微波輔助一鍋串聯(lián)高效合成多樣性吖啶酯及其D-A-D 型pH 熒光探針的應(yīng)用

許根瑞，李偉強(qiáng)，吳沁，張周，黃超

(云南民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，生物基材料綠色制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南省高校智能超分子化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650503)

pH 在自然界發(fā)揮重要作用[1-3]，對pH 值的實(shí)時(shí)監(jiān)測一直是化學(xué)、生物、環(huán)境、醫(yī)療等領(lǐng)域研發(fā)的重要方向[4-5].目前傳統(tǒng)的pH 測定方法存在精準(zhǔn)度低、損害樣品等局限[6-7]，而pH 熒光探針法具有響應(yīng)迅速、可連續(xù)監(jiān)控、靈敏度高、可應(yīng)用于生物成像等優(yōu)點(diǎn)[8]，近年來受到廣泛關(guān)注.

吖啶酯類化合物是一種量子產(chǎn)率高、生物適應(yīng)性好、已部分商業(yè)化應(yīng)用于化學(xué)免疫分析、DNA檢測以及光電材料等領(lǐng)域的試劑[9-10]，其制備方法和發(fā)光應(yīng)用是研究熱點(diǎn)[11].已報(bào)道的吖啶酯制備方法，主要集中在吖啶母環(huán)的構(gòu)建上，普遍涉及了幾種類型的閉環(huán)反應(yīng)，如采用二苯胺與羧酸類化合物在ZnCl2的催化合成，以及芳香胺或疊氮化物與苯甲醛經(jīng)Pd 或Rh 催化合成等方式[12-14]，傳統(tǒng)方法存在效率低、底物耐受性有限、適用范圍小、過程不綠色等問題.因此，探索綠色高效制備方法及開發(fā)新型pH 熒光探針具有較好應(yīng)用前景.

基于本課題組前期pH 熒光探針[15]和微波輔助高效合成雜環(huán)化合物工作[16]，我們以靛紅與芳基硼酸衍生物為原料，微波輔助乙醇介質(zhì)下，一鍋兩步高效串聯(lián)合成具有分子多樣性的吖啶酯類化合物，利用該方法設(shè)計(jì)、合成D-A-D 型的吖啶酯，并研究了其pH 熒光探針性質(zhì).如圖1 所示.

圖1 吖啶酯的兩步一鍋法合成方法及底物擴(kuò)展Fig.1 Two-step one-pot synthesis method and substrate expansion of acridinium esters

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑GF-254 高效薄層色譜硅膠板(TLC)，山東青島海洋化工廠；BSA224S-CW 電子天平，賽多利科學(xué)儀器(北京)有限公司；Discover(單模)型微波合成儀，美國CEM 公司；Bruker AvanceⅢc-400 MHz 核磁共振波譜(NMR)儀，德國Bruker公司，以CDCl3為溶劑進(jìn)行測試，TMS 為內(nèi)標(biāo)；pH計(jì)FE28，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Aglient Cary Eclips 熒光光譜儀計(jì)，美國安捷倫公司.

乙醇(純度99%)、濃硫酸(純度98%)、超純水、二氯甲烷與乙酸銅(純度98%)，上海皓鴻生物醫(yī)藥科技有限公司；靛紅衍生物(純度99%)和芳基硼酸類衍生物(純度99%)，上海泰坦科技股份有限公司；所用試劑均為化學(xué)純或分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法目標(biāo)化合物3a～3l 的合成 以靛紅1（0.5 mmol）和苯硼酸2（1.5 mmol）為底物，加入干燥的10 mL 微波反應(yīng)試管中，以2.5 mL 醇為溶劑，再加入0.5 mmol 乙酸銅，1 mmol 三乙胺，置于微波合成儀中預(yù)攪拌30 s，在60 ℃下攪拌反應(yīng)30 min，用TLC 監(jiān)測反應(yīng)至完成后，不經(jīng)過任何處理，再次在微波管中加入10 mmol 濃硫酸，放置于微波合成儀中，125 ℃下反應(yīng)30 min，用TLC 監(jiān)測反應(yīng)至完成；將反應(yīng)溶液加入乙酸乙酯、飽和食鹽水萃取分離，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥過濾，所得濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑得粗產(chǎn)品，粗產(chǎn)品經(jīng)柱層析（0.054～0.077 mm,200～300 目）提純得到相應(yīng)目標(biāo)產(chǎn)物3.化合物3 的詳細(xì)條件篩選及核磁共振波譜譜圖見支撐文件.

吖啶-9-羧酸乙酯 (3a) 黃色固體；收率86%；熔點(diǎn) 61～63 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ: 8.12(dd，J=8.8 Hz，2H)，7.93～7.84 (m，2H)，7.63 (p，J=7.8 Hz，2H)，7.42 (p，J=7.9 Hz，2H)，4.61～4.49 (m，2H)，1.42～1.33 (m，3H)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ: 167.5，148.7，137.2，130.3，129.9，127.1，125.1，122.3，62.4，14.5；HRMS (ESI) C16H14NO2+[M+H]+m/z：計(jì)算值252.101 6，實(shí)測值252.1019.

2-甲氧基吖啶-9-羧酸乙酯 (3b) 黃色固體；收率76%；熔點(diǎn) 93～95 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：8.22 (dd，J=8.8 Hz，1H)，8.14 (d，J=9.5 Hz，1H)，8.01～7.99 (m，1H)，7.75～7.71 (m，1H)，7.60～7.58 (m，1H)，7.48 (dd，J=9.5 Hz，1H)，7.19 (d，J=2.7 Hz，1H)，4.70 (q，J=7.1 Hz，2H)，3.96 (s，3H)，1.55 (t，J=7.1 Hz，3H)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：168.0，158.2，147.1，146.2，134.5，131.7，130.1，129.2，127.3，125.8，124.7，123.7，122.9，100.3，62.3，55.6，14.6；HRMS (ESI) C17H16NO3+[M+H]+m/z：計(jì)算值282.112 0，實(shí)測值282.1125.

2，7-二甲氧基吖啶-9-羧酸乙酯 (3c) 黃色固體；收率72 %；熔點(diǎn) 98～100 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：8.11 (dd，J=9.4，2H)，7.43～7.39 (m，2H)，7.18 (d，J=2.7 Hz，2H)，4.70 (q，J=7.1 Hz，2H)，3.99～3.92 (m，6H)，1.56 (t，J=7.1 Hz，3H)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：168.0，158.4，144.1，131.5，124.4，124.1，100.3，62.1，55.6，14.7；HRMS (ESI)C18H18NO4+[M+H]+m/z：計(jì)算值312.123 1，實(shí)測值312.1230.

吖啶-9-羧酸甲酯 (3d) 黃色固體；收率89%；熔 點(diǎn) 43～46 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：8.28～8.25 (m，2H)，8.01～7.99 (m，2H)，7.81～7.77(m，2H)，7.60～7.56 (m，2H)，4.19 (s，3H)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：168.0，148.6，137.2，130.6，129.8，127.3，125.3，122.5，53.1；HRMS (ESI)C15H12NO2+[M+H]+m/z：計(jì)算值238.086 2，實(shí)測值238.0863.

吖啶-9-羧酸丙酯 (3e) 黃色固體；收率85%；熔點(diǎn) 76～79 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：8.25(d，J=8.8 Hz，2H)，8.01 (d，J=8.7 Hz，2H)，7.78～7.74 (m，2H)，7.58～7.53 (m，2H)，4.60～4.56(m，2H)，1.91～1.85 (m，2H)，1.06～1.02 (m，3H)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：167.7，148.7，137.3，130.3，130.0，127.1，125.2，122.4，68.0，22.2，10.6；HRMS (ESI) C17H16NO2+[M+H]+m/z：計(jì)算值266.117 4，實(shí)測值266.117 6.

再次，要有底線。中國共產(chǎn)黨從民主革命時(shí)期走到現(xiàn)在，經(jīng)歷了各種艱難困苦，特別是在和平年代，社會(huì)主義市場經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展使一些不良思想有一定抬頭，這就要求思想的堅(jiān)定和政治信仰的堅(jiān)定就非常重要了。所以，這就意味著每一名黨員必須要牢固樹立底線意識，作為青年學(xué)生，在日常工作、生活中，我始終堅(jiān)守底線，要有自己的原則，堅(jiān)持自己的政治信仰，要立志為社會(huì)主義事業(yè)貢獻(xiàn)自己的力量。

2-氟吖啶-9-羧酸乙酯 (3f) 黃色固體；收率79%；熔點(diǎn) 121～124 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：8.29～8.22 (m，2H)，8.06～8.03 (m，1H)，7.81～7.77 (m，1H)，7.66 (dd，J=9.9 Hz，1H)，7.64～7.58 (m，2H)，4.70 (q，J=7.2 Hz，2H)，1.55 (t，J=7.2 Hz，3H)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：167.3，161.9，159.4，148.4，148.3，146.3，136.4，136.3，133.0，132.9，130.3，130.3，130.2，127.9，124.9，122.9，122.8，122.8，122.4，122.2，107.7，107.4，62.7，14.6；HRMS (ESI)C16H13FNO2+[M+H]+m/z：計(jì)算值270.092 3，實(shí)測值270.0925.

2-氯吖啶-9-羧酸乙酯 (3g) 黃色固體；收率76%；熔點(diǎn) 127～129 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：8.26～8.18 (m，2H)，8.08～8.00 (m，2H)，7.84～7.80 (m，1H)，7.72 (dd，J=9.3 Hz，1H)，7.65～7.61 (m，1H)，4.72 (q，J=7.2 Hz，2H)，1.56 (t，J=7.1 Hz，3H)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：167.2，148.9，147.1，136.2，133.3，131.8，130.7，130.2，127.9，125.2，123.7，122.8，122.8，62.8，14.6；HRMS (ESI)C16H13ClNO2+[M+H]+m/z：計(jì)算值286.063 0，實(shí)測值286.0629.

2-溴吖啶-9-羧酸乙酯 (3h) 黃色固體；收率81%；熔點(diǎn) 131～134 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：8.30～8.21 (m，2H)，8.05 (d，J=8.7 Hz，1H)，7.81～7.77 (m，1H)，7.66 (dd，J=8.9 Hz，1H)，7.64～7.57 (m，2H)，4.70 (q，J=6.5 Hz，2H)，1.55 (t，J=7.2 Hz，2H)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：171.3，138.4，137.5，135.8，135.3，132.3，131.3，130.9，130.4，129.8，129.6，128.7，127.7，127.4，127.2，125.6，118.1，60.5，14.3；HRMS (ESI) C16H13BrNO2+[M+H]+m/z：計(jì)算值330.012 5，實(shí)測值330.0124.

2-甲基吖啶-9-羧酸乙酯 (3i) 黃色固體；收率79%；熔 點(diǎn) 102～107 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：8.24 (d，J=8.8 Hz，1H)，8.15 (d，J=8.9 Hz，1H)，7.99～7.98 (m，1H)，7.79～7.73 (m，2H)，7.64(dd，J=8.9 Hz，1H)，7.58～7.56 (m，1H)，4.71 (q，J=7.2 Hz，2H)，2.58 (d，J=1.1 Hz，3H)，1.55 (t，J=7.1 Hz，3H)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：167.9，148.2，147.9，137.3，136.1，133.4，130.1，129.9，129.7，1271.，125.1，123.2，122.6，62.4，22.3，14.6；HRMS (ESI)C17H16NO2+[M+H]+m/z：計(jì)算值 266.117 5，實(shí)測值266.1176.

2-叔丁基吖啶-9-羧酸乙酯 (3j) 黃色固體；收率73%；熔點(diǎn)：113～116 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：8.26～8.18 (m，2H)，8.03～8.00 (m，1H)，7.93～7.88 (m，2H)，7.77～7.75 (m，1H)，7.59～7.57(m，1H)，4.72 (q，J=7.1 Hz，2H)，1.56 (t，J=7.2 Hz，3H)，1.44 (s，9H)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：167.9，149.8，148.4，147.9，136.8，130.2，130.0，130.0，129.6，127.0，125.1，122.6，122.3，119.2，62.3，35.5，30.9，14.7；HRMS (ESI) C20H22NO2+[M+H]+m/z：計(jì)算值 308.164 2，實(shí)測值308.1645.

苯并[a]吖啶-12-羧酸乙酯 (3k) 黃色固體；收 率80%；熔 點(diǎn)88～91 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：8.46～8.43 (m，1H)，8.31～8.26 (m，1H)，8.02～7.95 (m，2H)，7.87～7.77 (m，3H)，7.64～7.55(m，3H)，4.72～4.67 (m，2H)，1.42 (t，J=7.2 Hz，3H)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：170.1，149.7，147.3，136.0，132.9，132.4，130.1，129.4，129.2，128.8，128.6，128.0，127.2，127.1，125.8，124.7，122.8，119.6，62.6，14.0；HRMS (ESI) C20H16NO2+[M+H]+m/z：計(jì)算值302.117 3，實(shí)測值302.1176.

2，7-二氟吖啶-9-羧酸乙酯 (3l) 黃色固體；收率71%；熔點(diǎn)108～110 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：8.25 (dd，J=9.5Hz，2H)，7.69 (dd，J=9.9 Hz，2H)，7.62～7.57 (m，2H)，4.70 (q，J=7.1 Hz，2H)，1.55(t，J=7.2 Hz，3H)；13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ：166.8，162.4，159.9，145.8，135.3，135.3，133.2，133.1，123.4，123.3，122.3，122.0，107.5，107.5，107.3，62.8，14.6；HRMS (ESI) C16H12F2NO2+[M+H]+m/z：計(jì)算值288.083 0，實(shí)測值288.083 1.

圖2 3a、3b、3c 分子結(jié)構(gòu)Fig.2 Molecular structure of 3a,3b,3c

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備用分析天平稱取待測化合物3a、3b、3c 各0.01 mmol，分別移至10 mL 容量瓶中，以V（乙醇）∶V(水)=1∶4 的混合液為溶劑溶解化合物，配置成濃度1×10-3mol/L 溶液作為母液待用.同時(shí)采用NaH2PO4、Na2HPO4為緩沖劑，以上述溶劑配制1.0 mol/L 鹽酸、氫氧化鈉溶液對pH 值進(jìn)行微調(diào)，制備具有不同pH 值的緩沖溶液.取50 μL 母液置于5 mL 比色皿中，用不同pH 值的緩沖液稀釋，制備一系列具有不同pH 值的1×10-5mol/L 探針溶液.

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)底物的擴(kuò)展以靛紅衍生物與苯硼酸衍生物為原料，微波輔助下一鍋兩步法順序進(jìn)行Chan-Lam[18]等多步串聯(lián)反應(yīng)，在上述優(yōu)化后的最佳反應(yīng)條件下，通過改變不同取代基的靛紅、芳基硼酸以及醇對合成吖啶酯類化合物3a 的反應(yīng)進(jìn)行普適性研究.結(jié)果表明，無論R1為供電子基團(tuán)還是吸電子基團(tuán)，產(chǎn)率變化不大.同時(shí)研究了空間位阻對反應(yīng)的影響，當(dāng)對位為叔丁基或苯環(huán)等大基團(tuán)取代時(shí)，也能以良好的產(chǎn)率得到目標(biāo)產(chǎn)物.當(dāng)R1為鹵素取代時(shí)有良好的反應(yīng)性，且產(chǎn)率能達(dá)到76%.當(dāng)R3基團(tuán)改變時(shí)，產(chǎn)率沒有明顯變化.最后，當(dāng)吖啶酯為雙取代時(shí)也能得到目標(biāo)產(chǎn)物，反應(yīng)產(chǎn)率略有降低.因此，此合成方法反應(yīng)條件簡單且普適性較廣.

2.2 化合物熒光測定在母液中分別取探針3a、3b、3c 溶液各50 μL 置于3 個(gè)5 mL 的比色皿中，用V(乙醇)∶V(水)=1∶4 溶劑稀釋，制得濃度為1×10-5mol/L 的溶液，用熒光光譜法分析測定其吸收光譜和熒光光譜，結(jié)果如圖3 所示.

從圖3 中我們可以看出，當(dāng)吖啶酯在母環(huán)區(qū)接入甲氧基時(shí)，探針的吸收和熒光光譜都發(fā)生了紅移現(xiàn)象，且3b (D-A)的激發(fā)波長出現(xiàn)了明顯的雙峰結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出吖啶酯3a (A)向2,7-二甲氧基吖啶酯3c (D-A-D)過渡的狀態(tài).

圖3 樣品在標(biāo)準(zhǔn)溶液中的激發(fā)波長（a）和發(fā)射波長(b)Fig.3 Excitation and emission wavelengths of samples in standard solutions

如圖4 所示，當(dāng)我們保持探針樣品濃度為1×10-5mol/L，pH 值不同時(shí)，溶液的熒光強(qiáng)度發(fā)生了明顯的變化，且探針在酸性緩沖溶液（pH 0～7）下熒光光譜發(fā)生了熒光猝滅現(xiàn)象（如小圖右上所示），而在堿性緩沖溶液（pH 8～14）下熒光強(qiáng)度卻沒有發(fā)生明顯的熒光改變（如小圖右中所示）.

圖4 探針3a、3b、3c 在pH 0～14 的緩沖溶液中響應(yīng)情況Fig.4 Response of probes 3a,3b,3c in buffer solution at pH 0-14

為了進(jìn)一步分析吖啶酯在酸性緩沖溶液下的熒光表現(xiàn)，我們將 pH 值的區(qū)間控制在 0.5 左右，即pH 0～7.5，再次進(jìn) 行熒光分析測定，結(jié)果如圖5 所示.

由圖5，我們發(fā)現(xiàn)隨著pH 值的降低熒光強(qiáng)度逐漸下降，且探針3a 的發(fā)射波長出現(xiàn)了略微的紅移現(xiàn)象，而3b、3c 的發(fā)射波長幾乎保持不變，及在498 nm 與530 nm 左右存在一個(gè)等吸收點(diǎn)，表明探針在緩沖溶液中存在酸堿電離平衡[19].為了探討探針對不同pH 值的依賴性，我們以探針3a、3b、3c 的pH 響應(yīng)作I/Imax與pH 值的函數(shù)，其中I是測量的熒光發(fā)射強(qiáng)度，Imax是探針的最大輸出.如圖6所示，發(fā)現(xiàn)3a、3b、3c 的熒光強(qiáng)度隨著pH 值的降低而降低，在酸性條件下顯示出良好的指示性能，其中3c 表現(xiàn)最佳，在pH 值1.94～4.06 中表現(xiàn)出明顯的線性關(guān)系，為后續(xù)吖啶酯類pH 熒光探針的應(yīng)用提供支撐.

圖5 探針3a、3b、3c 在pH 0～7.5 的緩沖溶液中響應(yīng)情況Fig.5 Response of probes 3a,3b,3c in buffer solution at pH 0-7.5

圖6 pH 與熒光強(qiáng)度比值Fig.6 pH to fluorescence intensity ratio

2.3 機(jī)理探討

2.3.1 合成吖啶酯可能的機(jī)理 根據(jù)吖啶酯的合成實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人的文獻(xiàn)報(bào)道[20]，提出了該反應(yīng)的可能機(jī)理(圖7).以產(chǎn)物3a 為例，靛紅(1a)與芳基硼酸(2a)在微波輔助乙醇介質(zhì)下，利用銅鹽與堿催化發(fā)生Chan-Lam 反應(yīng)，合成中間體N-苯基靛紅(I).產(chǎn)物N-苯基靛紅(I)在硫酸的作用下，發(fā)生開環(huán)和磺化反應(yīng)形成產(chǎn)物Ⅱ，Ⅱ的3 號羰基位點(diǎn)在酸性作用下發(fā)生分子內(nèi)親核反應(yīng)，與苯環(huán)的鄰位C 偶聯(lián)形成過渡態(tài)Ⅲ，Ⅲ再脫水形成吖啶磺酸酯Ⅳ，Ⅳ在乙醇相中發(fā)生酯交換，得到產(chǎn)物3a.

圖7 可能的合成反應(yīng)機(jī)理Fig.7 Possible mechanisms of synthesis

2.3.2 pH 熒光探針可能的機(jī)理 由于吖啶酯剛性骨架結(jié)構(gòu)的影響，其N 原子上存在的孤對電子可以與質(zhì)子發(fā)生作用[21]，因3a、3b、3c 對酸性都有熒光響應(yīng)，而堿性無明顯的響應(yīng)情況，提出pH 熒光探針可能的機(jī)理，見圖8.探針分子在質(zhì)子化后，發(fā)生了熒光猝滅，隨著pH 值的降低，H+濃度的升高，探針的質(zhì)子化也愈加嚴(yán)重，溶液的熒光強(qiáng)度逐漸降低.當(dāng)R1、R2基團(tuán)接入甲氧基這一具有供電性的基團(tuán)時(shí)，母環(huán)上的電子云密度更大，N/NH+推拉電子引起的共振效應(yīng)更明顯，表現(xiàn)出H+在更大的pKa情況下與N 絡(luò)合，擴(kuò)大了探針在酸性pH 值下的監(jiān)測范圍.

圖8 可能的探針反應(yīng)機(jī)理Fig.8 Possible mechanisms of probes

3 結(jié)論

綜上所述，本文以靛紅、芳基硼酸衍生物為原料，在微波輔助醇介質(zhì)下，一鍋法高效串聯(lián)環(huán)化合成了12 個(gè)吖啶酯類化合物，并設(shè)計(jì)合成D-A-D 型的吖啶酯，獲得了具有酸響應(yīng)的pH 熒光探針.該方法利用微波輔助合成，具有原料簡單易得、成鍵效率高、反應(yīng)時(shí)間短以及收率良好等特點(diǎn).基于本文報(bào)道的合成方法，D-A-D 型的吖啶酯顯現(xiàn)在酸性體系下能夠靈敏監(jiān)測pH 值的變化，有望在pH 實(shí)時(shí)監(jiān)測中獲得開發(fā)應(yīng)用.