C30色譜柱HPLC法分析測(cè)定蔬菜中阿維菌素殘留量

林洋，郁蕉竹，許文雅，張宏宏，王韻，劉瀛

沈陽食品藥品檢驗(yàn)所（沈陽 110136）

阿維菌素類藥物（avermectins，AVMs）是由鏈霉素產(chǎn)生的一組十六元環(huán)內(nèi)酯雙糖類化合物，是經(jīng)過微生物發(fā)酵、提取的新型抗生素類殺蟲殺螨劑，對(duì)螨類和昆蟲具有胃毒和觸殺作用，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)廣泛應(yīng)用的一種抗寄生蟲農(nóng)藥[1-3]。關(guān)于阿維菌素的檢測(cè)方法國(guó)內(nèi)外已有大量報(bào)道，張紅艷等[4]建立甲醇提取測(cè)定黃瓜中阿維菌素殘留量。王曉菁等[5]建立酸性乙腈溶液提取來分析枸杞中阿維菌素殘留量。此外阿維菌素檢測(cè)方法還有液質(zhì)聯(lián)用法[6-11]、高效液相色譜熒光法[12-14]，但液相質(zhì)譜法運(yùn)營(yíng)成本相對(duì)較高，而熒光法前處理又較為復(fù)雜繁瑣，穩(wěn)定性差。檢測(cè)阿維菌素殘留量大多使用GB 23200.19—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 水果和蔬菜中阿維菌素殘留量的測(cè)定 液相色譜法》，采用C18色譜柱進(jìn)行色譜分離，但此方法對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的蔬菜樣品的測(cè)定雜質(zhì)干擾問題較為嚴(yán)重，主峰與雜質(zhì)峰分離效果不理想[15]。在液相色譜檢測(cè)阿維菌素殘留量中采用C30色譜柱進(jìn)行色譜分離的方法鮮有報(bào)道，試驗(yàn)選用乙腈作為提取溶劑替代國(guó)標(biāo)中的丙酮提取，選用C30色譜柱進(jìn)行色譜分離，通過優(yōu)化色譜條件，減少蔬菜基質(zhì)中雜質(zhì)峰的背景干擾，從而提高方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，優(yōu)化阿維菌素的高效液相色譜檢測(cè)方法，為同行業(yè)蔬菜中阿維菌素殘留量的測(cè)定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；氯化鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)制藥有限公司）；阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品（100 mg/L，安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；C18固相萃取柱（60 mg，3 mL，安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；Athena C30色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；試驗(yàn)用水均為一級(jí)水；菠菜、大白菜、蘿卜、馬鈴薯、豇豆、小白菜（市購）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀（配2998二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司）；超聲波清洗儀（KQ-250DB，昆山市超聲儀器有限公司）；德國(guó)IKA渦旋混合器；高速冷凍離心機(jī)（H1750R，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；萊伯泰科多通道平行濃縮儀（M64）；常熟雙杰電子天平（JJ600）；Milli-Qreference純水機(jī)（Millipoer SAS公司）；移液器（20～200 μL，705878及100～1 000 μL，705880，普蘭德公司）。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 樣品前處理

蔬菜樣品采用四分法取樣，經(jīng)粉碎機(jī)絞碎后均勻混合，準(zhǔn)確稱取10.00 g均勻試樣于具塞塑料離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩，超聲提取30 min，加入3～4 g氯化鈉，振蕩搖勻，按10 000 r/min離心5 min，取上清液于離心管中，用10 mL乙腈重復(fù)提取1次，合并提取液。在40 ℃水浴下氮吹近干。加入1 mL甲醇復(fù)溶，渦旋溶解，加入3 mL水渦旋混勻待凈化。將固相萃取柱依次用5 mL甲醇活化、5 mL水平衡，將上述溶液完全轉(zhuǎn)入C18固相萃取柱，用5 mL水淋洗小柱，棄去全部淋洗液，最后用5 mL甲醇洗脫并抽干，收集洗脫液，用氮?dú)獯抵两?。?zhǔn)確加入0.5 mL甲醇溶解殘?jiān)?，?.22 μm有機(jī)濾膜過濾，濾液供液相色譜測(cè)定，外標(biāo)法定量。

1.3.2 色譜條件

色譜柱C30柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（85∶15，V/V）；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm；進(jìn)樣量20 μL；柱溫35 ℃；檢測(cè)器采用二極管陣列檢測(cè)器。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確移取0.050，0.075，0.100，0.200和0.500 mL質(zhì)量濃度為100 mg/L的阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，加甲醇定容到刻度，輕搖混勻，標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液中阿維菌素的質(zhì)量濃度分別為0.50，0.75，1.00，2.00和5.00 mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的選擇與比較

2.1.1 提取溶劑的選擇

已報(bào)道的阿維菌素提取溶劑有丙酮[16]、甲醇[17]、乙酸乙酯[18]和乙腈[19-20]溶液等，提取方式包括超聲、渦旋、振蕩或均質(zhì)等，試驗(yàn)分別采用丙酮、乙腈、甲醇作為提取劑對(duì)樣品進(jìn)行超聲提取，發(fā)現(xiàn)甲醇和丙酮作為提取劑時(shí)基質(zhì)干擾較多，且樣品中水分對(duì)下一步凈化效果也有影響，因此試驗(yàn)方法采用乙腈提取，并加入氯化鈉進(jìn)行鹽析來分離水相有機(jī)相，促進(jìn)目標(biāo)分析物與有機(jī)相融合，該方法有較高提取率同時(shí)也減少樣品中雜質(zhì)的提出；且國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中使用的丙酮提取劑屬易致毒易致爆溶劑，而乙腈毒性和安全性相對(duì)丙酮較小。因此通過綜合操作安全性簡(jiǎn)便性、提取效率和凈化效果方面，最終選用乙腈作為提取劑。

2.1.2 凈化方法的比較

常見凈化方法有液-液萃取法、固相萃取小柱凈化法等，由于蔬菜樣品提取液色澤較深，基質(zhì)干擾較多，含有大量色素、有機(jī)質(zhì)和鹽類，選取最優(yōu)的分離純化方法會(huì)在最大程度降低樣品基質(zhì)干擾，提高分析方法的準(zhǔn)確性和精密度。試驗(yàn)分別測(cè)試直提后上樣、C18固相萃取凈化柱、氨基柱、氧化鋁層析柱的凈化方法，其中乙腈提取后直接上樣基質(zhì)干擾嚴(yán)重，氧化鋁層析柱和氨基柱對(duì)基質(zhì)除雜和回收效果均不理想；試驗(yàn)對(duì)比待凈化液中甲醇含量對(duì)回收效果影響，甲醇含量分別為20%，25%和30%時(shí)上樣凈化的回收率分別為95.2%，97.6%和96.2%，其中用25%甲醇含量的待凈化液過凈化柱回收率最高。因此該方法采用甲醇含量25%的待凈化液過C18固相萃取柱進(jìn)行凈化。

2.2 色譜條件的選擇與比較

使用的C18色譜柱大多數(shù)都是使用單官能團(tuán)硅烷化試劑鍵合形成的單層鍵合相，也有使用雙官能團(tuán)或三官能團(tuán)硅烷試劑鍵合形成的多層鍵合相，也稱為聚合型鍵合相。C30鍵合相具有比C18更長(zhǎng)的烷基鏈，有更強(qiáng)的疏水性，在硅膠表面形成致密的多層C30烷基鏈。由于多層鍵合相可以形成更為致密的鍵合層，能更加有效地掩蔽硅膠表面的硅羥基，同時(shí)具有更強(qiáng)的溶質(zhì)保留能力和對(duì)強(qiáng)極性物質(zhì)更小的非特異性吸附，對(duì)非極性溶質(zhì)的保留能力和分辨率更高，具有非常好的分離能力?；诙鄬泳酆闲玩I合相的優(yōu)勢(shì)和C30烷基鏈優(yōu)異的分離效果，試驗(yàn)以甲醇和水為流動(dòng)相，以加標(biāo)菠菜樣品為基質(zhì)，對(duì)比C18色譜柱和C30色譜柱及不同流動(dòng)相比例條件下的中阿維菌素與雜質(zhì)峰的分離效果，見圖1～圖5。圖譜表明，使用C30色譜柱分離菠菜基質(zhì)中阿維菌素效果明顯優(yōu)于C18色譜柱，其中采用C30色譜柱、甲醇-水（85∶15，V/V）作為流動(dòng)相時(shí)，阿維菌素主峰與雜質(zhì)峰分離度R＞1.5，分離效果最佳，雜質(zhì)干擾最小。

圖1 C18色譜柱、甲醇-水（90∶10，V/V）為流動(dòng)相分離菠菜基質(zhì)中阿維菌素色譜圖

圖2 C18色譜柱、甲醇-水（85∶15，V/V）為流動(dòng)相分離菠菜基質(zhì)中阿維菌素色譜圖

圖3 C30色譜柱、甲醇-水（90∶10，V/V）為流動(dòng)相分離菠菜基質(zhì)中阿維菌素色譜圖

圖4 C30色譜柱、甲醇-水（85∶15，V/V）為流動(dòng)相分離菠菜基質(zhì)中阿維菌素色譜圖

圖5 C30色譜柱、甲醇-水（85∶15，V/V）為流動(dòng)相阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.3 線性關(guān)系和定量限

在上述試驗(yàn)條件下測(cè)定0.50，0.75，1.00，2.00和5.00 mg/L系列質(zhì)量濃度的阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制線性關(guān)系曲線，得到的線性方程為Y=40 800X-355，其中r2值為0.999 8，結(jié)果表明在0.50～5.00 mg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。配制適當(dāng)濃度的阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述條件下平行測(cè)定6次，按照rSN=10計(jì)算得出方法定量限為0.01 mg/kg，滿足食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 23200.19—2016要求。

2.4 準(zhǔn)確度和精密度

在菠菜樣品空白基質(zhì)中分別添加0.01，0.05和0.10 mg/kg的阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品，按照上述試驗(yàn)條件進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)測(cè)定6次，外標(biāo)法定量測(cè)得阿維菌素的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD），結(jié)果見表1。阿維菌素的加標(biāo)平均回收率為93.7%～97.5%，其SRSD值為1.1%～2.2%，滿足GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》要求，且方法具有良好的重復(fù)性。

表1 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.5 蔬菜樣品參考分析

隨機(jī)選取大白菜、蘿卜、馬鈴薯、豇豆、小白菜5種實(shí)際蔬菜樣品，在基質(zhì)中分別添加0.05 mg/kg的阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品，按上述測(cè)試條件進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。測(cè)得5種蔬菜樣品中阿維菌素含量的回收率為92.8%～102.4%，SRSD值為1.1%～4.5%（n=6），回收率和精密度均滿足試驗(yàn)要求。

表2 實(shí)際樣品中阿維菌素殘留量回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3 結(jié)論

建立蔬菜中阿維菌素殘留量分析檢測(cè)的高效液相色譜法，前處理方面采用乙腈進(jìn)行超聲提取，鹽析分離，SPE小柱固相進(jìn)行萃取，減少色素和脂質(zhì)的吸附，與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中采用丙酮提取前處理方法相比，毒性小、操作簡(jiǎn)便快捷、基質(zhì)干擾影響?。粌x器測(cè)定方面采用二極管陣列檢測(cè)器，普及率高，結(jié)果定量準(zhǔn)確，試驗(yàn)方法選用C30色譜柱進(jìn)行色譜分離純化，由于C30鍵合相具有比C18更長(zhǎng)的烷基鏈，具有更好的分離效果，通過有效調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例最大限度降低基質(zhì)干擾峰的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明在0.50～5.00 mg/L范圍內(nèi)阿維菌素色譜峰面積與質(zhì)量濃度之間有良好線性關(guān)系，準(zhǔn)確度高，蔬菜樣品中阿維菌素0.05 mg/kg水平加標(biāo)回收率可達(dá)92.8%～102.4%；重復(fù)性好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液偏差為1.1%～4.5%（n=6），試驗(yàn)優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)方法，降低基質(zhì)干擾，具有較強(qiáng)的可操作性，穩(wěn)定性好，可有效適用于蔬菜中阿維菌素殘留的定量分析，滿足日常檢測(cè)需求，為阿維菌素殘留量的快速檢測(cè)提供參考依據(jù)，便于在基層實(shí)驗(yàn)室推廣使用，為保障果蔬質(zhì)量安全檢測(cè)提供技術(shù)支撐。