UPLC-MS/MS測定海帶中酰胺醇類藥物殘留

陳建南

福建中檢華日食品安全檢測有限公司（福州 350028）

酰胺醇類藥物又稱氯霉素類藥物，其主要有氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，主要治療畜禽及水產(chǎn)動物細菌性疾病，因此被廣泛用于畜禽和水產(chǎn)品養(yǎng)殖行業(yè)[1]。其中，氯霉素在使用過程會出現(xiàn)致命的灰嬰綜合征和再生障礙性貧血癥[2-3]，因此被我國及其他一些國家和地區(qū)禁止使用。隨著氯霉素的禁用，甲砜霉素和氟苯尼考成為在治療水產(chǎn)動物細菌性疾病的主力軍。海帶不僅營養(yǎng)價值高且具有一定藥用價值，是人們經(jīng)常食用的植物，但是，它們可以吸收富集在周圍環(huán)境的抗生素，因此為防止海帶中的酰胺醇類藥物對人體健康造成危害，建立海帶中氯霉素殘留量的有效檢測方法顯得尤為重要。

酰胺醇類藥物的分析手段主要有氣相色譜法、高效液相色譜法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用色譜法[4-9]。由于氣相和液相色譜不僅靈敏度不夠、定性能力差且前處理方法較繁瑣，而高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用色譜法具有靈敏度較高、無需衍生化、檢測時間短等特點。QuEChERS法[10-11]、固相萃取法[12]、加速溶劑萃取法[13]是酰胺醇類藥物的前處理手段。固相萃取法步驟較繁瑣，加速溶劑萃取法所用到儀器較貴且需要時間較長，而QuEChERS法操作具有簡便、時間短、試劑用量少等特點。目前，關(guān)于酰胺醇類藥物在海帶中的殘留分析尚未被報道。

試驗采用QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立海帶中的酰胺醇類藥物殘留分析方法。同時探究該方法中提取劑和凈化劑對檢測結(jié)果的影響，以期為海帶中酰胺醇類藥物殘留量的檢測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

乙腈和甲醇（色譜純，默克公司）；甲酸和乙酸（美國Fisher公司）；試驗用水為超純水；N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）和石墨化碳黑（GCB）：均為天津Agela公司；氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考（德國Dr.Ehrenstorfer公司）。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、C18色譜柱（美國Agilent公司）；多管渦旋混勻儀（逗點生物技術(shù)有限公司）；Direct-Q3超純水機（美國Millipore公司）；TDL-5C-PRP低高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），N-EVAP-12氮吹儀（美國Organomation公司）；3k15高速離心機（美國Sigma公司）。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取適量的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考標準品，甲醇為溶劑，定容于3個50 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度200 μg/mL的母液，各取0.4 mL于50 mL容量瓶中配得1.0 μg/mL的儲備液，采用系列稀釋法分別配制質(zhì)量濃度為0.50，1.00，2.00，5.00，10.00和20.00 ng/mL標準工作溶液，于-18 ℃避光保存。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；流動相A，10%甲醇純水；B甲醇，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件：離子源采用ESI源，掃描方式采用負離子模式，毛細管電壓3.0 kV，離子源溫度350 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，錐孔反吹氣流量50 L/h，脫溶劑氣流量900 L/h，駐留時間為60 ms，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

1.4 樣品前處理

準確稱10.0 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL離心管中，添加氯霉素內(nèi)標、10 mL乙腈和2 g 氯化鈉，加入1顆陶瓷均質(zhì)子，加蓋振搖，在3 500 r/min條件下的離心機內(nèi)離心5 min，取3.0 mL上清液轉(zhuǎn)移至5.0 mL的離心管（300 mg無水硫酸鎂、100 mg C18、100 mg PSA和50 mg GCB）中，高速離心后，取1.0 mL于40 ℃溫度下氮吹至干，加入1.0 mL甲醇水（3+7，V/V）復(fù)溶，過0.22 μm有機濾膜，上機檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

為保證試驗結(jié)果的準確性，對分析物的母離子、子離子、碰撞能等質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化。采用Q1 Scan方式獲取待測物的母離子，在SIM模式下對母離子的去簇電壓進行優(yōu)化。進行Product Ion掃描，得到2個響應(yīng)較大的子離子，對子離子進行碰撞能量優(yōu)化，從而優(yōu)化質(zhì)譜條件，采用MRM模式對待測物的駐留時間進行優(yōu)化，使每個化合物的采集點約在15個點左右。在上述優(yōu)化的LC-MS/MS條件下，質(zhì)量濃度為1.0 μg/L的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，TIC圖譜如圖1所示。

圖1 標準溶液中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的總離子流色譜圖

2.2 提取劑的優(yōu)化

乙腈、甲醇和乙酸乙酯是酰胺醇類藥物常用的提取劑，添加2 μg/kg的混標對3種溶劑的提取效率進行考察。試驗結(jié)果表明，水與甲醇無法分開，提取溶液顏色較深；乙酸乙酯可與水分離，但是提取色素較多不利于后續(xù)的凈化；乙腈為提取劑時，回收率在80.5%～102%之間，加入氯化鈉后可與水分層且提取的色素較少，故選乙腈作為提取劑。

2.3 凈化劑的選擇

PSA、C18和GCB為常用凈化劑，PAS可有效去除掉基質(zhì)中的有機酸、金屬離子和部分糖等物質(zhì)，C18去除非極性化合物，GCB可去除一些非極性色素。探究PSA、GCB和C18用量對酰胺醇類藥物回收率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PSA和C18為100 mg時，回收率為80.9%～110%，但是上機液的顏色較深；GCB為50 mg時，3種化合物的回收率在90.7%～103%之間，且樣品比較澄清。因此采用100 mg PSA、100 mg C18，50 mg GCB作為混合凈化劑。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

物質(zhì)在檢測的時不可避免受到基質(zhì)效應(yīng)影響[14]。對于液質(zhì)來說，主要是因為雜質(zhì)與目標物在離子化的過程中發(fā)生競爭[15]。為確保試驗結(jié)果的準確性，對基質(zhì)效應(yīng)進行研究。以測定空白海帶提取液與溶劑相同的濃度的響應(yīng)比值作為評價基質(zhì)效應(yīng)（ME），當ME越偏離1.0時，基質(zhì)效應(yīng)越大，越接近1.0時，基質(zhì)效應(yīng)越小[16]。結(jié)果表明，氯霉素、甲砜霉素與氟苯尼考的比值分別為0.92，0.94和1.05，這3個化合物受基質(zhì)效應(yīng)較小。

2.5 標準曲線、檢出限和定量限

用甲醇水（3+7，V/V）稀釋儲備液配制成質(zhì)量濃度分別為0.50，1.00，2.00，5.00，10.00和20.00 ng/mL的混合標準溶液作標準曲線，以濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），繪制校準曲線。結(jié)果如表3所示，氯霉素、甲砜霉素與氟苯尼考在0.50～20 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r＞0.999，在空白樣品中添加，以信噪比（rSN）=3檢出限（rLOD），以最小的添加濃度為定量限（rLOQ），氯霉素、甲砜霉素與氟苯尼考的rLOD分別為0.54，0.12和0.07 μg/kg，rLOQ為1.0 μg/kg。

表3 氯霉素、甲砜霉素與氟苯尼考的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.6 準確度和精密度

分別選取不同基質(zhì)樣品，進行1.0，5.0和10.0 μg/kg的三水平加標試驗，結(jié)果見表4。氯霉素、甲砜霉素與氟苯尼考在不同基質(zhì)的3水平加標回收試驗中：氯霉素回收率為87.8%～103.4%，SRSD為2.6%～6.7%；甲砜霉素回收率為89.1%～109.5%，SRSD為3.4%～9.5%；氟苯尼考回收率為89.5%～108.3%，SRSD為2.1%～7.3%。結(jié)果表明，該方法具有較高的準確度和精密度。

表4 氯霉素、甲砜霉素與氟苯尼考的回收率和精密度（n=6）

2.7 實際樣品檢測

從市場上購買20批次海帶，并按該試驗方法進行檢測。結(jié)果顯示，某一批次海帶中檢測出氯霉素，質(zhì)量分數(shù)為2.0 μg/kg，其余批次均無檢出。

3 結(jié)論

試驗建立QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定海帶中酰胺醇類藥物的方法，該方法基質(zhì)效應(yīng)較弱，準確度和精密度較高，方法簡便和高效，有望為海帶中酰胺醇類藥物的檢測提供技術(shù)支持。