基于COⅠ和Cytb基因的浙江不同抗性水平二化螟種群的遺傳結(jié)構(gòu)分析

魯艷輝，郭嘉雯，田俊策，薛釗鴻，鄭許松，呂仲賢

(浙江省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室 植物保護與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

二化螟(Chilosuppressalis)屬于鱗翅目(Lepidoptera)草螟科(Crambidae)，它的危害伴隨著水稻整個生育期，且為害癥狀因為害期的不同而不同。初孵的二化螟幼蟲主要取食水稻較嫩的葉鞘組織，造成水稻枯鞘。在水稻分蘗期，二化螟鉆入水稻莖稈中下部為害，造成枯心苗。在水稻的孕穗期和抽穗期為害還會造成水稻白穗和枯孕穗等癥狀，嚴重影響水稻品質(zhì)和產(chǎn)量[1-2]。

線粒體DNA(mitochondria DNA， mtDNA)是一種群體遺傳學研究中常用的分子標記[3]，其具有嚴格的母系遺傳、核苷酸替代率高、進化速度快等特點，并缺少基因重組[3-4]。目前昆蟲線粒體基因中結(jié)構(gòu)與功能研究較為深入的是線粒體細胞色素氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因和細胞色素b(Cytb)基因[5-6]，因此在柑橘木虱(Diaphorinacitri)[7]、緬甸安小葉蟬(Anakaburmensis)[8]、亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)[9]、橡實象蟲(Curculioarakawai)[10]、大螟(Sesamiainferens)[11]、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)[12]等多種昆蟲的遺傳多樣性及種群結(jié)構(gòu)研究中廣為應用。

目前，二化螟的防治仍然主要依賴化學農(nóng)藥，化學農(nóng)藥的不合理使用導致二化螟抗性水平不斷提高，其中浙江省大部分稻區(qū)二化螟對氯蟲苯甲酰胺的抗性已達到高抗水平，對其他藥劑的抗藥性也有所提高[13]。為了明確不同抗性水平二化螟地理種群的遺傳多樣性，本實驗選用線粒體COⅠ和Cytb基因作為分子標記，對浙江省8個不同抗性水平二化螟地理群的遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)進行研究，以期能夠指導抗性二化螟監(jiān)測，為制定合理的二化螟綜合防治策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 二化螟成蟲樣品采集

2018年春季(3—4月份)，通過燈誘的方法分別在浙江省平湖(PH)、蕭山(XiaoS)、象山(XS)、寧海(NH)、永康(YK)、溫嶺(WL)、樂清(YQ)、瑞安(RA)8個不同地區(qū)誘集二化螟成蟲，樣品采集信息見表1。按二化螟的形態(tài)特征鏡檢確認后，每個地理種群隨機選取一定數(shù)量(大約50頭)的二化螟成蟲作為試蟲，提取單頭樣品基因組DNA。其余成蟲用于產(chǎn)卵，孵化出的F1代3齡幼蟲用于抗性水平監(jiān)測。其中幼蟲置于溫度(27±2)℃，相對濕度(70±5)%，光周期16 h/8 h的人工氣候室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)方法采用人工飼料法[14]。

表1 八個不同地理種群二化螟的采集信息

1.2 毒力測定方法

采用稻苗浸漬法測定8個不同地理種群對氯蟲苯甲酰胺、阿維菌素和甲氧蟲酰肼的抗性水平[2]。每種藥劑先用丙酮或者二甲基亞砜配制成1 000 mg·L-1的儲存液，然后用含0.1%的Triton X-100水等比稀釋5個濃度梯度，0.1%的Triton X-100 水作為對照。將分蘗期的水稻剪成5～6 cm 的莖稈，放入預先配置的藥液中浸漬10 s，取出自然陰干。將晾干后的莖稈放入事先準備好的底部鋪有4層保濕濾紙的培養(yǎng)皿中(直徑7 cm)，每個培養(yǎng)皿用毛筆接入10 頭二化螟3 齡幼蟲，每組重復3 次。72 h 后統(tǒng)計幼蟲死亡情況。

1.3 基因組DNA提取

利用動物組織DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取單頭不同地理種群二化螟成蟲基因組DNA，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取基因組DNA的完整性。提取的DNA樣品置于-20 ℃冰箱里保存，以便用于后續(xù)的PCR擴增。

1.4 PCR擴增及測序

以基因組DNA為模板，以COⅠ和Cytb基因的通用引物為引物(表2)，進行PCR擴增。PCR反應總體系為50 μL，包括25 μL 10×PCR buffer Mix(天根生化科技有限公司)，2 μL正向引物，2 μL反向引物，7.0 μL模板DNA，14 μL雙蒸水。PCR擴增條件：94 ℃變性3 min； 94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)35次；最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物由擎科生物技術(shù)有限公司進行純化測序。

表2 用于COⅠ和Cytb基因PCR擴增的引物和產(chǎn)物長度

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用DPS軟件[15]計算3種藥劑對二化螟3 齡幼蟲的致死中濃度LC50。

序列分析：利用SeqMan軟件[16]對獲得的雙向測序序列進行比對拼接。利用ClusterW(https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw)將拼接后的DNA序列進行比對。種群的總單倍型數(shù)及多態(tài)位點數(shù)檢測采用DnaSP v5軟件完成[17]。二化螟種群的遺傳多樣性參數(shù)，包括每個種群的單倍型數(shù)(H)、單倍型多樣度(h)、核苷酸多樣度(π)及兩兩序列比對平均核苷酸差異數(shù)(k)的計算利用Arlequin 3.5[18]軟件完成。

種群遺傳結(jié)構(gòu)分析：分子變異方差分析(AMOVA)利用Arlequin 3.5 完成，通過1 000次重抽樣來檢驗組間、組內(nèi)群體間、群體內(nèi)個體間的協(xié)方差的顯著性。兩兩群體間的遺傳差異采用Tumura-Nei模型下的群體分化指數(shù)(Fst)分析，通過1 000次重抽樣檢驗Fst值的顯著性[19]。利用R語言(https：//www.r-project.org/)進行遺傳距離與地理距離的Mantel相關(guān)性檢驗及抗性水平與遺傳多樣性間的Pearson相關(guān)性檢驗。利用TCS 法建立單倍型網(wǎng)絡關(guān)系圖(http：//popart.otago.ac.nz)。單倍型系統(tǒng)發(fā)育進化樹采用鄰接法(neighbor-joining method)計算并使用Mega 6.0軟件構(gòu)建[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地理種群的抗性水平監(jiān)測結(jié)果

測定了這8個二化螟地理種群對氯蟲苯甲酰胺、阿維菌素、甲氧蟲酰肼3種藥劑的抗藥性。結(jié)果表明，8個種群對氯蟲苯甲酰胺的抗藥性最高，抗性倍數(shù)在57.84～216.77倍，其中抗性最高的是WL種群，最低的為PH種群；對阿維菌素的抗藥性較低，抗性倍數(shù)在9.21～19.16倍，其中抗性最高的為PH種群，最低的為WL種群，與對氯蟲苯甲酰胺的抗性水平截然不同；對甲氧蟲酰肼的抗性也相對較高，抗性倍數(shù)在50.47～136.61倍，其中抗性最高的為XiaoS種群，最低的為WL種群(表3)。

表3 不同地理種群二化螟對氯蟲苯甲酰胺、阿維菌素和甲氧蟲酰肼的抗性水平

2.2 種群遺傳多樣性分析

實驗獲得8個不同地理種群二化螟的COⅠ基因測序結(jié)果，去除引物序列及部分端序列后得到355條627 bp的等長序列。序列分析結(jié)果顯示，A、T、C、G的平均含量分別為29.6%、39.5%、15.5%、15.4%，AT(69.1%)含量明顯高于GC(30.9%)含量，各群體堿基組成相近，沒有出現(xiàn)堿基插入和缺失現(xiàn)象。所有同源序列中監(jiān)測出了68個多態(tài)性位點，其中單突變位點22個，簡約突變位點46個。共出現(xiàn)了85個單倍型，每個群體的平均單倍型為18.25個，其中RA種群中單倍型最多，為27個單倍型，單倍型多樣度h為0.896 3，最低的為NH種群(h=0.511 1)；核苷酸多樣性指數(shù)最高的為XiaoS種群(π=0.009 5)，最低的為NH種群(π=0.002 9)(表4)。

實驗獲得8個不同地理種群二化螟的Cytb基因測序結(jié)果，去除引物序列及部分端序列后得到326條455 bp的等長序列。序列分析結(jié)果顯示，A、T、C、G的平均含量分別為31.2%、41.5%、17.7%、9.6%，AT(72.7%)含量明顯高于GC(27.3%)含量，各群體堿基組成相近，同樣沒有出現(xiàn)堿基插入和缺失現(xiàn)象。所有同源序列中監(jiān)測出了45個多態(tài)性位點，其中單突變位點19個，簡約突變位點26個。共出現(xiàn)了64個單倍型，每個群體的平均單倍型為14.375個，其中YQ種群中單倍型最多，為25個單倍型，單倍型多樣度h為0.934 4，最低的為NH種群(h=0.266 2)；核苷酸多樣性指數(shù)最高的為PH種群(π=0.010 7)，最低的為NH種群(π=0.003 4)(表4)。

表4 基于COⅠ和Cytb標記的二化螟8個不同抗性水平地理種群的遺傳學參數(shù)

抗性水平與遺傳多樣性Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示：二化螟對氯蟲苯甲酰胺、阿維菌素和甲氧蟲酰肼的抗性水平與種群遺傳多樣性參數(shù)單倍型多樣度h和核苷酸多樣性指數(shù)π無顯著相關(guān)性(P>0.05，表5)。

表5 二化螟不同地理種群抗性水平與種群遺傳多樣性的Pearson相關(guān)性分析

2.3 種群遺傳結(jié)構(gòu)分析

二化螟不同地理種群間遺傳距離及群體間遺傳分化系數(shù)見表6?；贑OⅠ基因的分析結(jié)果顯示，種群間遺傳距離分布在0.005～0.011，遺傳距離最高的XiaoS種群與PH、RA、XS、YQ種群間，均為0.011；最低的為NH種群與YK種群之間，遺傳距離為0.005，遺傳距離和地理距離間無顯著相關(guān)性。兩兩種群之間的Fst值分布在-0.002 90～0.451 48，其中RA與NH種群間遺傳分化系數(shù)最大，YQ與XS間遺傳分化系數(shù)最小，遺傳距離和地理距離間無顯著相關(guān)性(表6)。

基于Cytb基因的分析結(jié)果顯示，種群間遺傳距離分布在0.006～0.012，遺傳距離最高的XiaoS種群與RA、XS、YQ種群間及NH與RA種群間，均為0.012；最低的為NH種群與YK種群之間，遺傳距離為0.006，遺傳距離和地理距離間無顯著相關(guān)性。兩兩種群之間的Fst值分布在-0.015 99～0.586 93，其中RA與NH種群間遺傳分化系數(shù)最大，YQ與XS間遺傳分化系數(shù)最小(表6)。

表6 八個二化螟不同抗性水平地理種群間遺傳分化系數(shù)(對角線下)及遺傳距離(對角線上)

基于COⅠ和Cytb基因的AMOVA分析結(jié)果顯示，二化螟不同地理種群間遺傳變異大多數(shù)來自于群體內(nèi)個體間，分別占80.30%(COⅠ)和78.16%(Cytb)，且具有顯著差異的統(tǒng)計值(P=0.000 1，COⅠ；P=0.000 01，Cytb)，較少部分的遺傳差異來自于組間，分別占19.43%(P=0.010 8，COⅠ)和21.22%(P=0.014 06，Cytb)，而來自于組內(nèi)群體間的遺傳差異分別只占0.27%(P=0.338 2，COⅠ)和0.62%(P=0.308 22，Cytb)(表7)。

表7 基于COⅠ和Cytb基因序列的二化螟種群遺傳變異的AMOVA分析

基于COⅠ基因分析的二化螟不同地理種群單倍型網(wǎng)絡關(guān)系圖顯示，Hap_1的拷貝數(shù)在NH種群中比例最高(圖1)。各單倍型間堿基差異小，不同群體的單倍型未呈現(xiàn)地理分支，沒有表現(xiàn)出顯著的地理系譜結(jié)構(gòu)。85個單倍型的系統(tǒng)樹未表現(xiàn)出清晰的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，支持單倍型網(wǎng)絡圖的結(jié)論(圖2)。同樣，基于Cytb基因的單倍型網(wǎng)絡關(guān)系圖分析結(jié)果顯示，Hap_1和Hap_5的拷貝數(shù)在所有種群的樣品中占比例較高，且Hap_1在NH種群中比例最高(圖3)。所有單倍型的系統(tǒng)樹也未表現(xiàn)出清晰的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖4)。

圖1 基于COⅠ基因分析的85個單倍型網(wǎng)絡關(guān)系圖Fig.1 Haplotype network of 85 haplotypes based on COⅠ gene analysis

圖2 二化螟COⅠ基因不同單倍型鄰接樹Fig.2 Haplotype neighbor-joining tree based on COⅠ genes of Chilo suppressalis

圖3 基于Cytb基因分析的64個單倍型網(wǎng)絡關(guān)系圖Fig.3 Haplotype network of 64 haplotypes based on Cytb gene analysis

圖4 二化螟Cytb基因不同單倍型鄰接樹Fig.4 Haplotype neighbor-joining tree based on Cytb genes of Chilo suppressalis

3 討論

室內(nèi)測定了浙江省內(nèi)8個不同地理種群對氯蟲苯甲酰胺、阿維菌素和甲氧蟲酰肼3種藥劑的抗性水平，除PH、XS、RA種群外，其余種群對氯蟲苯甲酰胺的抗性倍數(shù)均高于100倍；除NH和WL種群外，其余種群對甲氧蟲酰肼的抗性倍數(shù)也均高于100倍；所有監(jiān)測的種群對阿維菌素的抗藥性仍處于相對較低的水平。由此可見，浙江省內(nèi)大部分田間二化螟種群對氯蟲苯甲酰胺和甲氧蟲酰肼都產(chǎn)生了高水平抗性，而不同種群之間抗性水平的差異可能與當?shù)赜盟帤v史和用藥次數(shù)有關(guān)。

基因序列變異與遺傳多樣性是研究生物多樣性的基礎(chǔ)，核苷酸多樣性和單倍型多樣性是評價遺傳多樣性的重要指標[3]。本研究通過對我國浙江地區(qū)8個不同抗性水平的二化螟地理種群COⅠ和Cytb基因進行擴增和序列分析發(fā)現(xiàn)：一是AT含量明顯高于GC含量，這種嚴重A+T偏向性現(xiàn)象與其他鱗翅目昆蟲類似[20-21]。二是二化螟種群遺傳多樣性參數(shù)較低，三百多個個體中分別檢測到85個單倍型(COⅠ)和64個單倍型(Cytb)，表明二化螟種群的遺傳多樣性處于相對較低的水平。這與其他鱗翅目夜蛾科昆蟲的研究結(jié)果較為一致[21-22]。此外，Grant等[23]提出了單倍型多樣性和核苷酸多樣性組合中的“高h，低π”的遺傳多樣性類型，我們的研究結(jié)果顯示，二化螟種群具有較高水平的單倍體多樣性和較低水平的核苷酸多樣性，與Grant等[23]提出的遺傳多樣性類型相符合。具有較低水平遺傳多樣性的物種易受到外界因素的影響，在不利的環(huán)境條件下生存容易受到一定的威脅，這對于抗性二化螟的田間防控是一個相對有利的因素。AMOVA 分析發(fā)現(xiàn)，群體間的Fst值較低且多為不顯著，表明不同群體間沒有形成顯著的遺傳分化，只有NH和PH種群間存在較低程度的遺傳分化?？偟膩砜?，所檢測的不同抗性水平的二化螟群體間沒有形成顯著的遺傳結(jié)構(gòu)，遺傳分化程度低，群體間可能存在基因交流現(xiàn)象。

目前，二化螟抗藥性發(fā)展迅速，對多種類型的藥劑都產(chǎn)生了較高水平的抗藥性。我們的研究結(jié)果顯示，二化螟種群遺傳距離與地理距離之間不存在顯著的相關(guān)性；不同種群二化螟抗性水平與種群遺傳多樣性無顯著的相關(guān)性。由此可見，田間存活下來的抗性個體擴散、造成不同地理種群的基因交流可能是二化螟抗藥性快速發(fā)展的關(guān)鍵。因此，采取一定的措施盡量限制其快速擴散到其他水稻主產(chǎn)區(qū)對控制二化螟成災及抗性二化螟的有效治理具有重要意義。