基于不同糟制溫度對(duì)酒糟魚理化性質(zhì)及蛋白質(zhì)降解的研究

汪曉瑜，趙利，白春清，陳麗麗，袁美蘭，江勇

1.國(guó)家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心（南昌 330013）；2.江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（南昌 330013）

酒糟魚是我國(guó)江西特產(chǎn)，它是以新鮮草魚等為原料，經(jīng)鹽浸、干燥、糟制等工序加工制成[1-2]。糟制過程是酒糟魚風(fēng)味物質(zhì)形成的關(guān)鍵，糟制后的魚肉不僅具有腌制后的臘香味還有糟制形成的酒香味，酒糟呈白色、淺黃色至黃色。毛安康等[3]以新鮮草魚為原料，從腌制、脫腥、糟制等方面探究最佳酒糟魚生產(chǎn)工藝條件，以期開發(fā)出品質(zhì)好、口感佳、受消費(fèi)者喜愛的酒糟草魚制品，為草魚工業(yè)化生產(chǎn)加工提供理論依據(jù)。糟制過程中魚肉在酒糟的作用下繼續(xù)發(fā)酵，產(chǎn)生濃濃的酒香味和具有特征氣味的風(fēng)味物質(zhì)，糟制發(fā)酵后的魚肉制品的口感、風(fēng)味得到改善，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和安全性也得到提高[4-5]。

蛋白質(zhì)在糟制過程中會(huì)發(fā)生不同程度的水解。肌肉組織的蛋白質(zhì)主要分為三類，包括肌原纖維蛋白質(zhì)、肌漿蛋白質(zhì)以及不溶性基質(zhì)蛋白質(zhì)。肌漿蛋白占魚體肌肉組織總蛋白的30%，與魚肉的顏色、風(fēng)味、滋味以及持水性等相關(guān)，可間接影響魚肉品質(zhì)[6]。研究以酒糟魚為對(duì)象，考察其在不同糟制溫度下pH、粗蛋白含量、TCA-可溶性肽含量、揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量、氨基酸態(tài)氮以及蛋白組成含量、亞硝酸鹽含量的變化，探究酒糟魚在糟制過程中品質(zhì)及蛋白質(zhì)降解這一過程，為后續(xù)酒糟魚工業(yè)化生產(chǎn)以及保鮮技術(shù)提高產(chǎn)品品質(zhì)提供可借鑒依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮草魚、糯米、甜酒曲、辣椒粉、姜、蒜、食用鹽，均購(gòu)自經(jīng)開區(qū)樂買佳超市。

1.2 試驗(yàn)試劑

亞硝酸鈉（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；氫氧化鈉、硫酸銅、95%乙醇、SDS、鹽酸（西隴科學(xué)股份有限公司）；三氯乙酸、硼酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；硫酸鉀（西隴化工股份有限公司）；氧化鎂（上海展云化工有限公司）。均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

HZF-A1000電子分析天平（福州華志科學(xué)儀器有限公司）；TGL-18M高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；U-T6A紫外可見分光光度計(jì)[屹譜儀器制造（上海）有限公司]；SPX-100B-Z恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；DK-S26恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Sorvall EVOLUTION RC落地式高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品）；IKA分散機(jī)（深圳市三莉科技有限公司）；PHS-3C精密PH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 酒糟魚的制備

魚塊制備：選擇質(zhì)量在2～3 kg的新鮮草魚，經(jīng)去腮、去魚鱗、去內(nèi)臟、去脊椎骨和頭，清洗后瀝干，切成3 cm×3 cm×2 cm塊狀，添加7%食鹽、2.5%姜和2.5%蒜、2%辣椒粉均勻涂抹于魚肉表面，并密封放置在冰箱4 ℃下腌制24 h。腌制結(jié)束后進(jìn)行干燥過程。

酒糟制備：所需原料糯米與酒曲之比125∶1。首先將糯米用水浸泡一夜，瀝干水分進(jìn)行蒸制20 min，取出后自然降溫散熱，米飯中加入酒曲，酒曲加入前用糯米量的1/2溫開水化開并攪拌均勻并在中間搭窩，密封29 ℃下發(fā)酵5 d。

糟制：按照魚與酒糟之比1∶2分別在4，12和16℃溫度下進(jìn)行糟制，對(duì)魚肉進(jìn)行第3，第6，第9，第12，第15和第18天的取樣。

1.4.2 酒糟魚預(yù)干制條件的選擇

比較腌制后的魚肉在16 ℃自然條件下風(fēng)干以及在熱風(fēng)干燥箱干燥水分變化情況。

1.4.3 酒糟魚不同糟制階段pH測(cè)定

準(zhǔn)確稱取10 g糟制攪碎后的魚肉樣品，加入90 mL水，高速分散機(jī)高速勻漿2 min后靜置10 min，測(cè)定其上清液pH，重復(fù)3次。

1.4.4 酒糟魚不同糟制階段粗蛋白含量的測(cè)定

粗蛋白含量的測(cè)定采用凱氏定氮法。

1.4.5 酒糟魚不同糟制階段揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量的測(cè)定

揮發(fā)性鹽基氮含量采用半微量定氮法進(jìn)行。

1.4.6 酒糟魚不同糟制階段氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定

采用甲醛滴定法。

1.4.7 酒糟魚不同糟制階段TCA-可溶性肽含量的測(cè)定

TCA-可溶性肽的測(cè)定參照王蔚新[7]方法。準(zhǔn)確稱量2 g攪碎后的糟制魚肉樣，加入28 mL 5% TCA溶液，置于均質(zhì)機(jī)均質(zhì)3 min，接著在4 ℃下冷藏1 h后置于冷凍離心機(jī)在4 ℃、轉(zhuǎn)速5 000 r/min下離心10 min。采用雙縮脲法測(cè)定TCA-可溶性肽的含量，以酪蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表示為mg酪氨酸/g樣品。

1.4.8 酒糟魚不同糟制階段亞硝酸鹽含量測(cè)定

參考GB 5009.33—2016中分光光度計(jì)法進(jìn)行。

1.4.9 酒糟魚糟制過程中蛋白組成含量測(cè)定

酒糟魚蛋白質(zhì)組成根據(jù)溶解度不同可以分為肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和不溶性蛋白。各部分蛋白提取方法參考王蔚新[7]的方法，并作修改。準(zhǔn)確稱取2 g（精確至0.001 g）攪碎后的魚肉，加入20 mL pH 6.5的0.02 mol/L PB磷酸緩沖溶液，勻漿2 min，冷凍離心機(jī)在4 ℃、轉(zhuǎn)速10 000 r/min下離心10 min，上清液即為肌漿蛋白部分。重復(fù)以上操作3次，合并上清液備用。取肌漿蛋白后的沉淀部分，加入20 mL pH 6.5的0.1 mol/L PB磷酸緩沖液，相同條件勻漿離心，上清液為肌原纖維蛋白部分。重復(fù)以上操作3次，合并上清液備用。取兩種蛋白后的沉淀部分，加入10 mL 5%的SDS，在恒溫水浴鍋80 ℃下加熱1 h后冷卻，即為不溶性蛋白。雙縮脲法測(cè)定各部分蛋白含量。

1.5 感官評(píng)定

對(duì)不同糟制溫度下的酒糟魚樣品進(jìn)行無順序編號(hào)，邀請(qǐng)10名嗅覺味覺等感官良好的食品方向研究生或老師進(jìn)行感官評(píng)定分析。

表1 酒糟魚感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)表

2 結(jié)果與討論

2.1 酒糟魚預(yù)干制條件的選擇

由圖1和圖2可以看出，在自然風(fēng)干和熱風(fēng)干燥這兩種干燥方式條件下，0～6 d時(shí)間內(nèi)水分含量都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，干燥后的魚肉水分減少，水分活度降低，有利于提高酒糟魚產(chǎn)品品質(zhì)及保藏性。圖1中自然風(fēng)干干燥條件下從第0天水分含量75.4%下降到第6天的44.8%，但水分下降較緩慢；圖2中60 ℃熱風(fēng)干燥條件下水分下降較快，從第0小時(shí)的75.4%下降到第16小時(shí)的50.6%。由于糟制過程對(duì)魚肉水分要求較高，魚肉水分含量較高不利于糟制液的滲入；魚肉水分含量較低會(huì)導(dǎo)致魚肉表面干癟收縮，不利于糟制液滲入魚肉內(nèi)部，影響酒糟魚制品的口感及風(fēng)味形成。根據(jù)王蔚新[7]中魚段水分含量對(duì)糟制過程的影響，得出酒糟魚干燥終點(diǎn)在55%左右更有利于糟制過程，因此選定酒糟魚熱風(fēng)干燥終點(diǎn)時(shí)魚肉水分含量約為55.3%，此時(shí)熱風(fēng)干燥溫度為60 ℃，干燥時(shí)間為12 h。

圖1 自然風(fēng)干條件下魚肉水分含量隨時(shí)間的變化

圖2 熱風(fēng)干燥60 ℃條件下水分含量隨時(shí)間的變化

2.2 酒糟魚不同糟制階段pH測(cè)定

pH的大小可以作為評(píng)價(jià)魚肉腐敗變質(zhì)情況的重要指標(biāo)之一。糟制酒糟魚的糟制液呈酸性，由圖3可以看出，隨著糟制時(shí)間的延長(zhǎng)，不同溫度下的酒糟魚pH都呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，第3～第6天下降速度較快，這是由于酒糟魚在糟制過程中糟制液的滲入。糟制第18天時(shí)4 ℃下的魚肉pH為5.69左右，12 ℃下的魚肉pH為5.59左右，16 ℃下的魚肉pH達(dá)到了5.43左右，差異顯著（P＜0.05）。溫度越高，pH的下降速率越快。這主要是由于溫度升高，糟制液內(nèi)產(chǎn)酸微生物的生長(zhǎng)速度越快，產(chǎn)酸增多導(dǎo)致的[8]。

圖3 酒糟魚肉在18 d內(nèi)pH變化

2.3 酒糟魚粗蛋白及TCA-可溶性肽含量的測(cè)定

粗蛋白含量是魚肉中各種含氮物質(zhì)的總稱，它包括真蛋白質(zhì)和含氮物（氨化物），魚肉蛋白質(zhì)含量一般在15%～24%之間。由圖4可以看出，在不同溫度下，隨著糟制時(shí)間的延長(zhǎng)，粗蛋白含量都有略微降低，16 ℃下的魚肉粗蛋白含量相較于4 ℃和12 ℃有小幅度降低，但無明顯變化。溫度升高，對(duì)魚肉總氮含量并無明顯影響，且常溫糟制下能夠保持較高的粗蛋白含量。粗蛋白含量降低，一方面是由于糟制液的滲透作用，使得酒糟中的液態(tài)基質(zhì)滲透到魚肉組織中；另一方面魚肉在微生物以及內(nèi)源組織酶的代謝作用下，生成肽類、氨基酸態(tài)氮等含氮小分子物質(zhì)。

圖4 酒糟魚在18 d內(nèi)粗蛋白含量變化

三氯乙酸（TCA）是一種蛋白質(zhì)沉淀劑和變性劑，由于糟制液呈酸性，它可以在酸性條件下與長(zhǎng)鏈肽段以及蛋白質(zhì)形成不溶性鹽類，進(jìn)而沉淀出來。試驗(yàn)對(duì)于魚肉而言，TCA-可溶性肽的溶解度可以定性反映糟制過程中魚肉蛋白質(zhì)的水解情況，溶解指數(shù)越高，說明魚肉中不溶性鹽越少，較短肽段含量相對(duì)越高。由圖5可以看出，隨著糟制時(shí)間的延長(zhǎng)，TCA-可溶性肽含量均逐漸升高，這是由于糟制液呈酸性，蛋白質(zhì)在酸性條件下會(huì)發(fā)生水解，導(dǎo)致小分子肽的出現(xiàn)，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致可溶性肽含量的升高。隨著溫度升高，蛋白質(zhì)溶解度增加，TCA-可溶性肽含量越高。4 ℃下第18天魚肉的TCA-可溶性肽含量達(dá)到了10.33 mg tyrosine/g樣品，而16 ℃下第18天的魚肉TCA-可溶性肽含量高達(dá)11.71 mg tyrosine/g樣品。

圖5 酒糟魚糟制過程中TCA-可溶性肽含量變化

2.4 酒糟魚糟制過程中揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量的測(cè)定

揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量可以用來表征食品的化學(xué)動(dòng)力學(xué)模型，它是評(píng)價(jià)肉及肉制品鮮度的重要指標(biāo)。它描述的是動(dòng)物性食品在酶、細(xì)菌以及微生物作用下發(fā)生腐敗變質(zhì)，使蛋白質(zhì)分解成胺類以及氨等堿性腐敗性物質(zhì)的情況，其含量越高說明氨基酸被破壞得越多，食品腐敗破壞越嚴(yán)重。目前，應(yīng)用TVB-N構(gòu)建食品化學(xué)動(dòng)力學(xué)模型以期預(yù)測(cè)食品的貨架期[9-11]已被研究。由圖6可以看出，隨著糟制時(shí)間的延長(zhǎng)，揮發(fā)性鹽基氮含量逐漸增加，這是由于在糟制過程中，魚肉中的蛋白質(zhì)在酶以及微生物作用下發(fā)生水解產(chǎn)生氨及胺類等堿性有毒腐敗物質(zhì)，且腐敗越嚴(yán)重。16 ℃下TVB-N含量相較于12 ℃以及4 ℃都有小幅度上升，這是由于溫度越高，蛋白質(zhì)降解速率越快，產(chǎn)生氨及胺類物質(zhì)更多。16 ℃糟制終點(diǎn)揮發(fā)性鹽基氮含量為11.98 mg/100 g，未超過食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的最大值20 mg/100 g。

圖6 酒糟魚糟制過程中揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量變化

2.5 酒糟魚糟制過程中氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定

氨基酸態(tài)氮含量的多少可以一定程度反應(yīng)糟制過程中蛋白質(zhì)的水解程度，氨基酸態(tài)氮含量升高，說明魚肉在被內(nèi)源酶以及微生物水解，且含量越高，代表反應(yīng)過程蛋白質(zhì)水解越劇烈。由圖7可以看出，隨著糟制時(shí)間的延長(zhǎng)，第3～第12天氨基酸態(tài)氮含量逐漸升高，第12天之后含量逐漸降低，這是由于糟制過程中蛋白質(zhì)發(fā)生了水解，水解產(chǎn)生的氨基酸作為糟制過程中魚肉風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)，在微生物及組織酶的作用下最終會(huì)產(chǎn)生酒糟特有的風(fēng)味。氨基酸態(tài)氮作為蛋白質(zhì)的中間降解產(chǎn)物[12]，在糟制過程中會(huì)進(jìn)一步代謝為氨基酸等小分子物質(zhì)。類似于糟制過程中揮發(fā)性鹽基氮含量變化，16 ℃下的氨基酸態(tài)氮含量高于12℃和4 ℃下氨基酸態(tài)氮的含量，這可能是由于溫度升高，微生物以及內(nèi)源酶酶活力增強(qiáng)，對(duì)蛋白質(zhì)降解過程具有促進(jìn)作用，從而加快氨基酸態(tài)氮的生成。

圖7 酒糟魚糟制過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化

2.6 酒糟魚糟制過程中亞硝酸鹽含量的測(cè)定

亞硝酸鹽在火腿、香腸等肉類食品中被廣泛使用。由圖8可以看出，隨著糟制時(shí)間的延長(zhǎng)，三種溫度下的亞硝酸鹽含量都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。4 ℃冷藏下的酒糟魚亞硝酸鹽含量比12 ℃下的亞硝酸鹽含量高，12℃下的亞硝酸鹽含量高于16 ℃下的亞硝酸鹽含量，且含量在不同糟制溫度下的差異極顯著（P＜0.05）。室溫環(huán)境下溫度越高，魚肉中的微生物更容易分解亞硝酸鹽，也可能是室溫更有利于亞硝酸鹽的降解[13]。按照我國(guó)食品安全管理規(guī)定，腌制食品中亞硝酸鹽含量不應(yīng)超過20 mg/kg[14]。

圖8 酒糟魚糟制過程中亞硝酸鹽含量變化

2.7 酒糟魚蛋白組成含量的測(cè)定

肌漿蛋白為水溶性蛋白質(zhì)，主要與魚肉的呈味特性和色澤有關(guān)，還可參與細(xì)胞的代謝反應(yīng)[15]。由圖9可以看出，隨著糟制時(shí)間的延長(zhǎng)，肌漿蛋白含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，一方面是由于酒糟魚發(fā)酵過程中pH下降導(dǎo)致肌漿蛋白等可溶性蛋白發(fā)生變性，溶解度下降，含量減少；另一方面原因是pH下降導(dǎo)致魚肉組織蛋白的水解，產(chǎn)生氨基酸和肽類等物質(zhì)。圖5所示TCA-可溶性肽含量的增加也同樣證實(shí)了蛋白質(zhì)在糟制中發(fā)生的水解現(xiàn)象。隨著溫度升高，肌漿蛋白含量越高，這可能是由于溫度升高，內(nèi)源酶及組織蛋白酶活增強(qiáng)，酒糟魚蛋白質(zhì)溶解度也隨之升高，魚肉鮮度降低。

圖9 酒糟魚糟制18 d肌漿蛋白含量的變化過程

肌原纖維蛋白為鹽溶性蛋白質(zhì)，在魚肉糟制過程中易受溫度和pH等因素影響。從圖10可以看出，相較于肌漿蛋白，肌原纖維蛋白含量略低。不同溫度下，隨著糟制時(shí)間的延長(zhǎng)，肌原纖維蛋白含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，和肌漿蛋白含量變化趨勢(shì)相似，這同樣是由于酒糟魚在糟制發(fā)酵過程pH下降導(dǎo)致肌原纖維蛋白這種可溶解蛋白的溶解度下降和蛋白水解現(xiàn)象。糟制溫度升高，蛋白質(zhì)溶解度隨之升高，肌原纖維蛋白含量增多。

圖10 酒糟魚糟制18 d肌原纖維蛋白含量的變化過程

不溶性蛋白指不溶于水以及鹽溶液的剩余殘?jiān)糠?，它與魚肉嫩度關(guān)系密切。由圖11可以看出，不溶性蛋白含量比肌漿蛋白和肌原纖維蛋白含量高。在第3～第18天，不溶性蛋白含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這是由于pH下降以及蛋白質(zhì)發(fā)生水解，導(dǎo)致肌漿蛋白以及肌原纖維蛋白這兩種可溶解性蛋白含量降低，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成不溶性蛋白導(dǎo)致含量增多。同一時(shí)間內(nèi)，溫度越高含量越低，這是由于可溶性蛋白溶解度隨著溫度升高而升高，轉(zhuǎn)化成不溶性蛋白含量隨之減少。

圖11 酒糟魚糟制過程中不溶性蛋白含量變化趨勢(shì)

2.8 不同糟制溫度下酒糟魚感官評(píng)定

食品感官評(píng)定在食品中應(yīng)用非常廣泛，它可以在一定程度上反應(yīng)食品的某些感官品質(zhì)的優(yōu)良與否，感官評(píng)定來評(píng)價(jià)食品的品質(zhì)，簡(jiǎn)單易行、直觀性強(qiáng)[16]。從圖12可看出，16 ℃下糟制的魚肉質(zhì)構(gòu)品質(zhì)較好，且酒香味比4 ℃和12 ℃下的更濃郁，外觀品質(zhì)隨著溫度的升高而提高。綜合評(píng)定，16 ℃下的感官品質(zhì)最受歡迎。

圖12 不同糟制溫度下酒糟魚感官評(píng)定

3 結(jié)論與討論

通過研究不同溫度（4，12和16 ℃）下糟制18 d對(duì)酒糟魚品質(zhì)特性的影響，結(jié)果表明：隨著糟制時(shí)間的延長(zhǎng)，pH呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，粗蛋白含量0～18 d內(nèi)有小幅度減少，并無顯著變化，TCA-可溶性肽含量、揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量都逐漸升高，氨基酸態(tài)氮含量先增加后減少，亞硝酸鹽含量逐漸降低，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白含量降低，不溶性蛋白含量升高。隨著糟制溫度升高，變化趨勢(shì)越明顯。結(jié)合感官評(píng)定結(jié)果，16 ℃下的糟制魚肉在質(zhì)構(gòu)和口感方面品質(zhì)最好。綜上說明在不同糟制溫度下酒糟魚蛋白質(zhì)發(fā)生了不同程度的降解，且溫度升高蛋白質(zhì)降解越劇烈。