯藏過程中,腐敗菌可引發(fā)二甲基三硫醚含量的增加[23]。烯丙基甲基硫醚有惡臭,冷藏第0天相對含量為7.24%,第2天為4.13%,第4天增加至9.83%,第8天降低至0.23%,其變化原因有待于進一步研究。酸類物質(zhì)是由脂肪氧化或脂肪水解過程中低級脂肪酸產(chǎn)生的[11],大鯢肉冷藏過程中鑒定出酸類化合物包括乙酸和丙酸,其相對含量隨著冷藏時間的延長而減少?？赡苁撬犷愇镔|(zhì)在一定條件下形成烴類物質(zhì)[29]導致酸類物質(zhì)含量降低。乙酸有刺激性酸臭,對大鯢肉整體的氣味有輔助作用,對水產(chǎn)品風味變酸有重要貢獻[25]。

2.5 不同冷藏時間大鯢肉揮發(fā)性氣味物質(zhì)差異分析

2.5.1 PCA結(jié)果

將冷藏期間大鯢肉的揮發(fā)性氣味物質(zhì)相對含量進行PCA,提取到2個主成分,PC1和PC2累計貢獻率可達78.32%。由圖5可以看出,同一冷藏時間大鯢肉揮發(fā)性氣味物質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)各點相對集中于一處,4 ℃冷藏第0天和第2天,樣品分布在PC1的負方向和PC2的正方向,兩者相距較近;第4天樣品分布在PC1負方向,并逐漸向PC2的負方向移動;第6天樣品處于PC1的正方向和PC2的負方向,第8天樣品完全在右側(cè)上半部分。說明在冷藏過程中樣品的揮發(fā)性氣味物質(zhì)發(fā)生了較大的變化。在95%置信區(qū)間內(nèi),相同冷藏時間的樣品重復(fù)性較好,不同冷藏時間樣品差異較大,具有較明顯的聚類趨勢。PCA是一種無監(jiān)督的統(tǒng)計分析技術(shù)[26],能夠反映出不同冷藏時間的大鯢肉揮發(fā)性氣味物質(zhì)的差異,但忽視了數(shù)據(jù)的變化與整體特征,不易于發(fā)現(xiàn)不同樣品間的差異物,不能直接區(qū)分不同冷藏時間大鯢肉揮發(fā)性氣味特征。因此,可采用有監(jiān)督的OPLS-DA模型,進一步篩選樣品間的差異物。

圖5 不同冷藏時間大鯢肉揮發(fā)性氣味物質(zhì)變化PCA得分圖Fig.5 PCA score graph of meat volatile matter of giant salamander under different cold storage time

2.5.2 OPLS-DA及模型評價

OPLS-DA是一種能夠建立物質(zhì)表達量與樣品類別間關(guān)系模型的有效判別分析統(tǒng)計方法[29]。R2X和R2Y分別表示所建模型對X和Y矩陣的解釋率,Q2表示模型的預(yù)測能力,R2和Q2越接近1說明模型越好。R2和Q2應(yīng)高于0.5,且兩者差值不應(yīng)過大[30]。模型中R2X=0.993,R2Y=0.981,Q2=0.932,表明該模型可以描述大部分的數(shù)據(jù)。由圖6-a可知,除第0天和第2天大鯢肉樣品聚集于一處外,其他不同冷藏時間的大鯢肉樣品在OPLS-DA得分散點圖上聚類良好,分類效果優(yōu)于PCA,說明OPLS-DA模型可進一步排除不相關(guān)差異,實現(xiàn)不同組間樣品更好分離。

為避免過擬合現(xiàn)象,利用置換檢驗對OPLS-DA所做模型的可靠性進行驗證。置換檢驗結(jié)果如圖6-b所示,經(jīng)200次交叉驗證后,模型Q回歸線與橫坐標交叉,且截距是負數(shù),所有置換檢驗的R2和Q2均低于原始值。說明模型不存在過擬合現(xiàn)象[30]。同時交叉驗證分析結(jié)果中顯著性概率值P=1.41×10-5<0.5,因此,本研究建立的OPLS-DA模型穩(wěn)定可靠,具有統(tǒng)計學意義。

a-得分圖;b-置換檢驗圖圖6 不同冷藏時間大鯢肉OPLS-DAFig.6 OPLS-DA of meat of giant salamander at different cold storage time

2.5.3 篩選潛在特征化合物

變異權(quán)重投影(variable importance in projection,VIP)是OPLS-DA模型中用于衡量各個變量對分類貢獻強度的指標之一,VIP越大,貢獻率也越大。通常將VIP >1作為篩選條件,得到的揮發(fā)性成分可作為潛在特征標志物[30]。為進一步篩選對揮發(fā)性氣味起著貢獻作用的變量,得到OPLS-DA模型的VIP分布圖,見圖7-a。VIP>1的化合物有15種,包括5種酯類、3種醇類、3種醛類、2種酮類、1種酸類和1種硫醚化合物。由圖7-b可知,2-甲基丁酸乙酯、異丁酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸乙酯、2-丁酮、乙醇、苯乙醛單體、丙醇隨著冷藏時間的延長相對含量總體呈上升趨勢,可聚為一類;丁酸乙酯二聚體、正己醛、丙酸呈下降趨勢,可聚為一類;異戊醛單體、丙酮、異戊醇單體、烯丙基甲基硫醚等相對含量在第2天和第4天達到最大后逐漸降低,可聚為一類。冷藏第0天和第2天可聚為一類、第4天聚為一類,第6天和第8天聚為一類。

a-VIP值分布;b-聚類熱圖圖7 大鯢肉冷藏過程中特征揮發(fā)性成分Fig.7 Volatile compounds in giant salamander meat during cold storage

2.5.4 相關(guān)性分析

對感官評分、TVB-N值和VIP >1的化合物相對含量進行Pearson相關(guān)性分析。Pearson相關(guān)性系數(shù)越大,相關(guān)性越強。由圖8可知,感官評分和TVB-N值呈顯著的負相關(guān)(r=-0.97,P<0.05)。感官評分與2-甲基丁酸乙酯(r=-0.90,P<0.05)、異丁酸乙酯(r=-0.94,P<0.05)、丙酸乙酯(r=-0.97,P<0.05)呈顯著的負相關(guān)。TVB-N值與2-甲基丁酸乙酯(r=0.98,P<0.05),異丁酸乙酯(r=0.99,P<0.05),丙酸乙酯(r=0.99,P<0.05)呈顯著的正相關(guān)。且2-甲基丁酸乙酯、異丁酸乙酯、丙酸乙酯三者相互間呈極顯著的正相關(guān)(P<0.01)。可將2-甲基丁酸乙酯、異丁酸乙酯、丙酸乙酯作為大鯢肉4 ℃冷藏條件下的腐敗變質(zhì)潛在特征化合物。

圖8 感官評分、TVB-N值和揮發(fā)性成分相關(guān)性分析Fig.8 Correlation analysis of sensory score,TVB-N value and volatile components

3 結(jié)論

通過對4 ℃冷藏過程中大鯢肉的感官品質(zhì)、TVB-N值及揮發(fā)性氣味物質(zhì)進行了初步分析,主要結(jié)論如下:隨著冷藏時間的延長,感官品質(zhì)降低,從第6天始感官上不可接受;TVB-N值呈增加趨勢,在第6天判定為不新鮮。通過GC-IMS技術(shù)從不同冷藏時間大鯢肉中鑒定出46種揮發(fā)性化合物,包括13種酯類、12種醛類、10種酮類、6種醇類、3種醚類和2種酸類。隨著冷藏時間的延長,大鯢肉酯類物質(zhì)含量增加,醛類和酸類物質(zhì)的含量呈下降趨勢。PCA結(jié)果表明,前2個主成分累計貢獻率達到78.32%。依據(jù)VIP>1篩選得到15種潛在的氣味標記物,其中2-甲基丁酸乙酯、異丁酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸乙酯、2-丁酮、乙醇、苯乙醛單體、丙醇隨著冷藏時間的延長相對含量總體呈上升趨勢;丁酸乙酯二聚體、正己醛、丙酸相對含量呈下降趨勢;異戊醛單體、丙酮、異戊醇單體、烯丙基甲基硫醚等相對含量在第2、4天達到最大后逐漸降低。相關(guān)性分析表明,異丁酸乙酯、丙酸乙酯和2-甲基丁酸乙酯可能為大鯢肉腐敗變質(zhì)潛在氣味標記物。該研究可為今后大鯢肉冷藏期間新鮮度評價及品質(zhì)控制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。