雙氫青蒿素對大鼠肝纖維化損傷的緩解作用及對Nrf2/HO-1通路的影響*

史艷偉 米彩鋒 牛麗林 李晶晶

1.平頂山市第一人民院消化內(nèi)科 (河南 平頂山， 467000) 2.鄭州大學

肝纖維化是肝臟對多種因素所致肝損傷的傷口愈合反應(yīng)，肝臟中活化的成纖維細胞通過分泌細胞外基質(zhì)蛋白，產(chǎn)生纖維性瘢痕，可發(fā)展為肝硬化，是肝硬化早期的可逆階段，如果不及時預(yù)防和治療，可能發(fā)展為肝癌和肝衰竭[1,2]。肝纖維化損傷是慢性肝病患者發(fā)病和死亡的主要原因，約占肝癌患者死亡率的50%[3,4]。因此，有效抑制肝纖維化發(fā)生、發(fā)展對肝病患者的臨床治療具有重要意義。青蒿素是從青蒿中分離的一種天然倍半萜烯內(nèi)酯，具有抗瘧、抗血管生成、抗癌和化療增敏等藥理作用[5]。雙氫青蒿素(DHA)是青蒿素的主要活性代謝產(chǎn)物，在抗組織纖維化和抗神經(jīng)元細胞死亡中發(fā)揮作用[6]。目前，DHA應(yīng)用于肝纖維化的治療研究較少，本研究擬通過建立肝纖維化大鼠模型，探討DHA對大鼠肝纖維化損傷的緩解作用及對Nrf2/HO-1通路的影響，為DHA相關(guān)藥物的研發(fā)和肝纖維化的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠55只，雌鼠27只，雄鼠28只，8周齡，體質(zhì)量240～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0011。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25℃，相對濕度55%～65%，亮暗循環(huán)時間比1∶1，自由飲食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2 藥品、主要試劑和儀器 DHA(HPLC≥98%)購自北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒均購自南京建成科技有限公司；兔抗大鼠核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)抗體、血紅素加氧酶-1(HO-1)抗體、β-actin抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG均購自英國Abcam公司；全自動生化分析儀及配套試劑購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；多功能酶標儀購自美國Molecular Device公司。

1.3 建立大鼠肝纖維化模型[7]45只大鼠實驗前禁食0.5 d，腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，消毒后行上腹正中切口，抬高肝臟邊緣，撥開十二指腸，分離膽總管約3 cm，穿刺可抽出膽汁證實，于近肝門和十二指腸處使用2號絲線各結(jié)扎2次，從中間剪斷膽總管。術(shù)后正常飲水、進食，肌肉注射青霉素，1次/d，共3 d預(yù)防感染、鼠毛無光澤、皮膚黃染、體質(zhì)量減輕等情況發(fā)生，當肝臟病理觀察顯示存在纖維化表現(xiàn)，提示造模成功。另外10只大鼠僅分離總膽管不進行結(jié)扎作為假手術(shù)組。

1.4 分組及藥物干預(yù) 將造模成功的41只大鼠(有4只大鼠在造模過程中死亡)按隨機數(shù)字表法分為模型組(11只)、DHA低劑量組(10只)、DHA中劑量組(10只)、DHA高劑量組(10只)。造模成功24 h后，DHA低、中、高劑量組大鼠分別給予5 mg/kg、15 mg/kg和25 mg/kg DHA(無菌生理鹽水配制)灌胃，1次/d，連續(xù)14 d。假手術(shù)組、模型組大鼠灌胃等量無菌生理鹽水。

1.5 大鼠肝功能檢測 末次給藥后24 h，取各組大鼠腹主動脈血，室溫靜置1 h，3 000 rpm(離心半徑10 cm)離心10 min，取上清液采用全自動生化分析儀及配套試劑檢測樣品中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBil)水平。

1.6 大鼠肝組織生化指標檢測 采血完畢，頸椎脫臼法處死大鼠，無菌解剖取出肝臟，于4℃預(yù)冷的生理鹽水中清洗后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?00 mg肝臟組織加900 μl預(yù)冷的生理鹽水，使用勻漿器在冰上制作肝組織勻漿，4 000 rpm(離心半徑10 cm)離心10 min，取上清液檢測肝組織勻漿中SOD、GSH-Px和MDA水平。

1.7 HE染色觀察大鼠肝組織病理學變化 取部分肝臟組織，4%多聚甲醛4℃固定24 h，PBS清洗3次，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，組織切片(厚度約5 μm)，二甲苯脫蠟，蘇木素、伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察大鼠肝臟組織病理學變化。

1.8 Masson染色觀察大鼠肝纖維化 石蠟切片用二甲苯脫蠟，Bouin液在37℃溫箱中媒染2 h，蒸餾水沖洗至切片上黃色消失，天青石藍染色液、Mayer染色液依次滴染，酸性乙醇分化，麗春紅品紅染色液滴染，蒸餾水漂洗后磷鉬酸溶液處理10 min，苯胺藍染色液染色5 min，弱酸溶液處理，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察拍照。

1.9 Western Blot檢測肝組織Nrf2/HO-1通路蛋白表達水平 取100 mg冷凍肝臟組織，研磨后加RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度，蛋白變性，10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，目的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入Nrf-2(1∶500)、HO-1(1∶1 000)，β-actin(1∶1 000)抗體，4℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次，再加入HRP標記二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，加入ECL化學發(fā)光液發(fā)光，暗室中曝光顯影，實驗重復(fù)3次，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量，目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝功能指標檢測結(jié)果 見表1。

表1 各組大鼠肝功能結(jié)果比較

2.2 各組大鼠肝組織SOD、GSH-Px活性和MDA水平 見表2。

表2 各組大鼠肝組織SOD、GSH-Px活性和MDA水平比較

2.3 各組大鼠肝臟HE染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞排列有序，形態(tài)規(guī)則；模型組大鼠肝細胞壞死，發(fā)生脂肪變性，排列紊亂，肝細胞間隙有炎性浸潤；DHA低、中、高劑量組大鼠較模型組肝組織損傷明顯減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)均有不同程度恢復(fù)，較少肝細胞脂肪變性，炎性浸潤不同程度減輕。見圖1。

圖1 肝臟組織HE染色圖 (HE，×200)A：假手術(shù)組；B：模型組；C：DHA低劑量組；D：DHA中劑量組；E：DHA高劑量組

2.4 各組大鼠肝組織Nrf2/HO-1通路相關(guān)蛋白表達水平 見表3。

表3 各組大鼠肝組織Nrf2、HO-1蛋白表達水平比較

2.5 Masson染色觀察結(jié)果 假手術(shù)組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞索排列整齊，肝竇及匯管區(qū)可見膠原纖維，幾乎無彌漫增生的膠原纖維；模型組大鼠匯管區(qū)周圍膠原纖維明顯增生并向四周延伸，延伸至鄰近肝小葉形成纖維間隔，多數(shù)纖維間隔完全包裹肝細胞團形成假小葉結(jié)構(gòu)；DHA低、中、高劑量組大鼠較模型組大鼠匯管區(qū)周圍膠原纖維增生明顯減輕，纖維間隔變小，假小葉結(jié)構(gòu)不明顯，其中DHA高劑量組大鼠肝臟幾乎未見膠原纖維組織增生及假小葉結(jié)構(gòu)。見圖2。

圖2 各組大鼠肝臟組織Masson染色圖 (HE,×400)A：假手術(shù)組；B：模型組；C：DHA低劑量組；D：DHA中劑量組；E：DHA高劑量組

2.6 各組大鼠肝組織Nrf2/HO-1通路蛋白表達情況 見圖3。

圖3 各組大鼠肝組織Nrf2/HO-1通路相關(guān)蛋白表達圖 A：假手術(shù)組；B：模型組；C：DHA低劑量組；D：DHA中劑量組；E：DHA高劑量組

3 討論

慢性肝損傷的過度修復(fù)導致肝纖維化，其特征在于細胞外基質(zhì)蛋白的過度積累，纖維化是一個動態(tài)過程，涉及實質(zhì)細胞(肝細胞)、肝星狀細胞、竇狀內(nèi)皮細胞和浸潤免疫細胞等之間的相互串擾，晚期肝纖維化會導致肝硬化、門靜脈高壓和肝功能衰竭，是肝癌的主要危險因素[8]?？垢卫w維化的機制包括減輕肝臟炎癥反應(yīng)，抗脂質(zhì)過氧化損傷，抑制肝星狀細胞的激活和增殖，調(diào)節(jié)纖維化因子的合成和分泌以及調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的合成和降解[9]?？垢卫w維化治療首先在于抑制肝纖維化發(fā)展，進而逆轉(zhuǎn)肝纖維化，改善患者肝臟結(jié)構(gòu)和功能，延緩肝硬化失代償期發(fā)生，延長患者生存期等。目前，肝纖維化的臨床治療方法包括病因治療(抗乙型肝炎病毒等)、抗炎治療、免疫調(diào)節(jié)治療、靶向治療、干細胞移植及中藥治療等[10,11]。其中，中草藥可有效抑制肝臟的病理性血管生成和肝纖維化發(fā)生，改善肝臟微循環(huán)，并降低肝硬化患者胃腸道出血等[12]。

青蒿素及其衍生物(如DHA)是我國傳統(tǒng)的抗瘧疾治療劑，藥理學研究表明，其具有抗寄生蟲，抗菌，抗癌和抗纖維化的作用[13]。Huang等[14]研究顯示，DHA通過抑制Nrf2介導的巨噬細胞核因子-κB活化，對脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷發(fā)揮治療作用。Zhang等[15]研究表明，DHA可誘導大鼠纖維化肝中活化的肝星狀細胞發(fā)生衰老、自噬。Zhang B等[16]研究發(fā)現(xiàn)，DHA可以通過抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路調(diào)節(jié)成纖維細胞的增殖與分化從而緩解小鼠腎纖維化。本研究建立大鼠肝纖維化模型，經(jīng)DHA干預(yù)后檢測肝纖維化損傷相關(guān)指標顯示，低、中、高劑量DHA治療后大鼠血清ALT、AST、TBil水平降低，肝組織SOD、GSH-Px活性升高，MDA水平降低，肝纖維化損傷程度明顯減輕，提示DHA可減輕肝組織氧化應(yīng)激損傷，改善肝纖維化大鼠肝功能，對大鼠肝纖維化損傷具有緩解作用。

Nrf2是一種廣泛存在且進化上保守的細胞內(nèi)氧化應(yīng)激防御分子,正常狀態(tài)下，Nrf2被細胞質(zhì)的Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap1)隔離并在堿性條件下靶向蛋白酶體降解，在氧化應(yīng)激的狀態(tài)下，Nrf2從Keap1上解離并轉(zhuǎn)移至細胞核，與Maf蛋白形成異源二聚體，識別抗氧化反應(yīng)元件(Nrf2靶基因調(diào)節(jié)區(qū)域的增強子序列)，調(diào)控抗氧化相關(guān)基因的表達，提高SOD、GSH-Px的活性，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[17,18]。Li等[19]研究顯示，miR155抑制劑可通過增強Nrf2/HO1信號通路預(yù)防線粒體損傷和心肌細胞凋亡，從而改善糖尿病性心肌纖維化。Huai等[20]研究表明，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ通過激活Nrf2/NQO1/HO-1途徑減輕博萊霉素誘導的大鼠實驗性肺纖維化并其降低氧化應(yīng)激水平。Khadrawy SM等[21]研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞可通過激活Nrf2/HO-1信號通路改善大鼠肝纖維化、炎癥并降低氧化應(yīng)激水平。本研究結(jié)果顯示，肝纖維化大鼠經(jīng)低、中、高劑量DHA干預(yù)后，肝組織Nrf2、HO-1蛋白表達水平升高，提示DHA可以激活Nrf2/HO-1信號通路。

綜上所述，DHA對大鼠肝纖維化損傷具有明顯緩解作用，可激活Nrf2/HO-1信號通路。為DHA相關(guān)藥物的研發(fā)及應(yīng)用于肝纖維化的臨床治療提供理論支持。