浙江省地方菜豆種質(zhì)資源鑒定與遺傳多樣性分析

汪寶根，董君暘，汪 穎，李素娟，王 尖，魯忠富，吳曉花，李國景，吳新義，，*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方豆類蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種重點實驗室(部省共建)，浙江 杭州 310021； 2.浙江農(nóng)林大學(xué) 園藝科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300； 3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點實驗室，浙江 杭州 310021)

菜豆(PhaseolusvulgarisL.)(2n=2x=22)隸屬豆科(Fabaceae)菜豆族(Trib.PhasoleaeDC.)菜豆屬(PhaseolusL.)，是世界范圍內(nèi)最重要的豆類作物之一。野生菜豆起源于美洲，經(jīng)長期馴化和地理隔離后，形成了安第斯和中美洲2個多樣性中心。栽培菜豆主要包括2種類型，即以干籽粒做糧食或飼料的糧用型菜豆(dry bean)和以嫩莢做菜用的菜用型菜豆(snap bean)。菜豆約在15世紀傳入我國，別名四季豆、刀豆、春分豆、梅豆、蕓豆、玉豆等，既是我國重要的食用豆類，也是我國廣泛栽培的重要豆類蔬菜[1]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織2020年統(tǒng)計，我國糧用型菜豆的種植面積約為74.21萬hm2，產(chǎn)量約占全球糧用型菜豆總產(chǎn)量的五分之一；菜用型菜豆的種植面積約為66.61萬hm2，產(chǎn)量位居全球第一。

我國菜豆種質(zhì)資源豐富，國家種質(zhì)資源庫目前收集保存菜豆資源超過4 900份，大部分為地方品種[2]。這些資源中僅有部分材料調(diào)查了基本農(nóng)藝性狀，對其遺傳多樣性、親緣關(guān)系研究較少。張赤紅等[1]利用36對SSR引物對332份國內(nèi)普通菜豆、16份國外普通菜豆和29份野生菜豆的遺傳多樣性進行了分析，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)普通菜豆的遺傳多樣性大于國外普通菜豆和野生菜豆，其中貴州、云南、黑龍江等省普通菜豆的遺傳多樣性較為豐富；Zhang等[2]使用30個SSR標(biāo)記研究了229份中國菜豆地方品種的遺傳多樣性，并將之分為安第斯基因池和中美洲基因池兩大類，每一類又含有2個亞類；Wu等[3]對683份菜豆種質(zhì)進行全基因組重測序，構(gòu)建了包含480萬個SNP的高密度、高精度的單倍型圖譜，主成分分析和系統(tǒng)進化樹分析均支持將該群體分為安第斯基因池和中美洲基因池兩大類，進一步可以將之分為5個亞群；彭麗娟等[4]利用7對SSR和13對ISSR標(biāo)記分析了70份菜豆品種的遺傳多樣性，系統(tǒng)進化樹分析將之分為4個類群7個亞類。

開展地方種質(zhì)資源精準(zhǔn)鑒定與遺傳多樣性分析有利于梳理現(xiàn)有育種資源，挖掘優(yōu)異種質(zhì)，為適合區(qū)域性消費需求的品種選育提供第一手資料。菜豆為自花授粉二倍體，基因組大小約600 Mb[5]。隨著菜豆基因組的釋放和基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展，單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(single nucleotide polymorphism，SNP)由于其數(shù)量多、多態(tài)性豐富逐步成為菜豆遺傳研究的主流標(biāo)記，如Song等[6]對17份菜豆種質(zhì)測序后鑒定出992 682個SNP，據(jù)此開發(fā)了含5 398個SNP的高質(zhì)量芯片BARCBean6K_3 BeadChip；Wu等[3]通過對683份菜豆種質(zhì)重測序，鑒定出4 811 097個高質(zhì)量SNP，盡管這些海量SNP信息為菜豆遺傳和育種研究提供了強有力的工具，但在使用SNP標(biāo)記進行基因型鑒定時，由于芯片造價較高、錨定的SNP無法靈活替換，而重測序技術(shù)不僅費用高，在不同材料間對SNP鑒定的重復(fù)性也較差，因而在普通育種單位中應(yīng)用受限。競爭性等位變異特異性PCR(kompetitive allele specific PCR，KASP)技術(shù)由于在SNP數(shù)目和群體大小上可靈活選擇的優(yōu)勢，逐步成為利用SNP標(biāo)記開展個性化研究的理想方法，如Hurtado-Gonzales等[7]將BARCBean6K_3 BeadChip芯片上的SNP轉(zhuǎn)化為KASP標(biāo)記用于菜豆抗銹病基因的精細定位。此外，KASP標(biāo)記在豇豆、瓠瓜等作物上也已經(jīng)廣泛用于遺傳多樣性分析[8-9]。

菜豆是浙江省優(yōu)勢特色蔬菜，在臨安、磐安等地已經(jīng)形成規(guī)?；N植基地，是夏季高山蔬菜的主導(dǎo)產(chǎn)品。浙江省地理形態(tài)豐富，自然條件優(yōu)越，有利于生物多樣性的形成和保護。目前在浙江省搜集發(fā)現(xiàn)的菜豆地方品種有44份，但這些資源尚未進行系統(tǒng)的鑒定與遺傳多樣性分析。因此，本研究擬對已經(jīng)收集到的菜豆種質(zhì)進行詳細的表型精準(zhǔn)鑒定，并開發(fā)KASP標(biāo)記鑒定其基因型，評價群體遺傳多樣性，為地方特色種質(zhì)的鑒定和有效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料含有44份浙江菜豆地方種質(zhì)，其中28份為“第三次全國農(nóng)作物種質(zhì)資源普查與收集行動”所收集，其余16份為本課題組歷年來搜集得到，具體編號、名稱和基本信息見表1。

1.2 農(nóng)藝性狀調(diào)查

試驗于2018—2019年連續(xù)2 a在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院海寧楊渡科研創(chuàng)新基地進行，采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，2次重復(fù)，每個材料每個重復(fù)種植2列，搭人字架引導(dǎo)植株攀爬，畦寬連溝1.5 m，株距40 cm，行距75 cm，每份材料種植20穴，田間肥水管理和生產(chǎn)上保持一致。

參照《菜豆種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[10]，每份材料隨機選取10株進行農(nóng)藝性狀調(diào)查，對株型、小葉葉型、葉色、始花節(jié)位、嫩莢長、嫩莢寬、莢型、嫩莢橫切面、嫩莢主色、單莢重、種子形狀、種皮色、千粒重共13個重要性狀進行調(diào)查。取2次重復(fù)的平均值作為年度鑒定結(jié)果，把2年鑒定結(jié)果的平均值作為最終鑒定結(jié)果。調(diào)查嫩莢性狀時每份材料至少取10個處于商品成熟期的鮮莢，利用尺子精確測量莢長、莢寬，稱重后計算單莢重。分別對幼苗、花、商品嫩莢、葉片、植株莖節(jié)、種子等進行拍照。

1.3 KASP標(biāo)記開發(fā)

根據(jù)Song等[6]報道的BARCBean6K_3 BeadChip芯片，按照SNP在基因組上的位置均勻選擇185個SNP轉(zhuǎn)化為KASP標(biāo)記。KASP引物設(shè)計采用LGC公司的KrakenTM軟件，根據(jù)目的SNP位點上下游DNA序列，每個位點設(shè)計3條引物，包括一條反向通用引物和2條正向特異引物，2條正向特異引物分別添加FAM和HEX熒光序列標(biāo)簽。

1.4 DNA提取和基因型檢測

采用CTAB法提取種質(zhì)的基因組DNA，稀釋至10 ng·μL-1后利用浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院公共實驗室的IntelliQube高通量基因分型檢測平臺進行SNP基因型檢測，單點反應(yīng)體積為1.6 μL，其中，樣品DNA 0.8 μL，2×Master mix和Primer mix混合后的體積為0.8 μL。PCR擴增程序為95 ℃ 15 min；94 ℃ 20 s，61～55 ℃ 60 s(Touch-Down PCR，0.6 ℃每個循環(huán))，10個循環(huán)；94 ℃ 20 s，55 ℃ 60 s，26個循環(huán)。試驗結(jié)果采用IntelliQube平臺自帶軟件分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Excel 2010軟件，群體遺傳多樣性分析采用Tassel 5.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 浙江地方菜豆種質(zhì)分布

從44份種質(zhì)的搜集地點分布情況來看，全省11個地級市中，除舟山外，其余10個地級市均收集到菜豆地方品種(圖1)，其中，杭州市收集到18份地方品種，數(shù)量位居全省首位，麗水和衢州也是收集到地方品種較多的地級市，分別收集到8份和6份，湖州、嘉興和寧波均只收集到1份材料。從材料發(fā)現(xiàn)的地理環(huán)境來看，大部分材料位于山區(qū)，海拔較高，人口密度較小。這些材料均為農(nóng)民自己留種繁殖，無野生型材料，而且均為菜用型菜豆。

圖1 浙江省地方菜豆種質(zhì)分布Fig.1 Distribution of common bean germplasm in Zhejiang Province

2.2 浙江省地方菜豆種質(zhì)形態(tài)多樣性

通過對44份菜豆種質(zhì)連續(xù)2 a的觀察，發(fā)現(xiàn)這些種質(zhì)在形態(tài)特征上變異豐富(圖2)。44份種質(zhì)中有2份材料為矮生類型，其他材料均為蔓生類型，說明浙江省菜豆種質(zhì)以蔓生類型為主；在小葉葉形上，18份種質(zhì)的葉形為近菱形(占比40.9%)，26份種質(zhì)的葉形為近圓形(占比59.1%)；葉色呈現(xiàn)出淺綠色、綠色和深綠色，分別包含12、23和9份種質(zhì)；嫩莢莢型以長扁條為主，有31份種質(zhì)(占比70.5%)，此外短扁條莢型的有2份，短圓棍型1份(花籽紅花青莢)，彎扁條型有3份，彎圓棍型4份，長圓棍型3份；嫩莢橫切面呈現(xiàn)出“∞”字形、近圓形、桃形和長梨形，分別含有1、4、30、9份種質(zhì)；嫩莢以綠色為主，含有24份種質(zhì)(占比54.5%)，黃綠色有1份，淺綠色有15份，綠白色有3份，紫紅色有1份；種子形狀以腎形和卵圓形為主，分別含有22份(占比50%)和20份(占比45.5%)，還有2份為圓形；種皮色變異豐富，其中3份為白色，5份為茶褐色，6份為褐色，7份為黑色，2份為紅褐色，1份黃色，2份黃綠色，3份乳白色，15份為雙色。

2.3 主要農(nóng)藝性狀

除形態(tài)學(xué)特征外，本研究還調(diào)查了始花節(jié)位等5個重要農(nóng)藝性狀，發(fā)現(xiàn)44份種質(zhì)在這些性狀上呈現(xiàn)較大的多樣性(表2)。從次數(shù)分布情況上看，這些性狀在群體上分布均接近正態(tài)分布(圖3)。44份種質(zhì)的始花節(jié)位變異幅度為2.3～7.2，平均始花節(jié)位為3.9，其中，始花節(jié)位小于4的有31份種質(zhì)(占比70.5%)，始花節(jié)位大于5的有9份種質(zhì)(占比20.5%)，說明大部分種質(zhì)開花節(jié)位較低，結(jié)莢較早。嫩莢長為11.8～21.3 cm，平均莢長為16.1 cm，有16份種質(zhì)的莢長小于15 cm，3份種質(zhì)的莢長超過20 cm，說明地方品種的豆莢普遍較短；嫩莢寬為0.7～1.7 cm，平均嫩莢寬為1.1 cm，有19份種質(zhì)的莢寬小于1.1 cm；單莢重為6.0～16.6 g，平均單莢重為11 g，有22份種質(zhì)(占比50%)的單莢重小于平均值，3份種質(zhì)的單莢重超過15 g，說明地方品種的單莢重均較小；千粒重為144.56～528 g，平均值為271.6 g，千粒重小于250 g的種質(zhì)有15份，大于400 g的種質(zhì)有2份。綜合44份種質(zhì)的形態(tài)學(xué)和主要農(nóng)藝性狀發(fā)現(xiàn)，無法根據(jù)表型直接區(qū)分這些資源，需要進一步根據(jù)基因型研究其遺傳多樣性和親緣關(guān)系。

表2 四十四份種質(zhì)在5個農(nóng)藝性狀上的表現(xiàn)

圖3 五個主要農(nóng)藝性狀在44份種質(zhì)中的分布頻率Fig.3 Distribution frequencies of five traits of 44 common bean accessions

2.4 KASP標(biāo)記開發(fā)

為了分析44份材料的親緣關(guān)系，本研究從已經(jīng)發(fā)表的BARCBean6K_3 BeadChip芯片[6]上按照SNP在基因組上的位置均勻選擇185個SNP轉(zhuǎn)化為KASP標(biāo)記，經(jīng)在44份種質(zhì)中擴增后發(fā)現(xiàn)，有97對KASP標(biāo)記擴增失敗或在44份種質(zhì)中無多態(tài)，有88對KASP標(biāo)記在44份種質(zhì)中擴增出2種等位變異信號(圖4，表3)。這88對標(biāo)記分布在11條染色體上，其中5號染色體上的標(biāo)記數(shù)量最少，只有4個，8號染色體上的標(biāo)記數(shù)量最多，達到12個(表4)。88個標(biāo)記中有45個標(biāo)記在所有種質(zhì)中得到成功擴增，其余43個標(biāo)記在群體中的缺失率最小為0.02，最大為0.30，各標(biāo)記在群體中的多態(tài)性信息量值(PIC)變異幅度為0.044～0.726，平均PIC為0.25，最小等位變異頻率(MAF)變異幅度為0.023～0.455，MAF平均值為0.12(表5)。

A，一種基因型；B，兩種基因型。藍色信號代表HEX等位變異，紅色信號代表FAM等位變異。A， Single genotype； B， Two genotypes. Blue signal represented HEX allelic variation， red signal represented FAM allelic variation.圖4 KASP標(biāo)記在44份種質(zhì)中的擴增信號Fig.4 Amplification signals for the KASP markers in 44 accessions

表3 本研究開發(fā)的88對KASP標(biāo)記基本信息

續(xù)表3 Continued Table 3

續(xù)表3 Continued Table 3

續(xù)表3 Continued Table 3

表4 不同染色體上有多態(tài)標(biāo)記的分布情況

表5 八十八個KASP標(biāo)記在44份種質(zhì)中擴增結(jié)果

續(xù)表5 Continued Table 5

2.5 浙江菜豆種質(zhì)遺傳多樣性分析

利用44份種質(zhì)的基因型數(shù)據(jù)進行主成分分析(PCA)，結(jié)果顯示，該群體大致可以分為2個主成分，其中以PC1為主，包含38份種質(zhì)，PC2僅包含6份種質(zhì)(圖5)。系統(tǒng)進化樹分析顯示，44份種質(zhì)大致可以分為2個類群，其中類群Ⅰ含有18份種質(zhì)，類群Ⅱ含有26份種質(zhì)(圖6)。對比2個類群的基本性狀發(fā)現(xiàn)，2份矮生型種質(zhì)均在類群Ⅰ中，在小葉葉形、葉色、莢形上，2個類群間無明顯的分化。在莢形上，2個類群都以長扁條為主，但類群Ⅰ還有其他莢形，變異較為豐富；在嫩莢橫切面上，類群Ⅰ以長梨形和桃形為主，占比38.9%和50%，但類群Ⅱ以桃形為主，占比達到80.8%；在嫩莢主色和種子形狀上，2個類群間亦無明顯差異。在種皮色上，類群Ⅱ以雙色為主，而類群Ⅰ的變異較為豐富，幾乎含有所有類型的種皮顏色；在嫩莢節(jié)位、嫩莢長、嫩莢寬、單莢重上，類群Ⅰ的均值都略大于類群Ⅱ的均值；在千粒重上，2個類群間呈現(xiàn)顯著差異，類群Ⅰ的千粒重較大，平均值為310.4 g，類群Ⅱ的千粒重普遍較小，平均值為244.7 g，因此，44份種質(zhì)的類群分化與千粒重高度相關(guān)。這也與菜豆種質(zhì)可以依據(jù)籽粒大小分為大粒類型(千粒重大于400 g)、中粒類型(千粒重為250～400 g)和小粒類型(千粒重小于250 g)的研究結(jié)果一致[11]。

圖5 四十四份菜豆種質(zhì)的PCA分析結(jié)果Fig.5 PCA analysis result in the 44 common bean accessions

依據(jù)不同種質(zhì)的千粒重，可以將類群Ⅰ進一步細分為3個小類(圖6)，其中類群Ⅰ-Ⅰ包含6份種質(zhì)，千粒重變異幅度為353～528 g，平均千粒重為398.6 g，該類群與PC2中的種質(zhì)完全一致；類群Ⅰ-Ⅱ含有4份種質(zhì)，平均千粒重為349.3 g；類群Ⅰ-Ⅲ含有8份種質(zhì)，平均千粒重為310.4 g，其中一份來自金華的磐安四季豆千粒重較小，只有154 g。類群Ⅱ可以進一步劃分為2個小類，其中類群Ⅱ-Ⅰ含有15份種質(zhì)，平均千粒重為231.8 g；類群Ⅱ-Ⅱ含有11份種質(zhì)，平均千粒重為262.5 g，但其中一份來自杭州的臨安四季豆千粒重較大，達到358 g。

圖6 四十四份菜豆種質(zhì)的系統(tǒng)進化分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis in the 44 common bean accessions

3 討論

本研究使用的44份地方品種均為菜用型菜豆，其中28份種質(zhì)為“第三次全國農(nóng)作物種質(zhì)資源普查與收集行動”所收集，這說明浙江省菜豆種質(zhì)以食莢類型為主。通過對44份種質(zhì)13個基本性狀的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)浙江省菜豆地方品種在生長習(xí)性、發(fā)育特性、嫩莢商品性及產(chǎn)量相關(guān)性狀上均存在豐富的遺傳變異，意味著地方資源中蘊含著優(yōu)異的自然變異，可供育種利用。

依據(jù)種子大小等性狀差異將普通菜豆分為安第斯和中美洲兩大基因池[11]。千粒重超過400 g的大粒品種為安第斯基因池，千粒重小于250 g的小粒品種和千粒重介于250～400 g的中粒品種來源于中美洲基因池。利用種子蛋白、同工酶、形態(tài)學(xué)和DNA標(biāo)記進行種質(zhì)多樣性分析得到的結(jié)果也支持兩大基因池的劃分[12-14]。我國普通菜豆是15世紀直接從美洲引入，可能首先在貴州、云南等省引種馴化，然后向東北傳播，貴州、云南等省可能是普通菜豆的次級起源中心[1]。我國菜豆地方品種既有來自安第斯基因池的，也有來自中美洲基因池的，且安第斯基因池種質(zhì)的遺傳多樣性高于中美洲基因池種質(zhì)[2]。本研究中，44份菜豆種質(zhì)的千粒重最小為144.56 g，最大為528 g，千粒重超過400 g的種質(zhì)僅有2份，分別來自溫州和杭州地區(qū)，說明我省菜豆種質(zhì)主要以小粒和中粒類型的中美洲基因池為主。系統(tǒng)進化樹分析可以將44份種質(zhì)分為2大類，類群Ⅰ的平均千粒重為310.4 g，屬于中粒類型，類群Ⅱ的平均千粒重為244.7 g，屬于小粒類型。根據(jù)千粒重大小又可將類群Ⅰ細化為3個小類，類群Ⅱ細化為2個小類。盡管依據(jù)表型性狀無法準(zhǔn)確區(qū)分不同種質(zhì)資源，但可以根據(jù)基因型了解不同種質(zhì)的親緣關(guān)系，進而結(jié)合其表型性狀為育種中親本選配提供理論依據(jù)。由于我省菜豆種質(zhì)均為菜用型，因此本研究重點關(guān)注了莢部性狀，分析發(fā)現(xiàn)，嫩莢寬、單莢重在兩大類群間無顯著性差異，嫩莢長在兩大類群間雖有顯著性差異，但平均莢長僅相差2.0 cm。因此，對于菜用型菜豆育種，可以適當(dāng)?shù)囊氚驳谒够虺氐膬?yōu)異基因，通過亞種間雜交，選育突破性新品種。

本研究根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的菜豆BARCBean6K_3 BeadChip芯片中SNP序列信息，將185個SNP轉(zhuǎn)化為KASP標(biāo)記，其中88個KASP-SNP標(biāo)記成功的用于44份種質(zhì)的遺傳多樣性分析，其余的97對KASP-SNP標(biāo)記中，4對引物在群體中擴增失敗，可能是該SNP不適合轉(zhuǎn)化成KASP標(biāo)記，93對標(biāo)記在群體中無多態(tài)，可能是群體太小，44份種質(zhì)在該SNP位點上的等位變異一致。本研究是國內(nèi)首次利用KASP標(biāo)記研究菜用型菜豆遺傳多樣性的報道。無論如何，通過將芯片上SNP轉(zhuǎn)化為KASP標(biāo)記，為菜豆遺傳多樣性分析、基因定位和未來的分子育種提供了充足的標(biāo)記資源。本研究通過對浙江地方菜豆種質(zhì)的搜集和鑒定，梳理了浙江省菜豆種質(zhì)基本信息，進一步豐富了我國菜豆表型信息數(shù)據(jù)庫和遺傳多樣性，為地方資源的高效利用和新品種選育提供了科學(xué)依據(jù)。