仲花茶飲降血糖血脂的生物活性

張錦華，劉鑫毅，李曉晶，白寶清，范三紅*

1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（太原 030006）；2.特色植物資源研究與利用山西重點實驗室，山西大學(xué)（太原 030006）；3.太原生態(tài)工程學(xué)校（太原 030025）；4.岳康藥業(yè)集團(tuán)有限公司（臨汾 042500）

目前市場存在很多種類的茶飲料，如：純茶飲料，包括綠茶、花茶、烏龍茶等；調(diào)味茶飲料，如果汁飲料、奶茶飲料等；含汽茶飲料，如碳酸茶飲料；冰茶以及復(fù)合茶飲料[1-3]。隨著時代的進(jìn)步，由傳統(tǒng)的泡茶手法而得的茶飲料已經(jīng)不能滿足市場的需求，所以目前的企業(yè)都紛紛轉(zhuǎn)向了復(fù)合型茶飲料市場，通過采用不同原料、不同配比等方法，研發(fā)出具有特殊香氣、口感以及一定保健功能的新型茶飲料。

岳康藥業(yè)集團(tuán)有限公司研發(fā)的仲花茶飲，配方以槐花、杜仲葉、炒決明子、黃精、薏苡仁、當(dāng)歸、姜黃、紅花為主?；被ň哂星甯螢a火等功效，現(xiàn)代研究表明，槐花不僅含有人體的必需營養(yǎng)素，還富含多種植物化學(xué)成分，有抗氧化、抗炎、降血壓、調(diào)節(jié)免疫等保健功效[4-5]。決明子是豆科決明屬植物的干燥成熟種子，能夠去火祛濕，清熱解毒[6]。是一種藥食同源的中藥，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，決明子具有保護(hù)肝臟、降壓、調(diào)血脂和抑菌、抗氧化等作用[7]。薏苡仁是一種常見的中藥，其中富含多種人體所需物質(zhì)[8]，現(xiàn)代藥理研究表明，薏苡仁具有降血壓、改善糖脂代謝、調(diào)節(jié)腸道菌群、美白等作用[9]。當(dāng)歸是一種常見中藥材，具有改善腸道、補(bǔ)足氣血、調(diào)節(jié)經(jīng)期的功效[10-11]。姜黃屬于姜科植物，具有行氣破淤、通經(jīng)止痛的功效[12]，從姜黃中可提取出姜黃素，姜黃素是一種天然色素，研究表明，姜黃素不僅具有抗癌、抗風(fēng)濕等功能，還具有改善免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等多種功能[13-14]。桃仁中含有多種活性物質(zhì)，包括脂肪油類、苷類、蛋白質(zhì)和氨基酸等[15]，具有改善腸道、除火祛濕、鎮(zhèn)咳祛痰等功效[16]。

糖尿病是我國常見的一種慢性疾病，患病率高達(dá)10.9%[17]。糖尿病的特征是血糖升高，根據(jù)不同的發(fā)病原因還分為1型糖尿病與2型糖尿病，患者往往還會患有高血脂，動脈粥樣硬化等并發(fā)癥[18]。糖尿病目前已經(jīng)是我國居民所面臨的主要病癥之一，目前的治療手段仍不能取得較好的效果，需要積極地探索新的治療方案[19]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，利用從植物中提取的多酚[20]、多糖[21]等物質(zhì)，可以對高血糖動物造成顯著的降血糖效果。

為了明確該茶飲降糖降脂功效，研究對仲花茶飲的降血糖能力與抗氧化能力進(jìn)行了測試，證實了仲花茶飲的降血糖功效，為其開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

仲花茶飲由岳康藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供。

SPF級昆明小鼠60只（斯貝福生物技術(shù)有限公司）；高糖高脂飼料（南京盛民科研動物公司）；基礎(chǔ)飼料與飼養(yǎng)環(huán)境由中國防護(hù)輻射院提供。

鏈脲佐菌素（STZ）（上海麥克林生化科技有限公司）；鹽酸二甲雙胍（中美上海施貴寶制藥有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

三諾血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司）；酶標(biāo)儀（美國惠普公司）；石蠟包埋機(jī)（Histocentre）；Finesse325石蠟切片機(jī)（英國Shandon）；Excelsior全自動組織脫水機(jī)（英國Shandon）；BX53熒光顯微成像系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 高血糖血脂造模

小鼠經(jīng)過3 d的適應(yīng)期后，稱重并斷食12 h測初始血糖。在60只小鼠中，隨機(jī)選取10只正常小鼠作為空白對照組，其余全部作為造模試驗組。造模組小鼠投喂高糖高脂飼料，禁食不禁水12 h，并注射55 mg/kg STZ（現(xiàn)配現(xiàn)用）誘導(dǎo)小鼠血糖升高。一月后，尾靜脈取血測小鼠血糖，小鼠的血糖大于11.1 mmol/L為造模成功?？瞻讓φ战M（標(biāo)記為NG）喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料，灌胃等量的生理鹽水[22]。

1.3.2 試驗分組

將50只造模組小鼠隨機(jī)分為五組，分別是模型組（標(biāo)記為DM），陽性對照組（標(biāo)記為MET），低劑量組（標(biāo)記為ZH-1），中劑量組（標(biāo)記為ZH-2），高劑量組（標(biāo)記為ZH-4），低、中、高劑量組分別以100，200和400 mg/kg含量的仲花茶飲進(jìn)行灌胃，空白組和模型組按200 mg/kg的質(zhì)量分?jǐn)?shù)灌胃等量的生理鹽水，陽性對照組灌胃中劑量200 mg/kg濃度的鹽酸二甲雙胍。試驗結(jié)束后水合氯醛麻醉，并脫臼致死[22]。

1.3.3 糖耐量測試

在27 d，小鼠經(jīng)過12 h禁食后用50%的葡萄糖溶液以2 g/kg對其進(jìn)行腹腔注射，再經(jīng)過0，30，60，90和120 min后進(jìn)行短尾取血，測定血糖值[22]。

1.3.4 體重、血糖及肝臟指數(shù)測定

分別在造模后的第7，第14，第21和第28天進(jìn)行禁食、稱重并測血糖，肝臟指數(shù)的計算公式見式（1）。

1.3.5 小鼠血脂指標(biāo)的測定

在28 d后，摘取小鼠眼球，并對眼球取血，再以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心，收集上清液，用試劑盒分別測定小鼠的血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C），低密度脂蛋白（LDL-C）。

1.3.6 小鼠抗氧化指標(biāo)的測定

在28 d后，摘取小鼠眼球，并立即進(jìn)行解剖，摘取小鼠肝臟。小鼠肝臟經(jīng)生理鹽水清洗后進(jìn)行稱重，再與生理鹽水1∶9混勻均質(zhì)，將均質(zhì)后的溶液以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心，收集上清液，分別用試劑盒測提取液中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活力及丙二醛（MDA）的含量[22]。

1.3.7 胰腺組織切片處理

參考文獻(xiàn)[23]。切片方法：第28天試驗結(jié)束時進(jìn)行肢解，采集樣本，取大鼠胰腺，即刻收入10%中性福爾馬林液中，固定48 h，按常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片及HE染色，取組織經(jīng)自來水沖洗固定液，酒精梯度脫水后（70%，80%，95%Ⅰ，95%Ⅱ，100%Ⅰ和100%Ⅱ），對組織進(jìn)行透明（二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ），浸蠟（石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ）后包埋，包埋后的組織3～5 μm切片，經(jīng)60 ℃烤片后進(jìn)行H-E染色（二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脫蠟，過100%Ⅰ，100%Ⅱ，95%Ⅰ，95%Ⅱ，80%和70%的梯度酒精，經(jīng)蘇木素染色、分化、反藍(lán)，伊紅染色，過70%，80%，95%Ⅰ，95%Ⅱ，100%Ⅰ和100%Ⅱ梯度酒精），最后用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明后樹膠封片，待鏡檢。

1.3.8 腸道微生物Alpha多樣性分析

無菌環(huán)境中收集各組的新鮮糞便，收集到離心管中，液氮冷凍。提取糞便DNA并測序，進(jìn)行OTU聚類分析、腸道微生物Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析與處理

數(shù)據(jù)處理使用SPSS 21.0，作圖使用Origin 8.5，數(shù)據(jù)分析使用Statistics。腸道微生物送由諾禾致源公司16s擴(kuò)增測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 仲花茶飲對小鼠體重的影響

經(jīng)觀察可知，各組小鼠在適應(yīng)階段體重基本一致，而造模后的高血糖小鼠具有毛發(fā)無光澤、多食多尿等特征。由圖1可知，在整個試驗過程中模型組小鼠體重逐漸下降，第4周體重比初始降低了6%，空白對照組小鼠體重不斷增大，增長率10%。在灌胃3周時，仲花茶飲劑量組小鼠體重都有明顯的升高，高劑量組體重升高了4.4%，中劑量組體重升高了3.3%。從圖1中可以明顯看到，與空白對照組（NG）和陽性對照組（MET）相比，體重升高的趨勢顯著降低，表示了仲花茶飲的降體重功能。

圖1 仲花茶飲對小鼠體重的影響

2.2 仲花茶飲對小鼠血糖的影響

圖2為試驗期間仲花茶飲對各組小鼠的血糖值的影響。試驗初期各小組小鼠血糖值差異不顯著，造模成功后，各組小鼠與空白組的血糖值具有明顯差異。灌胃4周時，空白組血糖保持穩(wěn)定，模型組小鼠血糖顯著升高，其余組小鼠血糖均有不同程度降低，高劑量組降血糖效果明顯，4周后高劑量組和陽性對照組基本持平，說明仲花茶飲具有良好的降血糖效果。

圖2 仲花茶飲對小鼠血糖的影響

2.3 仲花茶飲對小鼠血脂的影響

糖尿病是一種代謝性疾病[24]。這種代謝問題主要是由于脂肪酶的代謝發(fā)生問題，導(dǎo)致患者體內(nèi)TC、TG、LDL-C水平的升高，HDL-C水平的降低[25]。仲花茶飲對小鼠血脂的影響如圖3所示。在各模型組小鼠血糖中發(fā)現(xiàn)，4種檢測指標(biāo)均與空白對照組存在顯著差異，證明在模型組小鼠中存在脂代謝紊亂問題。

圖3 仲花茶飲對小鼠血脂的影響

在灌胃不同劑量仲花茶飲的小鼠中，血清TC值與劑量呈反比關(guān)系，高劑量組血清TC值與空白對照組無明顯差異，與模型組小鼠TC值存在顯著差異，說明仲花茶飲具有一定的減少高血糖小鼠體內(nèi)TC含量的功效，且其降TC含量的能力與給藥劑量呈正比關(guān)系，其中高劑量組比模型組降低了45.5%，低劑量組比模型組降低了27.49%較陽性對照有所降低；從血糖中TG值分析，模型組小鼠血糖中TG值最高，與空白對照組小鼠TG值存在顯著差異。而在各試驗組中，仲花茶飲高劑量組優(yōu)于模型組，低劑量組TG值較模型組降低了27.35%，中劑量和高劑量組TG含量和陽性對照TG含量接近，且比模型組降低了52.75%，說明仲花茶飲具有減少小鼠血清中TG水平、抑制小鼠體內(nèi)的脂代謝紊亂問題的功效；仲花給藥組的HDLC含量明顯高于模型組，且空白對照，陽性對照，高劑量組HDLC含量接近，高劑量組比模型組含量高48.25%，效果顯著；在給藥組中各小鼠的LDL-C值明顯低于模型組，且與給藥量為反比關(guān)系，低劑量較模型組低20.36%，中劑量較模型組低34.51%，高劑量較模型組低51.33%。

2.4 仲花茶飲對小鼠肝氧化損傷的影響

比較常見的抗氧化酶有SOD、CAT、GSH-Px等[26-27]。MDA是一種脂質(zhì)氧化過程中的副產(chǎn)物，能夠反應(yīng)小鼠的脂肪代謝功能[28]。如圖4所示，模型組小鼠的CAT、SOD、GSH-Px水平顯著低于空白對照組小鼠，而MDA水平上升顯著，說明在模型組小鼠的體能發(fā)生了嚴(yán)重的過氧化反應(yīng)。在對小鼠灌胃仲花茶飲后，小鼠的過氧化反應(yīng)程度均發(fā)生緩解，且SOD、GSH-Px、CAT與給藥劑量呈反比關(guān)系，MDA與給藥劑量呈正比關(guān)系，表明仲花茶飲能夠抑制高血糖小鼠體內(nèi)的過氧化反應(yīng)，提高小鼠的肝臟抗氧化能力，且功效與劑量呈正相關(guān)。

圖4 仲花茶飲對小鼠抗氧化指標(biāo)的影響

2.5 仲花茶飲對小鼠胰腺組織的影響

試驗結(jié)束后，由圖5可以看出：正常小鼠的胰島細(xì)胞形態(tài)完整、邊界清晰，數(shù)量較多；模型組小鼠的胰島內(nèi)細(xì)胞邊界不清并且數(shù)目有所減少，胰島細(xì)胞受損程度較嚴(yán)重；仲花茶飲給藥組的小鼠細(xì)胞邊界較模型組而言清晰且胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)目對比模型組有所增加，細(xì)胞體積有所增大，由此可以推測仲花茶飲可能具有修復(fù)損傷的胰島細(xì)胞的作用，進(jìn)而對糖尿病起到治療作用。

圖5 試驗小鼠胰島組織病理學(xué)檢查結(jié)果

2.6 仲花茶飲對小鼠腸道菌群的影響

韋恩圖結(jié)果如圖6所示。5組重疊部分代表組間共有的OTUs，共409個，而每個組特有的OTU數(shù)量則不同，正常組NC有36個，模型組DM有74個，低劑量組ZH.L有346個、中劑量組ZH.M有1 308個，高劑量組ZH.H有358個，說明仲花具有調(diào)節(jié)糖尿病小鼠腸道微生物作用，且中劑量組效果優(yōu)于低劑量組和高劑量組；模型組DM、低劑量組ZH.L、中劑量組ZH.M和高劑量組ZH.H與正常組NC單獨重合OTU個數(shù)分別為：12、84、8和2，說明低劑量組ZH.L與正常組NC的OTU相似度高于模型組DM與正常組NC。

圖6 小鼠腸道菌群OUT聚類分析

由表1數(shù)據(jù)可知，模型組的腸道菌群shanon指數(shù)和simpson指數(shù)低于正常組，說明經(jīng)STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的腸道菌群多樣性降低，與模型組相比，不同給藥組均能夠提高shanon指數(shù)、chao1指數(shù)和ACE指數(shù)，表明仲花茶飲能夠增加糖尿病小鼠腸道菌群的多樣性和豐富度。總而言之，患有糖尿病的小鼠其腸道微生物多樣性遭到破壞，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，而通過仲花茶飲干預(yù)可以一定程度上調(diào)節(jié)和改善失調(diào)的腸道菌群。

表1 Alpha多樣性指數(shù)分析

圖7為所有樣本的PCoA分析，由圖可以看出PC1的貢獻(xiàn)度為40.27%，PC2的貢獻(xiàn)度為15.6%，空白組樣本和模型組樣本分別相對集中在一個單獨區(qū)域，說明正常小鼠和糖尿病小鼠的群落結(jié)構(gòu)具有差異性。陽性對照組沿著PC1和PC2遠(yuǎn)離模型組，更接近正常組，且組內(nèi)中心連接點與正常組中心點的距離小于模型組與正常組的距離，代表腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。仲花茶飲組組內(nèi)個體間雖然不明顯聚集，但大都表現(xiàn)出偏離模型組向正常組靠近的趨勢，說明仲花茶飲可以調(diào)節(jié)腸道菌群物種結(jié)構(gòu)組成、減小由STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠與正常小鼠腸道菌群物種組之間的差異，能改變腸道菌群的分布，改善腸道菌群失調(diào)。

圖7 小鼠腸道菌群Beta多樣性分析

3 結(jié)論

研究以仲花茶飲為對象，以人工培育的高血糖模型鼠為試驗體，進(jìn)行灌胃試驗，考察其對試驗體血糖、血脂、抗氧化指標(biāo)、胰腺組織以及腸道菌群的影響。在結(jié)果中發(fā)現(xiàn)仲花茶飲對于高脂小鼠的各項指標(biāo)均具有顯著的改善效應(yīng)，表明仲花茶飲在治療糖尿病以及各種并發(fā)癥的過程中可以起到顯著的改善作用，有廣闊的開發(fā)前景。