基于LC-MS的不同年份葛根茯苓酵素有機(jī)成分的比較

張國棟，李旭東，楊琴，黃武軍，徐向榮

1.江西農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院（樟樹 331200）；2.仁和集團(tuán)發(fā)展有限公司（樟樹 331200）；3.江西仁仁健康產(chǎn)業(yè)有限公司（樟樹 331200）

食用植物酵素是以可用于食品加工的植物為主要原料，添加或不添加輔料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分可供人類食用的酵素產(chǎn)品[1]。根據(jù)《酵素產(chǎn)品分類導(dǎo)則》，酵素根據(jù)原料分為植物酵素、動物酵素、菌類酵素，植物酵素又分為果蔬酵素如蘋果酵素、葡萄酵素等，植物干制品制得的酵素如紅棗酵素、枸杞酵素等，動物酵素如阿膠酵素、魚蛋白酵素，菌類酵素如銀耳酵素、蛹蟲草酵素等[2]。

葛根茯苓酵素是以葛根、茯苓、羅漢果、龍眼肉、紅棗、枸杞子、甘草等藥食同源中藥材為原料，通過水提后經(jīng)乳酸菌、酵母和醋酸菌等可食用菌種復(fù)合發(fā)酵而成的一款植物飲料，經(jīng)人群長期食用和相關(guān)文獻(xiàn)證明，具有解酒護(hù)肝、解油膩、潤腸通便的作用[3]。

葛根茯苓酵素在生產(chǎn)過程中會依照酒、醋等發(fā)酵產(chǎn)品一樣，發(fā)酵完畢后進(jìn)行一定時間的陳放再灌裝進(jìn)行銷售[4]，陳放后的酵素氣味更加濃郁，口感更加柔和，但陳放對酵素的化學(xué)成分影響如何，尚未見相關(guān)研究報(bào)道。

葛根茯苓酵素為中藥材復(fù)方，其成分復(fù)雜，經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化后復(fù)雜程度更高，采用傳統(tǒng)的分離、提取、純化后再鑒定的方法來分析其成分耗時耗力，且難以發(fā)現(xiàn)其中痕量成分。近年來，色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，LC-MS技術(shù)已成為鑒定未知化合物的有效手段[5]。高分辨質(zhì)譜可以提供化合物的準(zhǔn)確分子量，根據(jù)化合物的多級質(zhì)譜信息、保留時間結(jié)合相應(yīng)的文獻(xiàn)和化合物數(shù)據(jù)庫，可以快速鑒定出溶液中的成分。試驗(yàn)使用LC-MS對不同陳放時間的葛根茯苓酵素的化學(xué)成分進(jìn)行比較分析，以期揭示陳放對葛根茯苓酵素化學(xué)成分的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根茯苓酵素（江西仁仁健康產(chǎn)業(yè)有限公司）。乙腈（ACN，質(zhì)譜純，德國Merck公司）；甲酸（FA，色譜純，美國Acros公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm，Hypersi Gold aQ）；色譜儀（賽默飛，UltiMate 3000 UHPLC）；質(zhì)譜儀（賽默飛，Q Exactive Focus）。

數(shù)據(jù)處理軟件：Compound Discoverer，MassFrontier，Trace Finder。

數(shù)據(jù)庫：中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，mzCloud，Chem Spider。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

樣品經(jīng)0.2 μm濾膜過濾進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量5 μL，紫外檢測器波長254 nm；色譜柱Hypersi Gold aQ（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），進(jìn)樣室溫度10 ℃，柱溫30 ℃；流動相A為0.1%甲酸乙腈溶液，流動相B為0.1%的甲酸水溶液，洗脫條件：0～42 min，100% B；42～48 min，5% B；48～51 min，100% B。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源為HESI源，正負(fù)離子檢測模式，鞘氣流速設(shè)定40 arb，輔助氣流速10 arb；噴霧電壓3 500/3 200 V；離子傳輸管溫度320 ℃；輔助氣溫度350 ℃；掃描模式Full MS/dd-MS2，F(xiàn)ull MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500，掃描范圍m/z100～1 500，50～750。MS/MS模式時，碰撞能40 eV。

2 結(jié)果與分析

2016年份和2018年份的葛根茯苓酵素的紫外色譜圖見圖1和圖2，正負(fù)離子同時采集譜圖分別見圖3和圖4。如圖1和圖2所示，因酵素中成分復(fù)雜，各峰之間的分離度相對來說較差。

圖2 2018年份葛根茯苓酵素紫外色譜圖

圖3 2016年份葛根茯苓酵素正負(fù)離子同時采集譜圖

圖4 2016年份葛根茯苓酵素正負(fù)離子同時采集譜圖

根據(jù)LC-MS結(jié)果與數(shù)據(jù)庫比對，2個年份檢出的成分如表1所示。

根據(jù)數(shù)據(jù)庫匹配，2個年份的葛根茯苓酵素共檢出171種物質(zhì)，推測物質(zhì)如表1所示。這些物質(zhì)種類繁多，有黃酮類、氨基酸及其衍生物類、生物堿類、有機(jī)酸類、酯類、含氮類、醛酮類、還有脂肪類等，表明該葛根茯苓酵素成分復(fù)雜，各種來源于原料的成分和發(fā)酵所產(chǎn)生的初級代謝產(chǎn)物眾多。這些物質(zhì)中，數(shù)量最多的為有機(jī)酸類，這與酵素為發(fā)酵產(chǎn)物，主要代謝產(chǎn)物為有機(jī)酸相符，其后依次為黃酮類和氨基酸及其衍生物。

表1 2016和2018年份葛根茯苓酵素檢出的成分及其峰面積

在2016年份和2018年份峰面積占比超過1%的物質(zhì)有大豆素、DL-4-羥基苯乳酸、2-異丙基蘋果酸、2-羥基己酸、3-苯基乳酸、琥珀酸、3-羥基-3-甲基甘氨酸、5-羥甲基-2-糠醛、2-羥基-2-甲基丁酸、惕格酸、L-蘇氨酸、蘋果酸、DL-乳酸、α-羥基戊二酸、戊烯二酸。由表2可知，2016年份的含量最多的3種主要成分分別為乳酸、琥珀酸和惕格酸，2018年份的為DL-乳酸、琥珀酸和3-苯基乳酸。相比較而言，2018年份中檢出的物質(zhì)更多，在2016年份中檢出的而2018年份中未檢出的有6種，而在2018年份中檢出而2016年份中未檢出的有19種。對比2個年份酵素的物質(zhì)總體含量，其主要成分相似，微量成分略有差異。

表2 2016和2018年份酵素中成分種類

接表1

3 結(jié)論

酒、醋等在陳釀過程中，其所含成分會發(fā)生一定變化，如酒中的醇酸反應(yīng)生產(chǎn)酯使酒的陳釀香氣更加濃郁，酒中的乙醇分子重排使酒的口感變得更柔和[6]。酵素在陳放過程中風(fēng)味會發(fā)生一定的變化，刺激性氣味減弱，口感變得柔和，但根據(jù)質(zhì)譜分析結(jié)果，2個不同年份的葛根茯苓酵素主要成分基本相同，僅在微量成分上具有一定差異。因此該風(fēng)味上的變化可能是微量成分所致，或者發(fā)酵中所發(fā)生的并非化學(xué)變化，僅為物理變化。

葛根茯苓酵素因其為復(fù)方，通過LC-MS檢測發(fā)現(xiàn)，該酵素含有非常多的有機(jī)物成分，這些有機(jī)成分有些是來自于中藥材本身，有些是中藥材成分在經(jīng)過微生物的轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生，有些是微生物新產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，如各種有機(jī)酸、氨基酸等[7]，通過這些成分的共同作用，產(chǎn)生抗氧化、促進(jìn)消化，改善腸道微生態(tài)等功效，對身體有比較高的保健價值。隨著近年來我國酵素產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，以及我國中醫(yī)藥行業(yè)的深入發(fā)掘，中藥材草本酵素具有較大的發(fā)展空間，對于草本酵素的研究也會更加深入。