杉木ClWRKY44基因克隆及其表達特性分析

林莉莉，胡安琪，陳 鋼,3，張霽月，曹光球,3，曹世江,3*

(1.福建農(nóng)林大學林學院，福建 福州 350002；2.華川技術有限公司，福建 福州 350008；3.國家林業(yè)和草原局杉木工程技術研究中心，福建 福州 350002)

杉木(Cunninghamialanceolata)是我國主要的速生造林樹種之一[1-3]。杉木的用途廣泛、市場需求量大，為滿足目前市場對木材的需求，提高杉木速生、豐產(chǎn)性能，以及杉木抗旱和抗逆能力尤為重要。

在多種植物中都發(fā)現(xiàn)了參與響應非生物和生物脅迫的WRKY基因，有的WRKY基因還參與了多種脅迫應答[4-5]。從已發(fā)表的研究結果來看，WRKY家族的大部分成員在高鹽、干旱和病害脅迫中傾向于上調(diào)表達，這可以從WRKY基因的誘導或過表達實驗中得到證實。有研究表明，棉花(Gossypiumspp.)中WRKYs受鹽離子脅迫時表達增加[6]。在低磷脅迫下，ClWRKY8、ClWRKY21、ClWRKY24、ClWRKY35這4個基因可能參與杉木耐受低磷脅迫的調(diào)控過程[7]。在木薯(Manihotesculenta)中鑒定了82個家族成員，其中MeWRKY11和MeWRKY14對干旱脅迫表現(xiàn)出極強的特異響應，MeWRKY18表現(xiàn)出對鹽的特異響應，同時MeWRKYs對滲透壓、脫落酸、冷害和雙氧水也有響應[4]。WRKY是一類植物特有的轉錄因子，它不僅是應對非生物脅迫的重要轉錄因子之一，也是植物信號傳遞網(wǎng)絡的重要組成部分，參與調(diào)控植物的生長過程[8]，WRKY轉錄因子在植物體內(nèi)起到重要的生物功能作用，其中包括調(diào)節(jié)種子的萌發(fā)、開花期和葉片衰落等[9]。

WRKY基因具有保守結構域，其中包含有1個植物中獨有的轉錄因子家族,WRKYGQK序列[10]。Ishiguro等[11]首次克隆出WRKY蛋白SPF1，隨后學者在挪威云杉(Piceaabies)中克隆出了50個WRKY基因、從北美黃杉(Pseudotsugamenziesii)中發(fā)現(xiàn)了80個WRKY基因[12]。因杉木的全基因組尚未獲得，使WRKY基因難以鑒定，但WRKY蛋白質具有高度保守的氨基酸序列WRKYGQK。根據(jù)測序已完成的模式植物擬南芥全基因組序列，利用高度保守的氨基酸序列WRKYGQK搜索擬南芥基因組編碼序列，結果表明，擬南芥具有74個WRKY基因。因為克隆的杉木W(wǎng)RKY基因與擬南芥WRKY44基因相似，所以將該基因命名為ClWRKY44基因。本研究以杉木W(wǎng)RKY基因為研究對象，運用RT-PCR技術以杉木嫩葉的cDNA為模板克隆杉木ClWRKY44轉錄因子，杉木的不同組織和其在不同非生物逆境脅迫處理下，利用實時熒光定量技術分析杉木ClWRKY44基因的表達特性，為后續(xù)開展調(diào)控杉木抗逆性的分子機制研究和進行杉木抗逆性的遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來源于福建省漳平市五一國有林場(117°29′E，25°02′N)的杉木1.5代種子園。于2018年12月種子成熟季節(jié)，收集飽滿、品質好的杉木種子，放置于4 ℃冰箱保存；菌株分別是大腸桿菌JM109G和DH5α；連接載體分別為pMD18-T和PENTR，其抗性標記為卡那霉素(Kna)和氨芐青霉素(Amp)。

1.2 試驗設計

于2018年12月開始試驗，杉木種子萌發(fā)實驗方法如下：①將成熟的杉木種子用0.1%(質量分數(shù))KMnO4溶液消毒3 h，去除空癟粒種子；②用滅菌水沖洗以徹底去掉殘留的KMnO4；③將種子放入45 ℃溫水(室溫自然冷卻)中浸泡24 h；④挑選飽滿的種子放入滅菌帶濾紙的培養(yǎng)皿中，擺放均勻，加水浸濕濾紙；⑤將培養(yǎng)皿放到光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h 25 ℃ 光/12 h 20 ℃暗，相對濕度為75%；⑥隨時觀察，去除發(fā)霉種子。

杉木種子萌發(fā)20 d后，將已萌發(fā)的杉木苗分別置于4 ℃和35 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)處理，杉木幼苗生長發(fā)育0、6、12、24、48 h時分別取其嫩葉為材料，0 h為對照，置于-80 ℃冰箱備用。取新的杉木種子萌發(fā)20 d后，配制5%(質量分數(shù))聚乙二醇(PEG)低濃度和25% PEG高濃度的溶液,分別加入已有萌發(fā)的杉木種子苗的培養(yǎng)皿中,放到同光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在5% PEG(低濃度)和25%PEG(高濃度)的溶液下處理，杉木幼苗生長發(fā)育0、6、12、24、48 h時分別取嫩葉為材料(0 h為對照)，置于-80 ℃冰箱備用。每個處理杉木幼苗6株，以保證生物學重復。

1.3 測定方法

1.3.1 杉木ClWRKY44基因克隆與實時熒光定量聚合酶鏈式反應

從NCBI的Gen Bank 數(shù)據(jù)庫查詢杉木的目標基因DNA 序列進行特異引物設計(表1)。采用TIANScript cDNA第1鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)對檢測合格的杉木總RNA模板進行逆轉錄第1鏈cDNA的合成，隨后把合成的cDNA稀釋10倍后再進行聚合酶鏈式反應(PCR)。PCR反應程序為：先94 ℃預變性 3 min；然后98 ℃變性30 s，55 ℃下退火30 s，68 ℃延伸1 min，共32循環(huán)；最后68 ℃再延伸7 min。將擴增產(chǎn)物經(jīng)1%(質量分數(shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測后，通過高效連接液Solution1連接到pDM18-T載體上。在微量離心管中加0.5 μL pDM18-T載體，1 μL PCR產(chǎn)物，1 μL DEPC水, 加2.5 μL(等量)的Solution1。在16 ℃下反應1 h，全量(5 μL)加入至JM109G感受態(tài)細胞中，冰中放置30 min。42 ℃加熱45 s后，再放冰上2 min，加入895 μL Soc培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)1 h，進行Amp抗性篩選。在次日隨機挑選陽性克隆進行搖菌，然后對其提取質粒并通過PCR檢測驗證，檢測結果正確后再進行測序，即是高效克隆載體PMD18-T-ClWRKY44。利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(q-PCR)來檢測ClWRKY44基因在不同組織的表達情況。實時熒光定量聚合酶鏈式反應的擴增試劑和熒光染料分別是SYBR Premix ExTaq和SYBR GreenⅠ(全式金生物技術有限公司，北京)，杉木的內(nèi)參基因是Actin基因[13]，先用普通PCR檢測體系的反應條件(退火溫度、模板量等)進行擴增反應，并將PCR產(chǎn)物進行測序，以保證q-PCR結果的準確性。通過內(nèi)參基因進行歸一化比較，根據(jù)目的基因杉木ClWRKY44和杉木內(nèi)參基因標準品的拷貝數(shù)與其相對應的循環(huán)閾值(cycles threshold，CT)，利用實時定量PCR和2-△△CT法[14]分析杉木ClWRKY44目的基因相對表達量。

表1 杉木ClWRKY44基因克隆及 q-PCR 反應中所用引物序列

1.3.2 ClWRKY44的生物信息學分析方法

將克隆ClWRKY44基因的PCR產(chǎn)物送至福州鉑尚生物工程技術有限公司進行測序，并用ClWRKY44基因的cDNA序列推導出其蛋白質序列。采用Phytozome V13(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)的Blast對測序結果進行同源性比對，并運用DNAMAN V9.0軟件對ClWRKY44基因的cDNA序列進行分析，推測得到其蛋白質編碼氨基酸序列，利用 TMHMM Server V.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線進行其蛋白質跨膜區(qū)預測。利用NCBI找出ClWRKY蛋白序列相近的其他物種的同源序列，并使用MEGA 6.0[15]中鄰位相連法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.3.3 ClWRKY44蛋白的亞細胞定位

將其PCR產(chǎn)物切膠回收，通過Gateway系統(tǒng)把ClWRKY44基因轉入pENTR載體和DH5α 大腸桿菌感受態(tài)細胞中，通過卡那霉素(50 mg/L)篩選后，挑取其12個單克隆搖菌并進行菌落PCR檢驗，選擇結果為陽性克隆且符合基因片段大小，可將其菌液提取質粒作為入門載體。通過Gateway技術的LR反應將ClWRKY44基因的融合產(chǎn)物插入到植物表達載體pGWB605上，轉化LR反應產(chǎn)物到大腸桿菌DH5α，從轉化的平板上挑取單克隆菌落經(jīng)壯觀霉素篩選進行菌落PCR驗證，挑取陽性菌落并搖菌提取質粒作為表達載體。運用凍融法將其質粒轉入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞中，進行PCR鑒定出陽性菌落，在對應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中加入陽性菌落進行震蕩培養(yǎng)過夜。將農(nóng)桿菌離心(4 000 r/min)20 min，去掉上清液，并將配置好的侵染液按比例調(diào)整菌液OD值為0.6～1.0；使用1 mL注射器將菌液緩慢滲透注射到煙草葉背面的葉片組織間隙中，在25 ℃條件下培養(yǎng)36～48 h后，取被侵染菌液的煙草葉片放在激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8x)下觀察，同時使用mCherry紅色熒光標記內(nèi)質網(wǎng)[16]。

2 結果與分析

2.1 ClWRKY44基因克隆

利用引物WRKY44-Fw和WRKY44-Rv，以杉木嫩葉的cDNA為模板進行PCR反應得到目的基因，通過1%(質量分數(shù))瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，該目的基因ClWRKY44的長度為1 776 bp，與預期目的基因ClWRKY44的長度相符(圖1)。

1、2.ClWRKY44 PCR產(chǎn)物product;M.marker.

2.2 ClWRKY44的生物信息學分析

2.2.1 ClWRKY44蛋白基本性質

杉木ClWRKY44使用ExPASy-ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)在線分析蛋白基本理化性質，推測杉木ClWRKY44蛋白的相對分子質量和理論等電點(IP)值分別為64 956.79和8.75，其正電荷殘基數(shù)和負電荷殘基數(shù)為80和73；該蛋白的理論推導半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)是51.09，其理論上脂肪系數(shù)是55.25且總平均親水性為-0.870，說明杉木ClWRKY屬于不穩(wěn)定蛋白。運用在線預測程序TMHMM對ClWRKY蛋白進行蛋白跨膜結構分析，從結果(圖2)可以看出，ClWRKY序列中沒有跨膜結構。

圖2 ClWRKY44基因的蛋白質跨膜結構

2.2.2 ClWRKY44蛋白氨基酸序列的疏水性

利用ExPASy-ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)在線分析預測ClWRKY44蛋白氨基酸序列的親水性/疏水性，當數(shù)值為負時，氨基酸為親水氨基酸；當數(shù)值為正時，氨基酸為疏水氨基酸，且數(shù)值的絕對值越大，親/疏水性越強。分析結果(圖3)可知，該編碼蛋白內(nèi)親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，在第4位處為正值最大值1.76，在第400位處為負值最小值(-3.69)，且疏水性氨基酸多分布在肽鏈的N-末端，親水性氨基酸多分布在肽鏈的C-末端。整體而言，ClWRKY44蛋白總疏水性為-503，由此推測該蛋白屬于親水性蛋白。

圖3 ClWRKY44蛋白氨基酸序列的疏水性分析

2.2.3 多序列對比

利用DNAMAN程序將ClWRKY蛋白序列與其他已知植物的蛋白序列進行同源比對分析，結果(圖4)發(fā)現(xiàn),ClWRKY44基因編碼蛋白與擬南芥(ArabidopsisthalianaTAIR10，At)、毛果楊(Populustrichocarpav3.0，Pt)、菠蘿(AnanascomosusV3.1，Aco)、水稻(Oryzasativav7_JGI，Os)基因的蛋白保守結構域一樣，都具有典型的第一類WRKY轉錄因子的特征，包括兩個WRKY結構域(WRKYGQK)和鋅指結構[HCX7CX23HXC(C2HC)],所以ClWRKY44編碼蛋白與水稻、擬南芥、菠蘿、毛果楊蛋白具有較高的同源性，可歸為一個小的類群，且它們都屬于WRKY轉錄因子家族第Ⅰ類成員(圖4)。

圖4 ClWRKY44基因與水稻、擬南芥、菠蘿和毛果楊蛋白的保守結構

2.2.4 ClWRKY44蛋白同源比對與進化樹的構建

運用 MEGA 6.0軟件對杉木ClWRKY44構建系統(tǒng)進化樹，將克隆到的ClWRKY44蛋白序列在Genbank中進行Blast比對，結果(圖5)表明，其與擬南芥、菠蘿、水稻、毛果楊4個物種中的17個WRKY蛋白序列相近，聚類分析并構建系統(tǒng)進化樹的結果顯示，ClWRKY44與擬南芥的ATWRKY44蛋白序列同源性為99%，兩者分布在一個小分支上，說明它們的親緣關系比較近，且同源性比較高，可能它們執(zhí)行的功能類似。此外，由于本試驗所克隆出的WRKY基因的編碼蛋白與ATWRKY44蛋白親緣關系為99%，故將此基因命名為ClWRKY44(圖 5)。

圖5 ClWRKY44系統(tǒng)進化樹

2.3 杉木ClWRKY44基因的表達分析

為了研究ClWRKY44在杉木中是否具有組織特異性表達，對杉木ClWRKY44基因在不同器官中的表達情況進行分析,結果(圖6)表明，杉木的根(R)、莖(S)、葉(L)3個器官均有WRKY44基因表達，且ClWRKY44基因在杉木葉中的相對表達量最高，莖中次之，在根中的相對表達量最低?？梢酝茰yClWRKY44基因與杉木木材生長發(fā)育的調(diào)控有密切關系。

*.P<0.05; **.P<0.01。下同。The same below.

2.4 杉木ClWRKY44蛋白在煙草中的亞細胞定位分析

采用農(nóng)桿菌介導法將構建好的杉木ClWRKY44基因載體導入煙草表皮細胞中，并在激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8X)下觀察。結果(圖7)顯示，其煙草含有轉化重組載體pGWB-35S-ClWRKY44-GFP的表皮細胞可以在細胞核中檢測到熒光，說明目的基因ClWRKY44主要定位在細胞核上。

a.具有 DYPI 標簽的細胞核marker nuclear marker with DYPI label；b.具有 GFP標簽的ClWRKY44基因ClWRKY44 gene with GFP label；c.明場bright field；d.3圖疊加的效果the three-picture superimposed effect.

2.5 不同脅迫處理下ClWRKY44 基因相對表達量分析

未經(jīng)處理萌發(fā)20 d后的幼苗,以及分別經(jīng)過4 ℃低溫處理48 h、35 ℃高溫處理48 h、5%(質量分數(shù))PEG低濃度干旱處理48 h、25%PEG高濃度干旱處理48 h的幼苗，其ClWRKY44基因相對表達量呈現(xiàn)不同程度的變化(圖8)。

對低溫處理過的幼苗的ClWRKY44基因相對表達結果分析表明，該基因在苗木耐低溫性中起到重要作用。從圖8a可知，與對照組相比，脅迫處理6 h 時，ClWRKY44基因在低溫脅迫處理的相對表達量最高，約是對照空白組的79.8倍；隨著低溫脅迫時間的延長，ClWRKY44基因的相對表達量顯現(xiàn)出下降的趨勢；當?shù)蜏孛{迫時間達到 48 h 時，相對表達量仍高于對照，是對照組的5.6倍。

圖8 不同脅迫下杉木ClWRKY44 基因相對表達量

對高溫脅迫處理下杉木幼苗的ClWRKY44基因相對表達結果(圖8b)分析可知，與對照空白組相比，該基因在高溫脅迫處理的相對表達量低于對照空白組，且隨著高溫脅迫時間的延長，ClWRKY44基因的相對表達量顯現(xiàn)出逐漸下降的趨勢；當高溫脅迫時間達到48 h時，ClWRKY44的相對表達量最小，說明ClWRKY44基因在低溫脅迫中起到調(diào)控的作用，在高溫脅迫中的調(diào)控作用不明顯。

ClWRKY44基因在低濃度干旱脅迫處理下杉木幼苗的相對表達結果(圖8c)表明，低濃度干旱脅迫處理24 h時，ClWRKY44基因的相對表達量比對照組略高?？傮w而言，ClWRKY44基因在低濃度干旱脅迫處理的相對表達量大多低于對照組，說明ClWRKY44基因對于低濃度干旱脅迫處理的響應不明顯。

ClWRKY44基因在高濃度干旱脅迫處理下杉木幼苗的相對表達結果(圖8d)顯示，與對照相比，高濃度干旱脅迫處理短時間(6 h)的ClWRKY44基因相對表達量約是對照組的32.9倍;當時間延長(12 h)時，ClWRKY44基因在高濃度干旱脅迫處理下的相對表達量最高，且約是對照組的46.6倍。隨著高濃度干旱脅迫時間的延長，ClWRKY44基因的相對表達量呈現(xiàn)出下調(diào)的趨勢，但直到脅迫時間達到48 h時，其仍高于對照空白組處理，是對照空白組的5.6倍。說明ClWRKY44基因在低濃度干旱脅迫中調(diào)控作用明顯有限，但是在高濃度干旱脅迫中能起到調(diào)控作用。

3 討 論

植物在干旱、低溫、高溫等極端條件下生長發(fā)育的過程中，自身形成了一套高效且有序的反應機制，是為了保護植物在生長發(fā)育過程中免受各種各樣的脅迫。這種有效的反應機制過程的有序進行需要不同的轉錄因子和信號轉導途徑來共同完成。隨著各種基因組學技術的發(fā)展，轉錄因子已成為植物基因功能研究的重點之一，目前為止，WRKY轉錄因子已在多個物種中得到挖掘、鑒定與功能分析。WRKY轉錄因子在生物脅迫應答方面和非生物脅迫(凍害、干旱和鹽害等)應答方面都具有重要的功能[17]。有研究表明,水稻和擬南芥受到極限溫度和干旱等非生物脅迫時會誘導WRKY基因表達，從而說明在調(diào)控植物逆境脅迫應答過程中WRKY轉錄因子可以發(fā)揮調(diào)控功能[1]。Northern 雜交分析表明,10/13OsWRKY基因分別對NaCl、聚乙二醇(PEG)或冷熱處理都能產(chǎn)生應答[18]。已有不少研究發(fā)現(xiàn)WRKY轉錄因子參與應對各種生物脅迫與非生物脅迫，例如低溫脅迫、鹽脅迫和干旱脅迫等。有研究表明，過表達的轉ZmWRKY106基因玉米(Zeamays)植株提高了對干旱和高溫脅迫的耐受性[19]，水稻OsWRKY71在應對冷害脅迫中起重要調(diào)控作用[6]，小麥(Triticumaestivum)TaWRKY44受干旱和低溫脅迫誘導表達[20]。同時有研究表明，WRKY 轉錄因子不僅參與植物對非生物脅迫的應答，還參與調(diào)控植物的激素信號通路以及生長發(fā)育,但關于杉木W(wǎng)RKY基因的研究相對較少。

本研究克隆的杉木ClWRKY44基因編碼的蛋白質序列與擬南芥ATWRKY44的同源性很高，且都包含兩個WRKY結構域與1個鋅指結構，都可歸為第Ⅰ類WRKY轉錄因子。系統(tǒng)進化樹分析表明該基因與ATWRKY44第Ⅰ類WRKY成員關系親近，且它與ATWRKY44的相似性為99%，將其命名為ClWRKY44。ClWRKY44在植物不同器官中的表達量不同，其在葉中高度表達，可以推測出ClWRKY44基因響應杉木嫩葉誘導表達。植物中除了ClWRKY44基因，還有類似WRKY基因家族，水稻、擬南芥、菠蘿、毛楊果在基因序列上具有部分同源，說明ClWRKY44基因可以有類似的基因功能。

采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)分析ClWRKY44基因對極限溫度和干旱等非生物脅迫因子的誘導表達，結果顯示，4℃低溫脅迫處理6 h,杉木ClWRKY44基因相對表達量最高，杉木種子芽在25%PEG高濃度干旱脅迫處理24 h時，ClWRKY44基因的相對表達量最高。前人研究發(fā)現(xiàn)，WRKY轉錄因子的上游調(diào)節(jié)基因和下游靶基因之間存在相互作用，擬南芥中的GI基因和miRNA172可以調(diào)控ATWRKY44基因表達，且可以進行互作形成GI-miRNA172-WRKY44，其可能是通過糖信號通路來調(diào)控擬南芥對干旱逆境的響應[21]，水曲柳(Fraxinusmandshurica)FmWRKY44基因積極響應低溫、高溫脅迫[22]。水曲柳和擬南芥在受到極限溫度和干旱等非生物脅迫時，會誘導其WRKY轉錄因子表達，說明WRKY轉錄因子在調(diào)控植物逆境脅迫應答過程中可以發(fā)揮功能。本研究中發(fā)現(xiàn)杉木ClWRKY44基因在低溫脅迫中起到調(diào)控作用，且在高濃度干旱脅迫中也能起到調(diào)控的作用，此結果為杉木幼苗生長發(fā)育的生態(tài)適應性提供理論參考。