海洋源復(fù)合多肽固體飲料的研制及其活性評價(jià)

肖盼盼，張豪，古敏晴，李飛飛，王新文，李文保

1.深圳市華大海洋生物醫(yī)藥技術(shù)研究院（深圳 518000）；2.深圳華大海洋科技有限公司（深圳 518000）

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球共有約1.86億人患不孕不育癥。造成不孕不育的其中一個(gè)原因是男性性功能障礙[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1995年全球男性性功能障礙患病人數(shù)為1.52億，預(yù)計(jì)2025年患病人數(shù)將達(dá)到3.22億[2]。我國一項(xiàng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)40～49，50～59和60～69歲的男性，患病率分別達(dá)55.3%，88.2%和91.8%[3]。然現(xiàn)有治療藥物，常伴有副反應(yīng)[4]。

疲勞是亞健康的主要癥狀之一[5]，影響著全球超過30%的人口[6-7]。疲勞常通過藥物及營養(yǎng)補(bǔ)充來緩解[8]，但服用藥物，可能會(huì)引發(fā)一些不良反應(yīng)[9]。營養(yǎng)補(bǔ)充產(chǎn)品可能含有興奮劑，不適用于所有群體[10]。因此，開發(fā)一款安全有效的食源性功能產(chǎn)品，對患者進(jìn)行營養(yǎng)干預(yù)，有助于改善男性性功能障礙及疲勞狀態(tài)。

海洋是開發(fā)功能性食品的重要資源[11]。牡蠣，具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，具有增強(qiáng)男性性功能、抗疲勞的功效[12-14]。海參是世界八大珍品之一，具有抗疲勞、提高免疫力、抗癌等生物活性[15]。我國鰻魚的養(yǎng)殖規(guī)模和加工產(chǎn)量占全球60%以上[16]，《日華子本草》記載：鰻魚可起陽、治勞，補(bǔ)不足[17]。

以海洋源牡蠣肽、海參肽、鰻魚肽為原料，利用動(dòng)物試驗(yàn)，研究三者不同配比對提高男性性功能及疲勞的調(diào)節(jié)作用，從而明確海洋源復(fù)合多肽固體飲料中主要功能成分及最佳配比。在此基礎(chǔ)上，以VC、糖醇、速溶咖啡粉為輔料，以感官評價(jià)為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，確定產(chǎn)品最佳配方，旨在得到一款具有增強(qiáng)男性性功能及抗疲勞活性，兼具獨(dú)特風(fēng)味及口感的新型固體飲料，以期為男性性功能障礙患者及疲勞人群提供一種安全無后顧之憂的新選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡蠣肽、海參肽（山西原生肽科技有限公司）；鰻魚肽（德州藍(lán)力生物技術(shù)有限公司）；糖醇（山東福田藥業(yè)有限公司）；速溶咖啡粉（德宏后谷咖啡有限公司）；競品1和2（購自網(wǎng)絡(luò)購物平臺）；苯甲酸雌二醇、黃體酮[上海全宇生物科技（駐馬店）動(dòng)物藥業(yè)有限公司]。

1.2 儀器與設(shè)備

HC200C槽型混合機(jī)（寶雞建華制藥機(jī)械有限公司）；國家統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)篩（上虞市道墟五四儀器廠）；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；AUW120D型電子天平[島津企業(yè)管理（中國）有限公司]；Varioskan LUX全波長酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾科技）；XR-XM101游泳箱（上海欣軟信息科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

ICR雄性小鼠195只，雌性小鼠325只（18～22 g），由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供。SPF級動(dòng)物房，溫度25±2 ℃，濕度40%～70%，明暗交替時(shí)間為12 h/12 h。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 工藝流程

原料篩選→粉碎過篩→稱料→混合調(diào)配→填充→包裝→熱收縮→金屬探測→成品

1.4.2 主原料及原料配比篩選

1.4.2.1 抗氧化活性檢測

參考張瑞剛等[18]、曹明原等[19]的方法檢測牡蠣肽、海參肽及鰻魚肽的抗氧化活性。

1.4.2.2 性功能活性檢測

雄鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分組（表1），每組10只，受試樣品經(jīng)口灌胃，給予4周。雌鼠于試驗(yàn)結(jié)束前2周進(jìn)入動(dòng)物房，隨機(jī)分組，每組20只，于試驗(yàn)結(jié)束前2 d連續(xù)腹腔注射苯甲酸雌二醇（每只20 μg），觀察前4 h腹腔注射黃體酮（每只500 μg），使之進(jìn)入動(dòng)情期。末次給藥后，于當(dāng)晚20：00～23：00，在安靜、弱光的室內(nèi)將雄鼠分別單獨(dú)放入籠中，適應(yīng)環(huán)境10 min，每只雄鼠投入2只雌鼠，攝錄20 min內(nèi)小鼠的交配行為[20]。統(tǒng)計(jì)各組小鼠的性行為指標(biāo)，包括捕捉潛伏期（投入雌鼠與雄鼠第1次捕捉雌鼠的時(shí)間間隔）、捕捉次數(shù)（雄鼠捕捉雌鼠的次數(shù)）、射精潛伏期（投入雌鼠與雄鼠第1次射精的時(shí)間間隔）、射精次數(shù)（雄鼠射精的次數(shù)）[21]。

1.4.2.3 抗疲勞活性檢測

試驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分組（表1），每組10只，受試樣品經(jīng)口灌胃，給予6周。末次給予受試樣品30 min后，將尾根部負(fù)荷5%體重鉛皮的小鼠置于游泳箱中游泳。水深不少于20 cm，水溫22±2 ℃，記錄小鼠自游泳開始至力竭的時(shí)間，即小鼠負(fù)重游泳時(shí)間[22]。

表1 動(dòng)物試驗(yàn)方案

1.4.3 優(yōu)化試驗(yàn)

1.4.3.1 單因素試驗(yàn)

在主成分及配比確定的前提下，以感官評分為評價(jià)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)分別探究VC添加量（0.10%，0.15%，0.20%，0.25%和0.30%）、糖醇添加量（50%，55%，60%，65%和70%）及速溶咖啡粉添加量（2.5%，5.0%，7.5%，10.0%和12.5%）對固體飲料品質(zhì)的影響?？疾靻我蛩貢r(shí)，其他指標(biāo)以中間值為固定的參數(shù)條件。

1.4.3.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以VC、糖醇及速溶咖啡粉的添加量為自變量，以感官評分為指標(biāo)，進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)。通過正交試驗(yàn)及方差分析優(yōu)化固體飲料配方，正交組合設(shè)計(jì)見表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表 單位：%

1.4.4 感官評價(jià)指標(biāo)

參考唐森等[23]、王帥等[24]的方法對產(chǎn)品進(jìn)行感官評定，感官品質(zhì)綜合評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 感官評分標(biāo)準(zhǔn)表

1.4.5 產(chǎn)品活性檢測

待產(chǎn)品配方確定后，對其進(jìn)行性功能及抗疲勞活性檢測。

1.4.6 營養(yǎng)及質(zhì)量檢測

按照GB 7101—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲料》、GB/T 29602—2013《固體飲料》及GB 2762—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》的要求，對產(chǎn)品進(jìn)行營養(yǎng)及質(zhì)量檢測。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用雙尾t-檢驗(yàn)，其中P＜0.05代表有顯著性差異，P＜0.01代表有極顯著性差異。選用GraphPad Prism 6軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 主原料及原料配比篩選

2.1.1 主原料抗氧化活性檢測

據(jù)報(bào)道，抗氧化物質(zhì)可消除過度生成的自由基，改善精子活力和活性[25]，可與內(nèi)源性自由基相互作用，減少機(jī)體氧化損傷，減少疲勞產(chǎn)生[11]。研究發(fā)現(xiàn)（表4），鰻魚肽、牡蠣肽及海參肽均具有抗氧化活性，相較，牡蠣肽活性最強(qiáng)。因此，篩選牡蠣肽為必備功效成分，復(fù)配鰻魚肽和（或）海參肽，進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)，以確定產(chǎn)品功效成分及最佳配比。

表4 抗氧化活性檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.1.2 主原料性功能活性檢測

性功能檢測指標(biāo)中，捕捉潛伏期及射精潛伏期越短，捕捉次數(shù)及射精次數(shù)越多則其活性越好[21]。分析發(fā)現(xiàn)（圖1）：與CT組相比，P2、P4、P5、P7、P8和P9組的捕捉潛伏期顯著縮短，捕捉次數(shù)顯著增加；P4組射精潛伏期顯著縮短，射精次數(shù)顯著增加；P5、P6、P7和P8組的射精次數(shù)顯著增加。綜合發(fā)現(xiàn)，P4組各指標(biāo)均顯著改善，具有最強(qiáng)的性功能增強(qiáng)活性。

圖1 性功能活性檢測結(jié)果圖

2.1.3 主原料抗疲勞活性檢測

運(yùn)動(dòng)耐力的提高是抗疲勞最有力的表現(xiàn)，負(fù)重游泳時(shí)間越長則抗疲勞活性越強(qiáng)[22]。由圖2可知，與CT組相比，P1、P3、P4、P5和P6組負(fù)重游泳時(shí)間顯著延長（P＜0.05），具有抗疲勞活性，其中P4組負(fù)重游泳時(shí)間由528.5 s提高至786.4 s，延長48.8%。

圖2 抗疲勞活性檢測結(jié)果

2.2 配方優(yōu)化——單因素試驗(yàn)

結(jié)合性功能及抗疲勞活性檢測結(jié)果，確定產(chǎn)品功效成分為牡蠣肽及海參肽，添加比例為10∶1（g/g）。在此基礎(chǔ)上，以感官評價(jià)為指標(biāo)確定（VC）、糖醇及速溶咖啡粉的添加量。

2.2.1 VC添加量的確定

VC是多細(xì)胞生物必不可少的營養(yǎng)素[26]，其對固體飲料感官品質(zhì)的影響如圖3所示。隨著VC添加量的增加，感官評分呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，其最適添加量為0.20%。

圖3 VC添加量對產(chǎn)品感官評分的影響

2.2.2 糖醇添加量的確定

與蔗糖相比，糖醇具有低熱量、耐受量高、不致齲齒等優(yōu)點(diǎn)，因此常作為代糖用于食品中[27]。分析圖4發(fā)現(xiàn)，糖醇對產(chǎn)品的甜度有很大影響，其最適添加量為65%。

圖4 糖醇添加量對產(chǎn)品感官評分的影響

2.2.3 速溶咖啡粉添加量的確定

咖啡是世界“三大飲料”之一，風(fēng)味獨(dú)特，深受現(xiàn)代人喜愛[28]。分析圖5發(fā)現(xiàn)，速溶咖啡粉最適添加量為7.5%。

圖5 速溶咖啡粉添加量對產(chǎn)品感官評分的影響

2.3 配方優(yōu)化

2.3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

采用正交試驗(yàn)及方差分析對固體飲料配方進(jìn)行優(yōu)化。分析表5可知，各因素對固體飲料感官評分的影響主次順序?yàn)镃＞A＞B，即速溶咖啡粉添加量＞VC添加量＞糖醇添加量。由表6方差分析可知，VC添加量、速溶咖啡粉添加量對固體飲料感官評分有極顯著的影響。通過極差分析法分析得到最優(yōu)組合A1B2C2，即VC添加量0.20%、糖醇添加量65%、速溶咖啡粉添加量7.5%。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

表6 正交試驗(yàn)方差分析

2.3.2 單因素效應(yīng)分析

為比較各因素對固體飲料風(fēng)味的影響，對各因素進(jìn)行鄧肯檢驗(yàn)分析，結(jié)果見表7～表9。分析發(fā)現(xiàn)，VC添加量及速溶咖啡粉添加量的各水平間均具有顯著性差異，糖醇添加量的水平2和3間具有顯著性差異，且各輔料最適添加量分別為A1、B2和C2，即VC添加量0.20%、糖醇添加量65%、速溶咖啡粉添加量7.5%，與極差分析結(jié)果相一致。

表7 VC添加量單因素效應(yīng)分析

表9 速溶咖啡粉添加量單因素效應(yīng)分析

表8 糖醇添加量單因素效應(yīng)分析

2.4 產(chǎn)品感官結(jié)果驗(yàn)證

通過試驗(yàn)確定牡蠣肽與海參肽添加比例10∶1（g/g），VC 0.20%、糖醇65%，速溶咖啡粉7.5%。在此條件下，經(jīng)過3次重復(fù)性試驗(yàn)驗(yàn)證，感官評定平均綜合評分為93.2分。

2.5 產(chǎn)品活性檢測

2.5.1 產(chǎn)品性功能活性檢測

對產(chǎn)品（P）進(jìn)行性功能活性檢測，并與市場流通較好的2個(gè)競品（J1、J2）進(jìn)行比較。分析圖6發(fā)現(xiàn)，與CT相比，P組的各項(xiàng)性行為指標(biāo)均顯著改善，表明P組具有顯著的性功能增強(qiáng)活性。與J1組相比，P組各項(xiàng)性行為指標(biāo)均強(qiáng)于J1組，其中捕捉潛伏期、射精潛伏期及射精次數(shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（P＜0.05）。與J2組相比，其射精潛伏期顯著縮短，射精次數(shù)顯著增加（P＜0.05），表明產(chǎn)品的性功能增強(qiáng)活性強(qiáng)于2個(gè)競品。

圖6 產(chǎn)品性功能活性檢測

2.5.2 產(chǎn)品抗疲勞活性檢測

對產(chǎn)品（P）進(jìn)行抗疲勞活性檢測，并與市場流通較好的2個(gè)競品（J1、J2）進(jìn)行比較。分析圖7發(fā)現(xiàn)，與CT、J1、J2組相比，P組的游泳時(shí)間均顯著延長，表明P組具有顯著的抗疲勞活性且活性強(qiáng)于2個(gè)競品。

圖7 產(chǎn)品抗疲勞活性檢測

2.6 產(chǎn)品營養(yǎng)及質(zhì)量檢測

對研發(fā)的海洋特色復(fù)合多肽固體飲料進(jìn)行營養(yǎng)及質(zhì)量檢測，結(jié)果顯示（表10），研發(fā)的產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量豐富（24.8 g/100 g），脂肪含量低（2.5 g/100 g），含有鋅元素（8.47 mg/100 g），且微生物指標(biāo)及理化指標(biāo)均符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，是一款高蛋白低脂肪、營養(yǎng)豐富的安全產(chǎn)品。

表10 產(chǎn)品檢測結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)以海洋源多肽為主要原料，研制一款固體飲料，通過體內(nèi)外及單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)確定最佳配方：牡蠣肽與海參肽添加比例為10∶1（g/g），VC 0.20%，糖醇65%，速溶咖啡粉7.5%。按此配方研制的海洋特色復(fù)合多肽固體飲料是一款色澤均一，酸甜適宜，無腥味、無蔗糖、無香精色素，具有獨(dú)特咖啡風(fēng)味且各項(xiàng)指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)的天然功能食品。此外，活性試驗(yàn)表明，該固體飲料具有增強(qiáng)小鼠性功能及抗疲勞的作用，且活性強(qiáng)于市場流通較好的2個(gè)競品產(chǎn)品，具有開發(fā)應(yīng)用潛力，有望成為男性性功能障礙患者及疲勞人群的一種安全無后顧之憂的新選擇。