黑莓果實(shí)發(fā)育過程中蔗糖磷酸合成酶基因的表達(dá)分析

嚴(yán)志祥，楊海燕，樊蘇帆，吳文龍，閭連飛，李維林*

(1.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所，江蘇 南京 210014)

目前，分子育種是經(jīng)濟(jì)林研究的重要技術(shù)手段之一，具有廣闊的發(fā)展前景[1]。蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)是由2個(gè)或4個(gè)亞基構(gòu)成的二聚體或四聚體[2]，其主要催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和果糖-6-磷酸(F-6-P)反應(yīng)生成6-磷酸蔗糖，而后進(jìn)一步被蔗糖磷酸化酶(SPP)水解為蔗糖和磷酸根離子。SPS與SPP在植物中通常以復(fù)合體的形式存在，所以蔗糖生成是不可逆的[3]。SPS是蔗糖合成路徑上的關(guān)鍵酶之一，在植物組織器官中廣泛存在，調(diào)控光合產(chǎn)物在蔗糖和淀粉間的分配，同時(shí)是蔗糖合成的關(guān)鍵限速酶。SPS在植物生長(zhǎng)發(fā)育、果實(shí)成熟、細(xì)胞壁合成、果實(shí)品質(zhì)形成和同化產(chǎn)物的積累與分配等方面具有重要作用。此外，SPS還對(duì)植物的抗逆性有一定影響[4]。

在植物中發(fā)現(xiàn)的A、B、C、D 4個(gè)SPS基因亞族[5]中，除了D亞族僅存在于單子葉植物中[6]，其他亞族成員在單、雙子葉植物中均有發(fā)現(xiàn)。A亞族廣泛存在于植物的各個(gè)組織中，B亞族主要存在于植物的生殖器官，C亞族主要存在于植物的成熟組織中。目前，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中共發(fā)現(xiàn)4個(gè)SPS基因，分別為SPSA1、SPSA2、SPSB和SPSC，其中SPSA1主要在光合作用合成蔗糖過程中發(fā)揮重要作用[7]，SPSA1參與花粉末期蔗糖合成[8]，SPSA1和SPSA2在成熟蜜腺中大量表達(dá)，表明其與花蜜合成關(guān)系密切[9]。在煙草(Nicotianatabacum)中，SPSB在生殖器官中大量表達(dá)[10]；SPSC在擬南芥及煙草中均有發(fā)現(xiàn)，其主要負(fù)責(zé)夜間蔗糖合成以及維持淀粉正常運(yùn)輸[10]。SPS還能促進(jìn)光合產(chǎn)物向蔗糖流動(dòng)而降低淀粉的合成。已有研究表明，在荔枝(Litchichinensis)假種皮發(fā)育過程中LcSPS4與蔗糖含量呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)[11]。也有研究發(fā)現(xiàn)，甜瓜(Cucumismelo)中CmSPS1隨著果實(shí)發(fā)育表達(dá)量不斷提高，暗示其影響甜瓜果實(shí)發(fā)育和蔗糖代謝[12]。Verma等[13]對(duì)不同品種甘蔗(Saccharumofficinarum)的研究發(fā)現(xiàn)，高糖品種中SPS基因表達(dá)量更高，進(jìn)一步證明SPS與蔗糖含量呈正相關(guān)。

黑莓(Rubusspp.)屬薔薇科懸鉤子屬灌木[14]，是近年風(fēng)靡全球的第3代水果，其果實(shí)糖含量不顯著，口感較酸。黑莓中糖的種類及含量直接決定其品質(zhì)。蔗糖是主要的可溶性糖之一，它的運(yùn)輸和分配不僅決定著植物生長(zhǎng)發(fā)育的整個(gè)過程，也決定著經(jīng)濟(jì)器官的產(chǎn)量和質(zhì)量，同時(shí)它改善了水果的味道，是水果甜味最重要的組成部分。SPS是蔗糖合成的關(guān)鍵限速酶之一，其活力大小與蔗糖合成呈顯著正相關(guān)[15]。目前關(guān)于黑莓中SPS基因與蔗糖合成的分子機(jī)制研究的相關(guān)報(bào)道鮮見。本研究利用生物信息學(xué)分析方法, 基于前期通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序信息克隆得到的3個(gè)SPS基因，對(duì)其編碼的蛋白結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系以及在植株內(nèi)的表達(dá)情況等進(jìn)行研究，以期為黑莓中SPS家族主要成員相關(guān)功能的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究材料

黑莓品種‘寶森’(‘Boysenberry’)栽培于江蘇省南京市溧水區(qū)白馬黑莓科研基地。試驗(yàn)于2019年4月下旬至6月上旬進(jìn)行。選擇10株生長(zhǎng)發(fā)育良好的3年生健康植株，在植株達(dá)到開花的旺盛期[15]，標(biāo)記當(dāng)日植株盛開的發(fā)育良好花朵，從花后21 d直至花后39 d，每7 d隨機(jī)采集1次試驗(yàn)果實(shí)樣品，同步收集當(dāng)日發(fā)育良好的葉片樣品，進(jìn)行SPS基因的表達(dá)分析和SPS酶活性測(cè)定。分別于盛花期采集植株的根、莖、葉和花, 在液氮中冷凍而后存于-80 ℃待測(cè)。

1.2 黑莓SPS基因表達(dá)分析方法

1.2.1 黑莓SPS基因的序列及系統(tǒng)進(jìn)化分析方法

利用美國(guó)國(guó)家生物信息中心(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站提供的相關(guān)信息進(jìn)行SPS的cDNA序列比對(duì)；氨基酸序列同源性多重比對(duì)利用Clustal X 2.0進(jìn)行。使用MEGA 7.0軟件中的鄰接法(neighbour-joining, NJ)構(gòu)建氨基酸序列進(jìn)化樹，其中校驗(yàn)參數(shù)bootstrap為1 000次重復(fù)。

1.2.2 黑莓SPS蛋白的特性和結(jié)構(gòu)分析方法

通過SMART網(wǎng)站(http://smart.embl.de/)分析蛋白保守功能域；利用MEME網(wǎng)站(http://meme-suit.org/tools/meme)分析黑莓SPS蛋白的保守元件，元件注釋利用InterProScan 網(wǎng)站(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)進(jìn)行；使用ExPASy Proteomics Sever(http://expasy.org/)網(wǎng)站進(jìn)行黑莓SPS編碼的蛋白氨基酸序列分子量和等電點(diǎn)預(yù)測(cè)；通過Prabi網(wǎng)站(https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home)及Swissmodel網(wǎng)站(https://swissmodel.expasy.org/)對(duì)各SPS基因所編碼的氨基酸序列進(jìn)行推導(dǎo)，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用Genedoc軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析。

1.2.3 黑莓SPS基因qRT-PCR分析方法

RNA提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克公司，分別提取‘寶森’根、莖、葉片、花和果實(shí)的總RNA，利用上海浦迪生物科技有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑制備cDNA，根據(jù)試劑盒說明，1 μL RNA 反轉(zhuǎn)錄成10 μL cDNA。通過qRT-PCR檢測(cè)蔗糖代謝相關(guān)基因在不同組織中的表達(dá)水平，各基因序列特異性引物見表1。qRT-PCR 擴(kuò)增體系為20 μL，其中cDNA 1 μg，TB GreenTMPremix ExTaqTM(TaKaRa)10 μL，引物各0.5 μL，擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，延伸6 s;40個(gè)循環(huán)。根據(jù)定量擴(kuò)增曲線達(dá)到平臺(tái)期時(shí)的Ct值，以黑莓Actin基因(GenBank No.HQ439556)作為內(nèi)參。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.4 黑莓SPS酶的活性測(cè)定

SPS活性測(cè)定采用上海優(yōu)選生物科技有限公司試劑盒。將每mg組織蛋白每min催化產(chǎn)生1 μg蔗糖定義為1個(gè)酶活力單位,μg/(min·mg)。測(cè)定3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行 3 次生物學(xué)重復(fù)及技術(shù)重復(fù)，采用Excel 2016 及DPS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和差異顯著性分析，采用 SPSS 22.0 以 Pearson 相關(guān)模型分析基因表達(dá)量和酶活力的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑莓SPS基因系統(tǒng)發(fā)生分析

利用NCBI BLAST工具對(duì)克隆獲得的3條cDNA核苷酸序列片段進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其編碼的是不同形式的SPS，將序列信息提交至GenBank數(shù)據(jù)庫中，分別命名為RuSPS1(MT682348)、RuSPS2(MT682349)和RuSPS3(MT682350)。對(duì)RuSPSs基因編碼的蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其氨基酸長(zhǎng)度為851～1 068 aa，分子質(zhì)量為93.98～119.94 ku，等電點(diǎn)從5.96到6.16不等，可以看出RuSPS編碼的蛋白等電點(diǎn)均<7，表明黑莓SPS蛋白主要以弱酸性形式存在(表2)。

表2 黑莓RuSPS基因基本信息

黑莓RuSPS基因編碼蛋白都具有SPS蛋白的蛋白調(diào)控位點(diǎn)，即SPS蛋白與14-3-3 調(diào)控蛋白作用的磷酸化位點(diǎn)以及SPS響應(yīng)滲透壓的磷酸化修飾位點(diǎn)[16]。通過NCBI Blast 工具檢索發(fā)現(xiàn)黑莓SPS的氨基酸序列與其他植物的氨基酸序列有著廣泛的相似性，如RuSPS1與苜蓿(MedicagosativaAAK09427.2)一致性為76%，相似性為84%；RuSPS2與沙梨(PyruspyrifoliaBAG30918)一致性為68.7%，相似性為73.9%；RuSPS3與桃(PrunuspersicaEMJ26601.1)和月季(RosachinensisXP_024192491.1)一致性分別為91.3%和96.2%，相似性分別為96.4%和97.9%。

利用23個(gè)基因編碼的氨基酸序列與3條RuSPSs氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析，顯示其序列相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)RuSPS1、RuSPS3 之間進(jìn)化距離較近(圖1a)，與RuSPS2距離較遠(yuǎn)?？梢钥吹絉uSPS1與AtSPS1距離較近，RuSPS3與PpySPS距離較近，同屬A亞族，RuSPS2和NtSPS B、AtSPS3屬于B亞族(圖1)。

Cm.甜瓜(Cucumis melo ABF47344.1)；Sl.番茄(Solanum lycopersicum，SlSPS NP_001233920.2，SlSPS4 XP_004250761.1，SlSPSB AFD64638.1)；Ib.番薯(Ipomoea batatas AAL34531.1)；Ac.中華獼猴桃(Actinidia chinensis AAL86360.1)；At.擬南芥(Arabidopsis thaliana，AtSPS1 NP_197528，AtSPS2 NP_196672，AtSPS3 NP_171984，AtSPS4 NP_192750)；Hb.橡膠(Hevea brasiliensis XP_021661770.1)；Mi:芒果(Mangifera indica BAM37540.1)；Ms.苜蓿(Medicago sativa AAK09427.2);Ppy.沙梨(Pyrus pyrifolia BAG30918); Sb.高粱(Sorghum bicolor ACX94229)；Vv.葡萄(Vitis vinifera AAW82754.1)；Nt.煙草(Nicotiana tabacum NtSPSC ABA64520，NtSPSB ABA64521)；Zm.玉米(Zea mays NP_001105694.1)；Os.水稻(Oryza sativa BAA08304.1)；Pt.毛果楊(Populus trichocarpa XP_002328899.1)；Pp.桃(Prunus persica EMJ26601.1);Rc.月季(Rosa chinensis XP_024192491.1)。

2.2 黑莓SPS蛋白氨基酸序列分析

利用Meme軟件在黑莓SPS蛋白中預(yù)測(cè)出10個(gè)保守元件。元件1～3、6和8～10在所有SPS蛋白中均被預(yù)測(cè)到；除RuSPS1外元件5在所有蛋白中均存在，RuSPS3中缺失元件7和元件4；元件10在C家族中未發(fā)現(xiàn)(圖1b)，RuSPS1和RuSPS3在保守元件中具有較大的特異性。根據(jù) InterProScan 注釋顯示，元件 1～4 都是糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白，其余都是SPS 相關(guān)蛋白。

已有研究表明在植物中SPS 蛋白普遍存在3 個(gè)相對(duì)保守的磷酸化位點(diǎn)，分別為光/暗調(diào)控位點(diǎn)(Ser-158)，14-3-3調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)(Ser-229)和滲透壓調(diào)控位點(diǎn)(Ser-424);同時(shí)具有2個(gè)保守的蛋白結(jié)構(gòu)域，分別是位于C端的SPP-like 結(jié)構(gòu)域(SPP-like domain)以及位于N 端的葡糖基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域(glycosyltransferase domain)[17]。

對(duì)分別來自擬南芥、沙梨、煙草、高粱和黑莓的3個(gè)SPS亞家族共11個(gè)氨基酸序列進(jìn)行了多重序列比對(duì)(圖2)，分析了它們的序列相似性、SPS蛋白結(jié)構(gòu)域以及磷酸化位點(diǎn)。通過對(duì)不同家族成員SPS的比較可以看到，在所有SPS基因編碼的氨基酸的N端，除RuSPS3前段缺失之外，其余前23個(gè)氨基酸殘基幾乎是保守的，但是它們的調(diào)控及結(jié)合位點(diǎn)序列區(qū)域存在較明顯的差異?？梢钥吹剿蠥亞族二分體核定位序列均表現(xiàn)為KK(11aa)KRR，而在B亞族和C亞族中表現(xiàn)為KK(12aa)RR。DTGGQVKY是6-磷酸果糖的共同識(shí)別位點(diǎn)，在所有的SPS中幾乎都是保守的。14-3-3和尿苷二磷酸葡萄糖結(jié)合位點(diǎn)相互重疊，在A亞族成員包含14-3-3結(jié)合位點(diǎn)(HXRXXSXP, ser229)，但B和C亞族成員缺失，與6-磷酸果糖結(jié)合位點(diǎn)一樣，尿苷二磷酸葡萄糖結(jié)合位點(diǎn)在所有的SPS中都很保守，這反映了它們?cè)诠δ苌系囊恢滦?。A和C亞族都遵循BHXBXXS序列進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)，但在B亞族中絲氨酸則被天冬氨酸取代；同時(shí)3個(gè)RuSPS基因編碼的SPS蛋白均具有保守的葡糖基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域和SPP-like 結(jié)構(gòu)域。

箭頭以內(nèi)序列表示二分體核定位序列。從上至下3處矩形框依次表示3個(gè)保守的磷酸化位點(diǎn):6-磷酸果糖結(jié)合位點(diǎn)、14-3-3 調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)(Ser-229)/尿苷二磷酸葡萄糖結(jié)合位點(diǎn)和滲透壓調(diào)控位點(diǎn)(Ser-424)。SPP-like結(jié)構(gòu)域和葡萄糖基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域如實(shí)線所示。The sequence within the arrow represents the bipartitenuclear localization sequence; The three rectangular frames from top to bottom represent three conserved phosphorylation sites: fructose 6-phosphate binding site, 14-3-3 regulatory protein binding site(Ser-229)/UDP-Glc binding site and osmotic pressure regulatory site(Ser-424)，the glucosyltransfer domain and the SPP-like domain were marked with black lines, respectively.

2.3 黑莓SPS蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及分析

通常，蛋白質(zhì)分子的多肽鏈經(jīng)過盤曲折疊后形成相對(duì)穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，從而形成獨(dú)特的活性以及物理和化學(xué)性質(zhì)，因此蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)與空間結(jié)構(gòu)分析對(duì)于了解其功能有重要的意義。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈中主鏈原子以氫鍵構(gòu)成的局部空間排布，常見的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件有α-螺旋、β-折疊、延伸鏈和無規(guī)則卷曲等。黑莓SPS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)如SOPMA網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果(圖3)所示，可以看到α-螺旋及無規(guī)則卷曲是3個(gè)SPS蛋白最多的結(jié)構(gòu)元件，而β-折疊及延伸鏈隨機(jī)分布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，RuSPS1蛋白由39.84%的α-螺旋、39.84%的無規(guī)則卷曲、13.97%的延伸鏈和6.34%的β-折疊組成，RuSPS2蛋白由40.54%的α-螺旋、39.61%的無規(guī)則卷曲、13.11%的延伸鏈和6.74%的β-折疊組成，RuSPS3蛋白由37.13%的α-螺旋、41.48%的無規(guī)則卷曲、15.16%的延伸鏈和6.23%的β-折疊組成。SWISS-MODEL在線預(yù)測(cè)結(jié)果表明，RuSPS蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成(圖4)，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

藍(lán)色blue.α-螺旋α-helix；綠色green.β-折疊β-fold；紫色purple.無規(guī)則卷曲irregular curl；紅色red.延伸鏈extension chain。

不同顏色代表肽鏈的結(jié)構(gòu)特征: 從N-端延(深藍(lán)色)伸至C-端(紅色)。Color shows the order of peptide chain, starting as dark blue from the N-terminus, going to red at the C-terminus.

2.4 黑莓RuSPS基因的表達(dá)分析

2.4.1 在不同組織中的表達(dá)

為了進(jìn)一步了解RuSPS基因在黑莓組織器官中的表達(dá)特性，以黑莓RuActin基因?yàn)閮?nèi)參，對(duì)RuSPS1、RuSPS2和RuSPS3在‘Boysen’品種不同組織中的表達(dá)量進(jìn)行比較分析。由結(jié)果(圖5A)發(fā)現(xiàn)，3個(gè)基因在根、莖、葉、花、果實(shí)中表達(dá)量存在顯著差異，其中RuSPS1在葉片和成熟果實(shí)中高度表達(dá)，RuSPS2在發(fā)育成熟的果實(shí)中有大量的表達(dá)，在其他器官中表達(dá)量較低，提示RuSPS2可能與黑莓果實(shí)發(fā)育有關(guān)，RuSPS3在各器官中的表達(dá)均較高，花和果實(shí)中的表達(dá)量稍高但與其他組織相比差異不顯著。3個(gè)RuSPS基因在各種組織中有不同程度的表達(dá)，推測(cè)它們的功能是維持各種組織對(duì)蔗糖的基本需要。

不同小寫字母表示在不同組織或不同發(fā)育階段的表達(dá)量在5%水平差異顯著。The lowercase letters indicate signifference at 0.05 levels in different tissues or at different stages.

2.4.2 在不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)中的表達(dá)

‘寶森’品種果實(shí)在開花后9 d形成小核果，在21 d時(shí)果實(shí)開始膨大，果實(shí)完全成熟需歷時(shí)39 d。對(duì)黑莓3個(gè)RuSPS基因在果實(shí)發(fā)育過程中即花后21～39 d中的表達(dá)量進(jìn)行了比較分析(圖5B)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：RuSPS1表達(dá)量從果實(shí)發(fā)育早期逐漸上升，至中期27 d達(dá)到最高，而后表現(xiàn)為下降趨勢(shì)；RuSPS2在果實(shí)發(fā)育早期和中期表達(dá)量變化不明顯，在39 d時(shí)表現(xiàn)出較高的表達(dá)量，但與其他時(shí)期相比差異不顯著；RuSPS3在果實(shí)發(fā)育過程中表達(dá)量呈線性增長(zhǎng)，直至發(fā)育成熟時(shí)達(dá)到峰值。此外，可以看到除RuSPS1在27 d達(dá)到峰值，其余2個(gè)基因均在果實(shí)發(fā)育后期表達(dá)量較高，而在早期或中期表達(dá)量較低。

2.4.3 在葉片中的表達(dá)

對(duì)黑莓果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期對(duì)應(yīng)葉片中的RuSPS基因進(jìn)行熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)基因在果實(shí)發(fā)育進(jìn)程各個(gè)時(shí)期對(duì)應(yīng)的葉片中均有表達(dá)，且表達(dá)量在果實(shí)成熟期最大，分別較21 d時(shí)增加了59.7%、73.5%和59.4%(圖5C)。RuSPS1在葉片中的表達(dá)量隨著果實(shí)發(fā)育進(jìn)程而減少，至果實(shí)成熟期突然上升；RuSPS2和RuSPS3在葉片中的表達(dá)量表現(xiàn)為花后27 d 前即果實(shí)發(fā)育早期和中期逐漸上升，在發(fā)育后期(花后33 d)有所下降，在果實(shí)完全成熟時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高。

2.5 不同發(fā)育階段黑莓果實(shí)及葉片中SPS酶活性的變化

在果實(shí)及葉片不同發(fā)育時(shí)期進(jìn)行SPS酶活性的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，果實(shí)及葉片中SPS活性與其RuSPSs基因的表達(dá)模式呈正相關(guān)。在果實(shí)中，SPS活性在花后21～27 d時(shí)顯著上升，提高了197%，到花后33 d時(shí)略微下降，而后在花后39 d時(shí)達(dá)到最高值486.77 μg/(min·mg)。葉片中的SPS活性在花后21 d時(shí)低于果實(shí)，而后迅速上升；在花后33 d時(shí)迅速下降，最后在花后39 d時(shí)達(dá)到最高。SPS活性在葉片中的變化趨勢(shì)與RuSPS2及RuSPS3表達(dá)模式一致。為了進(jìn)一步解釋黑莓SPS基因表達(dá)量與蔗糖磷酸合成酶不同發(fā)育階段之間的關(guān)系，分別以葉片和果實(shí)4個(gè)發(fā)育階段酶活力及該部位不同SPS的表達(dá)量的值進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明葉片中蔗糖磷酸合成酶活性與RuSPS2顯著正相關(guān)(P<0.05,)，而果實(shí)中蔗糖磷酸合成酶活性與RuSPS1顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05,表 3)，提示葉片中SPS活性的變化一定程度上是由RuSPS2調(diào)控，而果實(shí)中SPS活性的變化則是由RuSPS1調(diào)控。

表3 不同發(fā)育時(shí)期黑莓果實(shí)及葉片中RuSPS表達(dá)量與SPS酶活性相關(guān)性分析

3 討 論

本研究分析了黑莓SPS基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、氨基酸序列、保守元件、不同組織器官和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異。從黑莓品種‘寶森’中克隆分離了3個(gè)SPS基因家族成員，分別命名為RuSPS1(MT682348)、RuSPS2(MT682349)和RuSPS3(MT682350)。氨基酸聚類分析表明，RuSPS1和RuSPS3屬于典型的A亞族，RuSPS2屬于B家族，這與大多數(shù)植物中含有3～5個(gè)SPS基因的研究結(jié)果一致[18]，尚未發(fā)現(xiàn)屬于其他亞族的成員。目前認(rèn)為，SPS活性受到轉(zhuǎn)錄水平和蛋白磷酸化共同調(diào)控。RuSPS1與AtSPS1中的Ser-424位點(diǎn)發(fā)生相同位點(diǎn)氨基酸突變，與聚類分析結(jié)果一致,表明其功能高度類似。此外，14-3-3 蛋白的磷酸化也參與了SPS活性調(diào)控[19]，其通過與Ser-229 蛋白磷酸化位點(diǎn)互作抑制其自身表達(dá)，從而促進(jìn)SPS活性升高和蔗糖積累[20]。氨基酸序列比對(duì)顯示黑莓SPS蛋白的Ser-424、Ser-158、14-3-3蛋白磷酸化位點(diǎn)相對(duì)保守，RuSPS1前6個(gè)氨基酸突變，以及RuSPSs在結(jié)構(gòu)域和磷酸化位點(diǎn)上的非保守替換并且由于點(diǎn)突變的累計(jì)，缺失和插入主要局限于N端和C端。這些變化都可能影響它們的結(jié)構(gòu)和功能，從而改變它們的活性。本研究還預(yù)測(cè)了黑莓SPS蛋白的空間結(jié)構(gòu)，所有的這些序列特征和空間特征可能會(huì)影響黑莓SPS蛋白的整體催化活性和功能專一性。

在本研究中，黑莓不同亞族SPS基因表達(dá)顯示了不同的時(shí)間和空間特異性。B亞族RuSPS2基因在成熟葉片中表達(dá)量較高，表明其可能參與了源器官中蔗糖的合成，這與之前在水稻中OsSPS1的研究結(jié)果相似[21]，但在甘蔗中則得到了相反的結(jié)果，SofSPSB在成熟葉片中表達(dá)量甚微[22]。當(dāng)黑莓果實(shí)發(fā)育39 d時(shí)，RuSPS2在果實(shí)中表達(dá)量是葉片中的2.46倍，說明蔗糖合成在果實(shí)中更密集。B亞族SPS基因在葉片及成熟果實(shí)中高表達(dá)，暗示著它們?cè)凇础畮臁P(guān)系、器官光合產(chǎn)物的積累方面可能起著重要作用，但B亞族SPS在更多植物中的表達(dá)模式還有待進(jìn)一步研究。A亞族SPS基因被認(rèn)為是植物重要的管家基因[23]，常常在植物的各個(gè)組織器官中均有較高的表達(dá)。黑莓A亞族SPS基因RuSPS1在被檢測(cè)的各個(gè)組織中均有較高的表達(dá)，僅在花中表達(dá)量較低，推測(cè)它的功能是維持各種組織對(duì)蔗糖的基本需要。黑莓中A亞族及B亞族SPS基因表達(dá)量在果實(shí)及葉片發(fā)育過程中都隨著果實(shí)成熟度增加而上調(diào)，與黑莓果實(shí)及葉片中SPS活性的變化趨勢(shì)一致，這些結(jié)果表明黑莓SPS基因家族在黑莓果實(shí)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，并影響植物的蔗糖的合成和積累，但它們的表達(dá)與黑莓‘源’‘庫’器官間的聯(lián)系仍需更深入的研究。