超聲波萃取苦荬菜葉中齊墩果酸的工藝優(yōu)化

珠拉，郝俊峰，榮榮，賈玉山，王志軍，格根圖*

1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，草原與資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼草栽培、加工與高效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（呼和浩特 010019）；2.興安盟林業(yè)和草原工作站（烏蘭浩特 137400）

苦荬菜（Ixeris polycephalaCass），為菊科苦荬菜屬一年生或多年生草本植物，在我國(guó)分布較廣，種質(zhì)資源也比較豐富[1-2]。苦荬菜抗旱、抗寒能力強(qiáng)[2]，適應(yīng)能力強(qiáng)[3]，可在惡劣環(huán)境中生長(zhǎng)?？噍げ死脧V泛，具有藥用、飼用及食用價(jià)值等。研究發(fā)現(xiàn)，苦荬菜富含黃酮類、三萜類和北半萜內(nèi)酯類，此外還有甾醇類、有機(jī)酸類、苯丙素類。齊墩果酸作為三萜類中含量較高的主要成分，具有減輕肝損傷、促進(jìn)肝細(xì)胞的再生、保肝、護(hù)肝、抑菌等生物活性作用[4-5]。孫陽(yáng)等[6]研究表明齊墩果酸可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，起到抗腫瘤作用。而將齊墩果酸作為添加劑代替抗生素添加進(jìn)飼料中，可以提高家畜的免疫力、應(yīng)激能力及改善畜產(chǎn)品品質(zhì)[7]。此外，苦荬菜莖葉鮮嫩多汁，粗蛋白質(zhì)達(dá)20%以上，常作為家畜喜食的優(yōu)質(zhì)青綠飼料[8]。國(guó)內(nèi)外的研究多集中于苦荬菜中黃酮類物質(zhì)的提取[2,9-11]、純化[12-13]、鑒定[1,14-15]與含量測(cè)定[9,16-18]，而對(duì)具有多種生物活性的齊墩果酸的了解不夠深入，仍需進(jìn)一步研究。近年來(lái)，隨著人們對(duì)養(yǎng)生的關(guān)注度逐漸加大，綠色、天然、營(yíng)養(yǎng)、保健的食品日益受到青睞[19]。因此，加大對(duì)植源性活性物質(zhì)的研究具有重要意義。

超聲波提取法是比較普遍的活性物質(zhì)提取方法，具有安全[20]、省時(shí)省力[21]、節(jié)約成本[22]、提取率高、有效物質(zhì)破壞少的特點(diǎn)[23]。超聲波提取法是通過(guò)熱效應(yīng)使細(xì)胞破裂，釋放有效物質(zhì)，從而達(dá)到提取效果[24]。試驗(yàn)以蒙早苦荬菜葉片為材料，通過(guò)超聲波提取法，研究不同時(shí)間、溫度、超聲頻率、料液比對(duì)蒙早苦荬菜葉中齊墩果酸提取量的影響，從而確定最佳提取工藝，旨在為苦荬菜的精深加工尋找新方向，也為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用齊墩果酸奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

初花期蒙早苦荬菜葉（置于避光處室溫陰干）。

甲醇（色譜級(jí)）；齊墩果酸（上海源葉生物科技有限公司）；其他均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

E2695-2489高效液相色譜紫外聯(lián)用儀[沃特世科技（上海）有限公司]；VOSHIN-1500C低溫超聲波萃取儀（無(wú)錫沃信儀器制造有限公司）；SHB-3A循環(huán)水真空泵（鄭州杜甫儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 蒙早苦荬菜葉齊墩果酸的提取

取1.00 g蒙早苦荬菜葉陰干樣放入盛有體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液的具塞錐形瓶中，在一定功率和時(shí)間下進(jìn)行超聲波提取，提取液經(jīng)離心（15 000 r/min，15 min）后，取上清液，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液定容到50 mL，搖勻，備用。

1.3.2 色譜條件

色譜柱為Waters RP C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸（85∶15，V/V）等度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量10 μL[2]。標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見(jiàn)圖1（A），樣品圖見(jiàn)圖1（B）。

圖1 齊墩果酸高效液相色譜圖

1.3.3 蒙早苦荬菜中齊墩果酸的測(cè)定

精密稱取35.075 mg齊墩果酸于100 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇溶液定容至刻度線，得質(zhì)量濃度為35.8 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取2，4，6，8，10和12 mL于25 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇溶液定容，得到質(zhì)量濃度分別為28.06，56.12，84.18，112.24，140.3和168.36 μg/mL的對(duì)照品溶液。通過(guò)0.22 μm微孔濾膜，上機(jī)檢測(cè)。以齊墩果酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程y=11.386x+2 094.3（R2=0.999 9）。

精確量取2.5 mL樣品溶液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，上機(jī)測(cè)定。按照得到的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品提取液中齊墩果酸的質(zhì)量濃度，每組平行3次，并按式（1）計(jì)算齊墩果酸的提取得率（mg/g）。

式中：C為蒙早苦荬菜葉齊墩果酸的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為提取液體積，mL；M為蒙早苦荬菜葉質(zhì)量，g。

1.3.4 方法學(xué)考察

1.3.4.1 精密度試驗(yàn)

取1.3.3的對(duì)照品溶液，按1.3.2的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄出峰面積，計(jì)算齊墩果酸峰面積的SRSD值，結(jié)果為0.13%，說(shuō)明儀器精密度較好。

1.3.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取6份1.3.1的供試品溶液，按1.3.2的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄出峰面積，計(jì)算齊墩果酸的SRSD值，結(jié)果為0.61%，說(shuō)明該方法重復(fù)性較好。

1.3.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1.3.1的供試品溶液，在室溫下靜置0，2，4，8，12和24 h，按1.3.2的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄出峰面積，計(jì)算齊墩果酸的SRSD值，結(jié)果為0.86%，說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

1.3.4.4 加樣回收試驗(yàn)

取6份已知含量的蒙早苦荬菜葉粉末樣品，每份稱取2.5 g，加入適量齊墩果酸對(duì)照品，按1.3.1的方法提取，在1.3.2的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄出峰面積，計(jì)算加標(biāo)回收率。平均回收率為97.10%，SRSD為0.07%，說(shuō)明該測(cè)定方法合理。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

在一定條件下，分別考察提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、超聲頻率（C）、料液比（D）對(duì)蒙早苦荬菜葉齊墩果酸得率的影響。

1.3.6 正交優(yōu)化試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)論，選擇提取時(shí)間、提取溫度、超聲頻率、料液比4個(gè)因素為自變量（X），蒙早苦荬菜齊墩果酸得率為考察指標(biāo)（Y），設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 2021軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)繪圖，使用SAS 9.4進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)齊墩果酸得率的影響

以體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇作為提取液，固定料液比1∶10 g/mL、超聲頻率20 kHz、提取溫度30 ℃，分別選擇提取時(shí)間20，40，60和80 min進(jìn)行試驗(yàn)。由圖2可知，齊墩果酸得率在提取時(shí)間20～80 min范圍內(nèi)呈下降—上升—下降趨勢(shì)。提取時(shí)間20 min時(shí)最高，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，齊墩果酸得率呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，這可能是由于提取時(shí)間的延長(zhǎng)，造成蒙早苦荬菜中其他醇溶性物質(zhì)的溶解，從而影響齊墩果酸得率[18]。因此，選擇提取時(shí)間20 min進(jìn)行下一步正交優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 提取時(shí)間對(duì)齊墩果酸得率的影響

2.1.2 提取溫度對(duì)齊墩果酸得率的影響

以體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇作為提取液，固定料液比1∶10 g/mL、超聲頻率20 kHz、提取時(shí)間20 min，分別選擇提取溫度30，40，50和60 ℃進(jìn)行試驗(yàn)。由圖3可知，齊墩果酸得率在提取溫度40～70 ℃范圍內(nèi)呈急劇上升而后下降的趨勢(shì)。提取溫度60 ℃時(shí)達(dá)到峰值，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。溫度太高或太低均會(huì)對(duì)齊墩果酸得率產(chǎn)生不良影響。溫度太高，可能會(huì)造成活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞和降解，而溫度太低會(huì)造成細(xì)胞破壞程度低，提取不夠充分[18,25]。因此，選擇提取溫度60 ℃進(jìn)行下一步正交優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 提取溫度對(duì)齊墩果酸得率的影響

2.1.3 超聲頻率對(duì)齊墩果酸得率的影響

以體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇作為提取液，固定料液比1∶10 g/mL、超聲溫度30 ℃、提取時(shí)間20 min，分別選擇超聲頻率40，60，80和100 kHz進(jìn)行試驗(yàn)。由圖4可知，齊墩果酸得率在超聲頻率40～100 kHz范圍內(nèi)呈先上升而后下降趨勢(shì)。超聲頻率40～60 kHz時(shí)增長(zhǎng)率最大，80 kHz時(shí)達(dá)到峰值，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，選擇超聲頻率80 kHz進(jìn)行下一步正交優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 超聲頻率對(duì)齊墩果酸得率的影響

2.1.4 料液比對(duì)齊墩果酸得率的影響

以體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇作為提取液，固定超聲溫度30 ℃、超聲頻率40 kHz、提取時(shí)間20 min，分別選擇料液比1∶10，1∶20，1∶30和1∶40 g/mL進(jìn)行試驗(yàn)。由圖5可知，齊墩果酸得率在1∶10～1∶40 g/mL范圍內(nèi)呈急劇上升而后下降趨勢(shì)。料液比1∶30 g/mL時(shí)達(dá)到峰值，隨著料液比的增加，齊墩果酸得率呈下降趨勢(shì)。料液比體現(xiàn)溶劑用量的大小。一般而言，溶劑用量越多，活性物質(zhì)的提取效率越大。但料液比中溶劑用量增加到一定程度時(shí)，植物中的有效成分基本析出，得率也將不會(huì)增加。過(guò)量的乙醇造成有機(jī)溶劑的浪費(fèi)[26]。因此，基于得率、溶劑用量的角度，選擇料液比1∶30 g/mL進(jìn)行下一步正交優(yōu)化試驗(yàn)。

圖5 料液比對(duì)齊墩果酸得率的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取時(shí)間、提取溫度、超聲頻率、料液比4個(gè)因素，各因素設(shè)定3個(gè)水平，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

由表2的極差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)齊墩果酸得率影響程度各不相同，主次順序依次為D＞A＞B＞C，即料液比對(duì)齊墩果酸得率的影響程度最大，其次為提取時(shí)間，超聲頻率的影響程度最小。根據(jù)K值，確定齊墩果酸的最佳提取條件A3B1C2D3，即提取時(shí)間60 min、提取溫度50 ℃、超聲頻率80 kHz、料液比1∶40 g/mL。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

為驗(yàn)證齊墩果酸提取工藝的可行性，在最佳提取工藝下，即提取時(shí)間60 min、提取溫度50 ℃、超聲頻率80 kHz、料液比1∶40 g/mL，測(cè)定3次，得到蒙早苦荬菜葉中齊墩果酸的平均得率為28.88 mg/g，SRSD為1.03%，說(shuō)明該方法可行。黃勤英等[27]研究表明在料液比1∶30 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)95%、提取時(shí)間60 min和提取溫度50 ℃條件下，苦丁茶中齊墩果酸的得率為11.86 mg/g（UV檢測(cè)）。劉偉等[28]研究表明在料液比1∶15 g/mL、體積分?jǐn)?shù)80%乙醇條件下，超聲1 h，在溫度60 ℃下回流1.5 h，沙棘中齊墩果酸的得率為0.875 mg/g（UV檢測(cè)）。通過(guò)與苦丁茶和沙棘中的齊墩果酸得率對(duì)比發(fā)現(xiàn)，蒙早苦荬菜葉中齊墩果酸的得率較高，原因可能為試驗(yàn)所選的蒙早苦荬菜葉與苦丁茶和沙棘材料不同，因而植物體內(nèi)所含齊墩果酸含量有所差異，也說(shuō)明蒙早苦荬菜葉是齊墩果酸含量較高的植物，可以作為提取齊墩果酸的天然植物來(lái)源。另外，提取工藝也是所含齊墩果酸含量差異的一個(gè)原因[18]，原料的預(yù)處理和檢測(cè)方法不同也會(huì)造成齊墩果酸含量有所差異。

由表3可知，提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）和料液比（D）對(duì)蒙早苦荬菜葉中齊墩果酸的提取量均有極顯著影響（P＜0.01）。

表3 方差分析結(jié)果

3 結(jié)論

蒙早苦荬菜通過(guò)超聲波提取法提取，并以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)做正交測(cè)驗(yàn)，各因素對(duì)苦荬菜齊墩果酸得率的影響程度為料液比＞時(shí)間＞溫度＞頻率。根據(jù)K值，最佳提取條件為A3B1C2D3，即提取時(shí)間60 min、提取溫度50 ℃、超聲頻率80 kHz、料液比1∶40 g/mL，在此條件下齊墩果酸的提取量為28.88 mg/g。試驗(yàn)結(jié)果為齊墩果酸的提取及應(yīng)用提供依據(jù)。