培養(yǎng)基中添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的蛹蟲草轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

王哲，王升厚，李夢(mèng)雪，柳葉飛，王澤，徐方旭*

1.沈陽(yáng)師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（沈陽(yáng) 110034）；2.沈陽(yáng)師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心（沈陽(yáng) 110034）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又稱北冬蟲夏草、北蟲草，2009年被批準(zhǔn)為新資源食品[1-4]。蛹蟲草富含多種生物活性成分，如蟲草素、噴司他丁、腺苷、蟲草酸、蟲草多糖、超氧化物歧化酶、麥角甾醇及黃酮類物質(zhì)等[5-9]，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎抗菌及抗氧化等藥理作用[10-12]。蛹蟲草通過(guò)人工培育實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，但在產(chǎn)業(yè)發(fā)展中仍存在亟待解決的技術(shù)性瓶頸問(wèn)題，其中之一就是蛹蟲草在生長(zhǎng)后期常出現(xiàn)“白毛病”，即學(xué)術(shù)界統(tǒng)稱的因感染“吃草菌”引起的真菌性病害，這種寄生性病原真菌會(huì)導(dǎo)致蛹蟲草產(chǎn)量嚴(yán)重下降[13-16]。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是一類與植物激素具有相似生理和生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)，其主要成分有水楊酸、茉莉酸、多效唑和多胺。由于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑大多取自植物本身產(chǎn)生的天然產(chǎn)物，具有微量、高效、低毒等作用，同時(shí)還可調(diào)節(jié)作物的生長(zhǎng)發(fā)育、提高生物轉(zhuǎn)化率、改善品質(zhì)外，在作物抗病中具有顯著功效[17-20]。有研究表明，細(xì)胞壁是植物防御病原物侵染的第一道屏障。當(dāng)病原物物侵染植物后，引起細(xì)胞壁的防御反應(yīng)，參與細(xì)胞生命活動(dòng)的某些信息傳遞，并發(fā)生防御反應(yīng)，細(xì)胞壁在植物抗病過(guò)程中起著重要的能動(dòng)作用[21-22]。除了細(xì)胞壁能夠抵御病原菌的侵染外，近年來(lái)，更多研究表明，一些抗病蛋白需要轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)才能啟動(dòng)免疫反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮抗病防御作用，而細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受體是實(shí)現(xiàn)這些抗病蛋白核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)必不可少的“載體”。因此，細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及轉(zhuǎn)運(yùn)受體在抗病防御中發(fā)揮重要作用[23]。何茂華[24]研究表明，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在誘導(dǎo)棉花抗黃萎病期間，其棉苗體內(nèi)與抗病相關(guān)酶活性和一些次生代謝物質(zhì)含量的變化與棉苗抗黃萎病性相關(guān)。肖翔等[25]研究表明，脫落酸通過(guò)拮抗水楊酸抗病信號(hào)通路負(fù)調(diào)控?cái)M南芥對(duì)白粉菌的穿透后抗性。因此，了解植物對(duì)病原菌的防御機(jī)制及病原菌對(duì)植物的感染過(guò)程和分子機(jī)理尤為重要，有利于掌握設(shè)計(jì)植物的持久抗性所需的必要知識(shí)，為改善作物對(duì)不良環(huán)境的抵御能力提供方案和對(duì)策[26]。

關(guān)于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)蛹蟲草抵抗寄生性病原真菌分子機(jī)制的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。為揭示培養(yǎng)基中添加GN-01的蛹蟲草與對(duì)照組蛹蟲草鮮品的基因表達(dá)差異，試驗(yàn)利用RNA-seq技術(shù)進(jìn)行高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析，對(duì)GN-01抵抗蛹蟲草寄生性病原真菌的抗病機(jī)理在轉(zhuǎn)錄組學(xué)層面進(jìn)行探究，為后期開(kāi)展蛹蟲草真菌病害的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

對(duì)照組（CK）：栽培培養(yǎng)基為小麥40 g和清水60 g培養(yǎng)的蛹蟲草。

試驗(yàn)組（DK）：栽培培養(yǎng)基中加入稀釋3 000倍GN-01培養(yǎng)的蛹蟲草。

蛹蟲草PT07（沈陽(yáng)師范大學(xué)特種菌業(yè)研究所）；總RNA提取試劑RNAiso Plus[寶生物工程（大連）有限公司]；脫氧核糖核酸酶I（北京凡知醫(yī)學(xué)科技有限公司）；NEBNext Ultra RNA文庫(kù)制備試劑盒（美國(guó)NEB公司）；Oligo（d T）磁珠（蘇州海貍公司）；fragmentation buffer（上海恒斐生物科技有限公司）；NEBNext Ultra RNA文庫(kù)制備試劑盒（美國(guó)NEB公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Illumina HiSeq 4000高通量測(cè)序平臺(tái)系統(tǒng)（上海派諾森生物科技有限公司）；Agilent 2100生物分析儀（安捷倫科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

稱取對(duì)照組和試驗(yàn)組蛹蟲草樣本，各200 mg，每組樣品選取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序委托上海派諾森生物科技有限公司完成[27]。

1.3.2 差異基因篩選

將表達(dá)差異倍數(shù)|log2Fold Change|＞1和顯著性P值＜0.05作為篩選差異表達(dá)基因條件，滿足此篩選標(biāo)準(zhǔn)的基因即為差異表達(dá)基因。

1.3.3 差異基因的功能注釋和富集

應(yīng)用基因本體論聯(lián)合會(huì)建立的數(shù)據(jù)庫(kù)所建立的數(shù)據(jù)庫(kù)GO對(duì)所獲得差異基因的GO進(jìn)行分類注釋，同時(shí)利用京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG通路的功能富集分析[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)分析

CK組和DK組蛹蟲草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序原始數(shù)據(jù)讀序分別為45 086 267和44 293 419，經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)去除雜質(zhì)及接頭序列后，相應(yīng)的干凈讀序?yàn)?2 704 425和41 868 819，其中各組中質(zhì)量值≥20的堿基所占比例Q20均在97.39%以上，質(zhì)量值≥30的堿基所占比例Q30均在93.58%以上，表明測(cè)序結(jié)果理想，可用于后續(xù)分析。

2.2 差異基因表達(dá)分析

對(duì)照組和試驗(yàn)組共有9 618個(gè)差異基因，根據(jù)P值＜0.05和|log2Fold Change|＞1篩選顯著差異表達(dá)基因。從圖1可以看出，培養(yǎng)基中添加GN-01后，蛹蟲草子實(shí)體顯著差異基因共189個(gè)，其中上調(diào)基因83個(gè)、下調(diào)基因106個(gè)。

圖1 差異表達(dá)基因的火山圖

2.3 差異基因的GO富集分析

GO功能分類結(jié)果（圖2）表明：差異基因在細(xì)胞組分這類中，核小體、DNA復(fù)合包裝、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體3個(gè)條目上富集較顯著；在分子功能這類中，蛋白質(zhì)異源二聚體活動(dòng)、糖基鍵的水解酶活性2個(gè)條目上富集較顯著；在生物過(guò)程這類中，碳水化合物分解代謝過(guò)程和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)2個(gè)條目富集較顯著。

圖2 GO功能注釋

2.4 差異基因的KEGG富集分析

從圖3可以看出：189個(gè)差異基因共富集到29條通路，其中，顯著富集到糖鞘脂生物合成-globo和isglobo系列、淀粉和蔗糖代謝、酮體的合成與降解、糖胺聚糖降解、生物素代謝這5條通路，說(shuō)明蛹蟲草子實(shí)體中的差異表達(dá)基因在這5條通路上受GN-01的影響較大。

圖3 KEGG功能富集圖

2.5 關(guān)鍵KEGG通路與差異表達(dá)基因解析

栽培培養(yǎng)基中添加GN-01后蛹蟲草子實(shí)體中關(guān)鍵KEGG通路與差異表達(dá)基因詳見(jiàn)表1。其中：與次生代謝產(chǎn)物生物合成有關(guān)的基因?yàn)镸GAM，F(xiàn)abG和GALM；P4HA主要參與精氨酸和脯氨酸的代謝；GSTK1主要參與植物過(guò)氧化物酶體路徑。由此可見(jiàn)，在蛹蟲草栽培培養(yǎng)基中添加GN-01，可有效激活次生代謝產(chǎn)物合成通路、脯氨酸代謝途徑和過(guò)氧化物酶體途徑，從而提高蛹蟲草在生長(zhǎng)過(guò)程中的抗病能力。

表1 關(guān)鍵KEGG通路與差異表達(dá)基因

3 討論與結(jié)論

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是人工合成或提取的具有天然植物激素生理活性的化合物，可用于調(diào)節(jié)或控制植物生長(zhǎng)發(fā)育的某些過(guò)程。研究表明，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑通常可在植物體內(nèi)傳導(dǎo)至作用部位，以很低的濃度促進(jìn)植物生長(zhǎng)和繁殖，其特點(diǎn)為效用高、用量小、毒性低，在全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用，達(dá)到穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)、改善品質(zhì)、縮短生長(zhǎng)周期、延長(zhǎng)保鮮期等作用[28-29]。試驗(yàn)結(jié)果表明，在栽培培養(yǎng)基中添加GN-01后，蛹蟲草子實(shí)體中顯著差異基因189個(gè)，共富集到代謝通路29條。其中，差異基因MGAM，F(xiàn)abG和GALM主要參與次生代謝產(chǎn)物的生物合成，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，次生代謝產(chǎn)物廣泛參與植物生長(zhǎng)、發(fā)育、防御等生理過(guò)程，可作為生化壁壘抵抗病原物的侵染過(guò)程，還可作為信號(hào)物質(zhì)參與植物的抗病反應(yīng)，在植物的抗病防御反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[30]。差異基因P4HA主要參與精氨酸和脯氨酸的代謝，高水平的脯氨酸可通過(guò)維持細(xì)胞膜的完整性和增強(qiáng)抗氧化能力以提高植物的抗病能力。GSTK1主要參與植物過(guò)氧化物酶體路徑，過(guò)氧化物酶體的功能是可以使毒性物質(zhì)失活，這種作用是過(guò)氧化氫酶利用過(guò)氧化氫氧化各種底物，如酚、甲酸、甲醛和乙醇等，氧化的結(jié)果使這些有毒性的物質(zhì)變成無(wú)毒性的物質(zhì)，從而提高植物的抗病性。由此可見(jiàn)，在蛹蟲草栽培培養(yǎng)基中添加GN-01，可有效激活次生代謝產(chǎn)物合成通路、脯氨酸代謝途徑和過(guò)氧化物酶體途徑，從而提高蛹蟲草在生長(zhǎng)過(guò)程中的抗病能力。