基于響應面的苦蕎萌發(fā)工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

郭麗麗，李小蘭，孫杰，楊曉瑩，王小敏，秦楠

山西中醫(yī)藥大學中藥與食品工程學院（晉中 030619）

苦蕎是一種營養(yǎng)價值很高的藥用及食用植物，廣泛種植于中國、日本、俄羅斯、歐洲等國家和地區(qū)。苦蕎中含有蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)，以及極為豐富的生物活性成分——黃酮類化合物，具有明顯的降血糖、降血脂、降血壓、抗腫瘤、抗氧化、消除體內(nèi)自由基、增強免疫力及保護心腦血管等多種功效，被開發(fā)為膠囊、片劑、粉末、醋和茶等多種功能食品形式，備受消費者青睞。然而，苦蕎籽粒所具有的苦、澀、硬等感官特性，加之未加工苦蕎中存在的較多抗營養(yǎng)因子，在一定程度上限制了苦蕎原料的廣泛開發(fā)利用，因此，有必要對苦蕎資源的合理加工及應用途徑進行研究，在滿足民眾對食品多樣化與營養(yǎng)化消費需求的同時，增強對該資源利用的產(chǎn)業(yè)化和豐富化。

研究表明，苦蕎籽粒經(jīng)萌發(fā)處理后，不僅因質(zhì)地改變而提高其中蛋白質(zhì)和淀粉的生物利用度，降低或消除有毒、有害、抗營養(yǎng)物質(zhì)含量，更重要的是可提高γ-氨基丁酸、游離氨基酸等生物活性物質(zhì)的含量，尤其是蘆丁、槲皮素等黃酮類活性化合物含量顯著增加，抗氧化能力也明顯增強，這表明萌發(fā)是提升苦蕎食用品質(zhì)和營養(yǎng)價值的有效途徑。不同的發(fā)芽條件會造成發(fā)芽能力、生物代謝途徑、代謝物合成種類和數(shù)量等方面的差異，進而影響苦蕎芽的營養(yǎng)和功能特性，研究苦蕎籽的萌發(fā)工藝對于有效富集苦蕎資源中的生物活性成分，從而促進對其合理開發(fā)利用具有重要意義。試驗采用響應面法對苦蕎麥的萌發(fā)工藝進行系統(tǒng)研究，對萌發(fā)過程中蘆丁、槲皮素等黃酮類化合物的含量進行實時監(jiān)測，并比較萌發(fā)前后苦蕎麥的抗氧化活性，以期為促進苦蕎及其黃酮類物質(zhì)的深度開發(fā)利用、研制和開發(fā)新型苦蕎食品提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎籽粒（山西田澤雜糧種子有限公司）；蘆丁標準品（批號195128）、L-抗壞血酸標準品（批號190120），均來自上海融禾醫(yī)藥科技公司；槲皮素標準品（批號C12110861，上海麥克林生化科技有限公司）；2, 2-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，批號AK112904，合肥博美生物科技有限責任公司）；1, 1-二苯基-2-苦肼基（DPPH，批號CD29142801，北京酷來搏科技有限公司）；乙腈、甲醇、磷酸（均為色譜級，天津市北辰方正試劑廠）；超純水（娃哈哈飲用水有限公司）；其余試劑如亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、過硫酸鉀、硫酸銅、甲醇為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；U1tra-3600紫外可見分光光度計（北京普源精電科技股份有限公司）；GZX-9030MBE電熱鼓風干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；SB25-120超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；TD4Z-WS湘立離心機（湖南湘立科學儀器有限公司）；AR223CN電子天平（常州奧豪斯儀器有限公司）；RIGOL L-3000高效液相色譜儀（北京普源精電科技股份有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 苦蕎萌發(fā)及處理方法

苦蕎萌發(fā)及處理參考文獻[1]。將苦蕎種子進行去雜、篩選、清洗等預處理，去除原料中的未成熟、不飽滿粒，得到干凈均勻的苦蕎種子。將種子置于浸濕的紗布中，采用4層紗布墊底、2層紗布覆蓋的方式對種子進行萌發(fā)處理。萌發(fā)后的種子置于60 ℃電熱鼓風干燥箱干燥2 h，脫殼，磨成粉末待用。

1.3.2 發(fā)芽率測定

每組苦蕎麥種子樣品為100粒，每次萌發(fā)完成后統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)量，按式（1）計算發(fā)芽率[2]。

1.3.3 總黃酮含量測定

準確稱取1.0 g苦蕎粉末，精確至0.001 g，置于100 mL三角瓶中，加入30 mL 70%甲醇溶液，在50 ℃下超聲浸提30 min后于3 000 r/min離心10 min，上清液用70%甲醇溶液定容至50 mL作為待測液。分別準確量取5.0 mL試樣待測液及0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 mL 0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液置于25 mL容量瓶，加水至6 mL，加1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻后放置6 min，加1 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻后放置6 min，加10 mL 4%氫氧化鈉溶液，加水至刻度，搖勻，靜置15 min，于508 nm測定標準液及待測液的吸光度[3]。以蘆丁標準溶液濃度為橫坐標，相應吸光度為縱坐標，制得標準曲線并得到線性回歸方程y=9.668 8x+0.017（R2=0.994 0），繼而將待測液吸光度代入方程求出樣品中的總黃酮濃度，按照式（2）得總黃酮含量（X，mg/g）。

式中：C為計算所得的測定液總黃酮濃度，mg/mL；V1為測定溶液總體積，25 mL；V2為待測液取樣體積，5 mL；V3為待測液總體積，50 mL；m為苦蕎粉末質(zhì)量，1.0 g。

1.3.4 苦蕎萌發(fā)工藝的單因素試驗

選取苦蕎種子若干組，每組100粒，分別在一定的浸泡時間（6，8，10，12和14 h）、萌發(fā)時間（48，53，58，63和68 h）和萌發(fā)溫度（15，20，25，30和35 ℃）下進行萌發(fā)，分別測定發(fā)芽率和總黃酮含量，并計算綜合評分，其中各因素固定水平為浸泡時間8 h、萌發(fā)時間58 h、萌發(fā)溫度25 ℃。

采取加權法計算綜合評分，將發(fā)芽率和總黃酮含量兩者的權重均設為50。

1.3.5 苦蕎萌發(fā)工藝的響應面試驗

在單因素試驗基礎上，進一步研究浸泡時間（A）、萌發(fā)時間（B）和萌發(fā)溫度（C）3個因素之間的交互作用，以由發(fā)芽率和總黃酮含量組成的綜合評分為指標，采用Design-Expert軟件進行Box-Behnken三因素三水平響應面試驗（共17組），從而確定最優(yōu)的苦蕎萌發(fā)工藝。響應面因素水平編碼表如表1所示。

表1 響應面試驗因素與水平

1.3.6 苦蕎萌發(fā)過程中蘆丁和槲皮素的動態(tài)變化

按最佳萌發(fā)工藝進行苦蕎萌發(fā)，并分別精密稱取1.500 g萌發(fā)0，6，12，18，24，30，36，42，48，54和59 h并經(jīng)研磨過0.180 mm孔徑（80目）篩的苦蕎粉末，用40 mL 70%甲醇溶液超聲提取30 min后抽濾，提取液用70%甲醇溶液定容至50 mL，得樣品溶液。進行HPLC分析，記錄蘆丁和槲皮素的峰面積，采用外標法進行含量測定，繪制苦蕎中蘆丁和槲皮素隨萌發(fā)過程的動態(tài)變化曲線。其中：蘆丁含量測定所用的標準曲線為y=25.662x-195.04，R2為0.999 7，線性范圍為10～100 μg/mL；槲皮素含量測定所用的標準曲線為y=34.544x-108.37，R2為0.999 6，線性范圍為10～50 μg/mL。

HPLC色譜條件[4]：Agilent ZORBAX EXTEND-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），進樣量10 μL，洗脫流速0.7 mL/min，柱溫35 ℃，DAD檢測器，檢測波長256 nm，流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B）。洗脫程序：0～8 min，15%～22% A；8～20 min，22% A；20～30 min，22%～30% A；30～32 min，30%～15% A。

1.3.7 萌發(fā)前后苦蕎的抗氧化活性比較

用70%甲醇溶液提取發(fā)芽前后苦蕎麥中的總黃酮（50 ℃下超聲浸提30 min），將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干得總黃酮提取物，進行體外抗氧化活性測定。

DPPH·清除能力的測定參照文獻[5]。分別取1 mL陽性對照VC和總黃酮提取物的系列稀釋溶液（0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL）置于試管中，分別加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH·自由基溶液，振蕩均勻后避光靜置20 min，在517 nm波長處測吸光度（A1）。以2 mL無水乙醇代替 DPPH溶液，同上測得各管吸光度（A2）；以1 mL無水乙醇代替樣品液為空白組，同上測得各管吸光度（A0）。DPPH·清除率按式（4）計算。

ABTS+·清除能力的測定參照文獻[6]。取7.4 mmol/L ABTS二胺鹽和2.6 mmol/L過硫酸鉀各1 mL，混合后暗處反應12 h，用無水乙醇稀釋40倍，得在734 nm處吸光度為 0.70的ABTS+·工作液。分別取1 mL陽性對照VC和總黃酮提取物的系列稀釋溶液（0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL）置于試管中，分別加入2 mL ABTS+·工作液，振蕩均勻后避光靜置30 min，在734 nm波長處測吸光度（A1）。以2 mL無水乙醇代替ABTS+·溶液，同上測得各管吸光度（A2）；以1 mL無水乙醇代替樣品液為空白組，同上測得各管吸光度（A0）。ABTS+·清除率計算同式（4）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.0軟件繪圖，試驗結(jié)果為3次平行的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 浸泡時間對苦蕎種子萌發(fā)的影響

隨著浸泡時間的延長，苦蕎籽發(fā)芽率整體呈升高趨勢（圖1A），這是因為通過浸種處理可活化相關酶類，從而使苦蕎種子解除休眠，促進后續(xù)萌發(fā)[7]。浸泡時間12 h時，發(fā)芽率達到85.67%，繼續(xù)延長浸泡時間，發(fā)芽率增長不顯著。與此同時，總黃酮含量也隨浸種時間的延長而逐漸上升，這可能與不斷升高的萌發(fā)程度有關系。隨著浸種時間的延長，發(fā)芽率不斷升高，萌發(fā)程度不斷增強，使得總黃酮含量不斷增大[8]?？傸S酮含量在浸種12 h時為11.18 mg/g，浸種時間繼續(xù)延長2 h，總黃酮含量增加0.26 mg/g，故從萌發(fā)效率兼顧生產(chǎn)的角度考慮，選擇浸泡時間12 h為響應面設計的0水平，此時綜合評分也較高（96.85分，圖1B）。

圖1 浸泡時間對苦蕎發(fā)芽率和總黃酮含量（A）及綜合評分（B）的影響

2.1.2 萌發(fā)時間對苦蕎種子萌發(fā)的影響

由圖2（A）可知，隨著萌發(fā)時間的延長，發(fā)芽率不斷升高，而總黃酮含量先增長后降低，萌發(fā)時間58 h時，總黃酮含量達到最高，說明適當延長萌發(fā)時間可在一定程度上提高總黃酮含量，但過長的萌發(fā)時間可能會過多消耗苦蕎種子中的營養(yǎng)物質(zhì)[9]，從而使得總黃酮含量降低，與Zhou等[10]的研究結(jié)果相一致。結(jié)合綜合評分（圖2B），選取58 h為響應面設計中萌發(fā)時間因素的0水平，此時綜合評分為95.81分。

圖2 萌發(fā)時間對苦蕎發(fā)芽率和總黃酮含量（A）及綜合評分（B）的影響

2.1.3 萌發(fā)溫度對苦蕎種子萌發(fā)的影響

在合理的萌發(fā)溫度下，適度升高溫度可以促進植物萌發(fā)。但溫度過高會導致苦蕎籽粒中的酶類物質(zhì)失去催化活力，從而抑制萌發(fā)。由圖3（A）可知，萌發(fā)溫度25 ℃時，發(fā)芽率和總黃酮含量均達到最大，這表明隨著萌發(fā)的進行，總黃酮含量不斷升高，當萌發(fā)受到抑制時，總黃酮的生物合成也隨之受到影響。彭濤等[11]以營養(yǎng)成分蘆丁和煙酸含量變化為指標，發(fā)現(xiàn)苦蕎萌發(fā)的最佳溫度為25 ℃，與試驗結(jié)果一致。蔡利等[12]以種子萌發(fā)率和總黃酮含量為指標研究了苦蕎種子萌發(fā)條件，結(jié)果也表明25 ℃為最佳溫度。然而，朱云輝等[13]采用苦蕎發(fā)芽富集γ-氨基丁酸，通過優(yōu)化條件，發(fā)現(xiàn)苦蕎發(fā)芽最佳溫度為32 ℃。這說明不同萌發(fā)條件會影響苦蕎中營養(yǎng)活性成分的合成累積，在接近室溫的溫度下萌發(fā)利于黃酮類化合物的合成轉(zhuǎn)化，而略高于室溫的溫度更利于氨基酸類化合物的富集形成。綜上，選取萌發(fā)溫度25 ℃為響應面設計的0水平，此時綜合評分為95.87分（圖3B）。

圖3 萌發(fā)溫度對苦蕎發(fā)芽率和總黃酮含量（A）及綜合評分（B）的影響

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗設計及結(jié)果

17組響應面試驗結(jié)果如表2所示。

表2 響應面試驗設計及試驗結(jié)果

2.2.2 模型建立及顯著性分析

運用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到二次多項回歸方程Y=97.47+2.86A+3.07B-3.67C-0.35AB-5.33AC-5.27BC-21.00A2-12.26B2-7.67C2。對回歸方程進行方差分析，結(jié)果如表3所示。模型達到極顯著水平（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），模型R2和Radj2分別為0.991 1和0.979 7，說明該模型具有較高的顯著性，與真實數(shù)據(jù)擬合程度好。由F值可以看出，各因素對綜合評分的影響程度為萌發(fā)溫度＞萌發(fā)時間＞浸泡時間，且3個因素的一次項及二次項對綜合評分的線性效應均極顯著。交互項中浸泡時間和萌發(fā)溫度相互作用、萌發(fā)時間和萌發(fā)溫度相互作用對綜合評分影響極顯著。

表3 響應面模型方差分析

2.2.3 響應面的交互作用分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結(jié)果進行二次響應面回歸分析，結(jié)果如圖4所示。

由圖4（A）可知，綜合評分隨著浸泡時間和萌發(fā)時間的延長而提高；到達一定范圍，綜合評分不再增加，即曲面圖的頂點處。繼續(xù)延長浸泡和萌發(fā)時間，綜合評分開始下降。相應的等高線接近圓形，表明這2個因素無顯著交互作用，與表3方差分析結(jié)果相一致。類似地，圖4（B）和4（C）分別反映綜合評分隨浸泡時間和萌發(fā)溫度及萌發(fā)時間和萌發(fā)溫度的變化，大致呈先上升后下降趨勢。就等高線而言，浸泡時間和萌發(fā)溫度相互作用及萌發(fā)時間和萌發(fā)溫度相互作用的等高線均呈橢圓形，表明圖4（B）和4（C）中的兩因素交互作用較顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖4 兩因素相互作用對綜合評分影響的響應面圖

2.2.4 驗證試驗

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件運行結(jié)果，以綜合得分最大值為指標，得到苦蕎萌發(fā)的最優(yōu)條件：浸泡時間12.18 h、萌發(fā)時間58.69 h、萌發(fā)溫度23.81 ℃，在此條件下模型預測的綜合評分為98.47分，發(fā)芽率為88.94%，總黃酮含量為11.93 mg/g?？紤]到實際操作，將最優(yōu)條件調(diào)整為浸泡時間12 h、萌發(fā)時間59 h、萌發(fā)溫度24 ℃，對苦蕎麥進行3次平行萌發(fā)，并按前述進行分析檢測，在該條件下發(fā)芽率為89.00%±1.00%，總黃酮含量為11.97±0.06 mg/g，驗證試驗綜合評分98.67±0.79分，接近模型預測值，說明所設計優(yōu)化的萌發(fā)工藝較合理。經(jīng)萌發(fā)后，苦蕎中總黃酮含量較萌發(fā)前（5.56±0.20 mg/g）提高115.3%。

2.3 苦蕎萌發(fā)過程中蘆丁和槲皮素含量的動態(tài)變化

由圖5可以看出，隨著苦蕎的萌發(fā)，蘆丁和槲皮素含量均呈上升趨勢，但蘆丁含量的增加總體明顯于槲皮素，這與石磊等[14]的研究結(jié)果類似，也與胡俊君等[15]所觀察到的苦蕎全粉中蘆丁、槲皮素等活性成分含量隨苦蕎發(fā)芽期（0～4 d）的變化趨勢相一致。Kim等[16]研究表明，隨著萌發(fā)的進行，品種Hokkai T 8苦蕎籽粒中的蘆丁含量逐漸下降，而品種Hokkai T 10籽粒中的蘆丁含量不斷上升，這表明苦蕎萌發(fā)期間活性成分的動態(tài)變化規(guī)律與苦蕎品種有關。試驗中，蘆丁含量在萌發(fā)24 h后增長明顯，而槲皮素含量的增加主要發(fā)生在萌發(fā)初期6～12 h內(nèi)。萌發(fā)至59 h時，蘆丁和槲皮素含量分別達到5.61和2.20 mg/g，蘆丁含量較未萌發(fā)時的2.04 mg/g提高1.75倍，這表明萌發(fā)后的苦蕎具有更高的營養(yǎng)價值，更適用于苦蕎相關功能食品的開發(fā)。

圖5 混合標準品的高效液相色譜圖（A）及苦蕎萌發(fā)過程中蘆丁、槲皮素的含量變化（B）

2.4 體外抗氧化活性的研究

通過測定比較萌發(fā)前后苦蕎對DPPH·和ABTS+·自由基的體外清除能力，結(jié)果表明萌發(fā)后苦蕎的抗氧化活性有所增強，且抗氧化活性與濃度呈正比（圖6），與周小理等[17]、王靜波等[18]研究結(jié)果相一致。1 mg/mL的苦蕎麥芽對DPPH·和ABTS+·自由基的清除率分別為95.83%和97.64%，是同濃度下陽性對照VC清除能力的96.91%和98.63%，較同濃度下未萌發(fā)苦蕎的92.04%和92.24%分別提高4.11%和5.53%。有研究表明，苦蕎芽中的VC、總黃酮以及蘆丁含量與其自由基清除能力呈顯著正相關[19]。Ryu等[20]通過相關分析進一步證實蘆丁是苦蕎茶中最主要的抗氧化物質(zhì)。試驗中，苦蕎經(jīng)萌發(fā)后蘆丁和總黃酮含量均大幅提高，這在一定程度上解釋了苦蕎麥芽抗氧化活性有所增強的現(xiàn)象。

圖6 萌發(fā)前后苦蕎對DPPH·自由基（A）和ABTS+·自由基（B）的清除能力

3 結(jié)論

試驗采用單因素結(jié)合響應面法優(yōu)化苦蕎萌發(fā)工藝，結(jié)果表明，將苦蕎籽粒室溫浸泡12 h后在24 ℃下萌發(fā)59 h，發(fā)芽率和總黃酮含量均較高，分別為89.00%和11.97 mg/g。采用HPLC法動態(tài)監(jiān)測苦蕎萌發(fā)過程中黃酮類成分蘆丁和槲皮素的含量變化，結(jié)果表明蘆丁和槲皮素含量均隨萌發(fā)過程的進行而增加，但蘆丁含量的增加主要發(fā)生于萌發(fā)24 h后，而槲皮素含量的增加主要發(fā)生于6～12 h的萌發(fā)初期，且槲皮素含量的整體增長幅度小于蘆丁含量。體外抗氧化活性分析表明，萌發(fā)后苦蕎的抗氧化活性較萌發(fā)前有所增強，說明萌發(fā)有利于富集蘆丁、槲皮素等黃酮類物質(zhì)，從而提高苦蕎抗氧化活性。由此可見，苦蕎麥芽是一種可用于抗氧化功能食品開發(fā)的優(yōu)良資源，可用于開發(fā)苦蕎芽茶、苦蕎芽飲料、苦蕎芽餅干、苦蕎芽酸奶等功能食品。