固相萃取-離子遷移譜法快速篩查祛痘類化妝品中14種抗菌藥物

薛高旭, 王沁怡, 曹 玲, 孫 晶, 楊功俊, 馮有龍, 方 方

(1. 江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院, 江蘇 南京 210019; 2. 南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院, 江蘇 南京 210029; 3. 中國藥科大學藥學院, 江蘇 南京 211198)

隨著國民經濟的迅猛發(fā)展,人們對于美的追求越來越高,化妝品需求量急劇增加,一些不法商家為了迎合消費者的迫切需求,在化妝品中非法添加各種違禁的化學藥物,以暫時性提高化妝品功效,導致消費者使用后出現(xiàn)一些不良反應[1]。其中,禁用成分如抗真菌、抗生素類等抗菌藥如果隨意添加到祛痘類產品中,容易引起接觸性皮炎,表現(xiàn)為紅斑、水腫、糜爛、脫屑、瘙癢、灼熱等癥狀[2],甚至造成更嚴重的系統(tǒng)健康問題?，F(xiàn)階段用于檢測化妝品中非法添加化學藥物的技術主要為色譜技術和色譜-質譜聯(lián)用技術[3-6]。這些方法檢測時間長,儀器操作難度高,受場地等因素限制,不適用于現(xiàn)場快速篩查?，F(xiàn)階段實際投入非法添加現(xiàn)場篩查的技術較少,主要以理化鑒別技術為主[7],即利用待測化學成分的溶解度、官能團等性質與基質成分的不同,通過適當?shù)臉悠非疤幚砑夹g排除基質干擾,再根據(jù)待測化學成分的理化性質進行鑒別的技術。這些方法操作簡單,研發(fā)和檢測成本低,試劑盒種類多;但是檢出限較低,通用性較差,在有顏色的基質下受到干擾嚴重,在化妝品檢測中應用較少。因此,亟需新技術的引進。

離子遷移譜(ion mobility spectrometry, IMS)是20世紀中期發(fā)展起來的一種新型的微量氣相分離分析技術,因其具有小型化、操作簡便、響應迅速等優(yōu)點,可作為快篩方法應用于公共安全[8]等檢測。IMS儀是對氣相離子進行分析檢測的裝置,氣相組分可直接進入遷移管進行離子化并檢測,而對于液體及固體樣品則可分別經電噴霧離子化(electrospray ionization, ESI)和基質輔助激光解吸離子化等技術實現(xiàn)樣品導入。ESI作為一種軟電離源,能夠獲得被分析物的整體分子信息,非常適用于非揮發(fā)性或低揮發(fā)性化合物的分析[9],如常見化學藥物。已有相關文獻報道ESI-IMS成功應用于中藥[10]、化學藥品檢測[11-13]、食品及化妝品安全[14-18]等相關領域。但是目前ESI-IMS直接應用于化妝品中的禁用化學藥物檢測的成功案例較少。

推測阻礙ESI-IMS應用于化妝品中違禁物質篩查的原因主要有以下幾點:(1)ESI-IMS存在明顯的記憶效應[19](主要為離子抑制效應),化妝品經溶劑提取直接液體進樣,其基質會嚴重污染離子源,影響儀器的靈敏度和檢測結果的重現(xiàn)性;(2)化妝品基質常存在大量的表面活性劑,會產生一系列離子遷移譜峰,干擾違禁目標物質的判定,造成假陽性結果;(3)化妝品中添加的禁用物質濃度較低,樣品基質會嚴重抑制目標化合物在離子源中電離,單純提高樣品取樣量無法提高檢測靈敏度,易造成假陰性結果。因此很有必要優(yōu)化樣品的凈化過程,以適用于現(xiàn)場的快速篩查?；瘖y品基質復雜,常采用固相萃取(SPE)的方式進行凈化[20]。

根據(jù)日常檢驗工作及文獻報道,非法添加抗菌藥物的添加量一般在μg/g甚至mg/g量級[21]。本文建立了SPE結合IMS應用于祛痘類化妝品中14種抗菌藥物的快速篩查方法。由于離子遷移譜線性范圍較窄[22],不能準確定量,同時建立了高效液相色譜法(HPLC)的定量方法,用于SPE前處理的優(yōu)化和陽性樣品的驗證。方法簡便、快速、靈敏,提高了非法添加化學藥物篩查工作的效率,為監(jiān)管部門打擊化妝品生產經營中添加違禁化學藥物的違法行為提供了科學有效的技術手段。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

GA2100高效離子遷移譜儀配有電噴霧離子源、Vision儀器控制與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Excellims公司);AG-1620型空氣發(fā)生器(北京科普生分析科技有限公司);LC-30A高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司); XP6型電子天平(瑞士Mettler Toledo公司); MSE224S-CE電子天平(德國Sartorius公司);超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司); UA22MFD超聲波清洗儀(德國Wiggens公司),固相萃取儀(美國Supelco公司)。Oasis?MCX固相萃取柱(3 mL/60 mg, 30 μm)購自美國Waters公司。

鹽酸雙氟沙星(difloxacin hydrochloride,批號:G752673)和鹽酸沙拉沙星(sarafloxacin hydrochloride,批號:G752046)來源于Dr. Ehrenstorfer公司;氧氟沙星(ofloxacin,批號:130454-202007)、諾氟沙星(norfloxacin,批號:130450-201907)、培氟沙星(pefloxacin,批號:130459-201402)、依諾沙星(enoxacin,批號:130453-201802)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,批號:130451-201904)、氟康唑(fluconazole,批號:100314-201906)、鹽酸萘替芬(naftifine hydrochloride,批號:100823-200501)、酮康唑(ketoconazole,批號:100294-201904)、聯(lián)苯芐唑(bifonazole,批號:100326-201302)、克霉唑(clotrimazole,批號:100037-202008)、硝酸益康唑(econazole nitrate,批號:100214-202005)、硝酸咪康唑(miconazole nitrate,批號:100213-201406)、色氨酸(tryptophan,批號:140686-201904)均來源于中國食品藥品檢定研究院。甲醇(Merck公司,德國)、乙腈(Merck公司,德國)、氨水(阿拉丁試劑有限公司)均為色譜純。磷酸二氫鉀(國藥集團化學試劑有限公司)、磷酸(阿拉丁試劑有限公司)、三氯乙酸(阿拉丁試劑有限公司)均為分析純。

25批祛痘類化妝品均為市售,化妝品類型包含乳劑、水劑和膏霜劑,其中乳劑8批、水劑8批、膏霜劑9批。

1.2 標準溶液的配制

1.2.1IMS標準溶液

稱取各標準品約10.0 mg,分別置于25 mL量瓶中,用80%(v/v,下同)甲醇水溶液溶解并稀釋至刻度,配制成400 mg/L的標準儲備液(沙星類物質可加少量甲酸助溶)。分別量取0.50、1.00、2.00 mL至20 mL量瓶中,用80%甲醇水溶液稀釋至刻度,搖勻,作為各物質的IMS標準溶液。

1.2.2IMS校正溶液

稱取色氨酸約2.0 mg,分別置于10 mL量瓶中,用80%甲醇水溶液溶解并稀釋至刻度,配制成200 mg/L的IMS正離子模式校正溶液。

1.2.3HPLC標準溶液

稱取各標準品約1.0 mg,分別置于10 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,配制成100 mg/L的單標準溶液(沙星類物質可加少量甲酸助溶),另稱取依諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氟康唑、酮康唑、聯(lián)苯芐唑、硝酸益康唑、硝酸咪康唑標準品各5.0 mg,置于50 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,配制成100 mg/L的混合標準儲備液Ⅰ(沙星類物質可加少量甲酸助溶),然后用甲醇逐級稀釋至質量濃度約為5.0～80.0 mg/L的系列混合標準工作溶液Ⅰ。稱取氧氟沙星、培氟沙星、鹽酸雙氟沙星、鹽酸沙拉沙星、鹽酸萘替芬、克霉唑標準品各5.0 mg,分別置于50 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,配制成100 mg/L的混合標準儲備液Ⅱ,然后用甲醇逐級稀釋,配制質量濃度約為5.0～80.0 mg/L的系列混合標準工作溶液Ⅱ。

1.3 樣品前處理

取0.25 g樣品于15 mL離心管中,加入5.0 mL 80%(體積分數(shù),下同)乙腈水溶液(含0.2%(質量分數(shù))三氯乙酸),渦旋,混勻,超聲10 min后,5 000 r/min離心10 min,上清液待SPE柱凈化。

Oasis?MCX柱依次用3.0 mL甲醇、3.0 mL 1%(質量分數(shù),下同)三氯乙酸水溶液活化。將待凈化的樣品上清液流經SPE柱后,用3.0 mL甲醇淋洗SPE柱,棄去淋洗液,再用1.0 mL 2%氨水甲醇洗脫,收集洗脫液,搖勻,待測。

1.4 分析條件

1.4.1離子遷移譜條件

離子源為正離子模式,源電壓為2.2 kV,遷移管電壓為8.0 kV,進氣口溫度為180 ℃,遷移管溫度為180 ℃,離子柵門電壓為50 V,門電壓脈沖寬度為85 μs,遷移氣流速為1.2 L/min,排出氣流速為0.8 L/min,進樣速度為1.2 μL/min。儀器使用前用IMS校正溶液在正離子模式下校正儀器。

1.4.2HPLC驗證條件

色譜柱為Phenomenex luna C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流動相A: 0.01 mol/L磷酸二氫鉀(磷酸調節(jié)pH值為4.0),流動相B:乙腈;梯度洗脫:0～3 min, 20%B; 3～18 min, 20%B～95%B; 18～21 min, 95%B; 21～22 min, 95%B～20%B; 22～30 min, 20%B;流速為1.0 mL/min;進樣量為5 μL;柱溫為35 ℃;其中氟康唑的檢測波長為210 nm,其余化合物為230 nm。

2 結果與討論

2.1 實驗條件考察

2.1.1IMS檢測模式選擇

分別于正離子模式與負離子模式下檢測各抗菌藥物的出峰情況以及目標物的峰形。實驗結果發(fā)現(xiàn)14種抗菌藥物在正離子模式下均有較好的響應,因此,在正離子模式下檢測14種抗菌藥物。

2.1.2IMS離子源電壓優(yōu)化

在正離子模式下比較了離子源電壓(1.6 ～3.0 kV)對各抗菌藥物響應的影響,實驗結果如圖1所示。結果顯示,除克霉唑在2.6 kV時響應最好外,其他抗菌藥物在離子源電壓為2.2 kV時響應強度較好,綜合考慮,選擇2.2 kV作為離子源電壓。

圖1 不同離子源電壓下14種抗菌藥物的ESI-IMS響應Fig. 1 Responses of the 14 antibacterial drugs to differention source voltages analyzed by ESI-IMS ESI-IMS: electrospray ionization-ion mobility spectrometry.

2.1.3HPLC驗證條件優(yōu)化

實驗對流動相進行了優(yōu)化,比較了不同pH值的0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液,結果發(fā)現(xiàn)在pH值為4.0時各物質分離較好,但沙星類物質仍未能完全分開,因此將14種抗菌藥物分成兩組進行分離,依諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氟康唑、酮康唑、聯(lián)苯芐唑、硝酸益康唑、硝酸咪康唑為一組,氧氟沙星、培氟沙星、鹽酸雙氟沙星、鹽酸沙拉沙星、鹽酸萘替芬、克霉唑為另一組。各物質的回歸方程、線性范圍、檢出限見表1。

表1 HPLC測定14種抗菌藥物的線性方程、線性范圍、檢出限

2.1.4固相萃取柱的選擇

圖2 陰性樣品經(a)直接提取、(b)HLB柱、(c)ODS柱、(d)MCX柱和(e)WCX柱萃取的IMS譜圖Fig. 2 IMS spectra of a negative sample processed by (a) direct extraction and SPE extraction with (b) HLB, (c) ODS, (d) MCX, (e) WCX columns

考察了Oasis?HLB (3 mL/60 mg)、Oasis?MCX (3 mL/60 mg)、Oasis?WCX (3 mL/60 mg)、Cleanert?ODS (3 mL/300 mg) SPE柱對化妝品中基質的凈化效果。取0.25 g陰性樣品分別經Oasis?HLB、Oasis?WCX、Oasis?MCX、Cleanert?ODS SPE柱處理,在1.4.1節(jié)條件下進行IMS分析,實驗結果如圖2所示,發(fā)現(xiàn)Oasis?HLB、Oasis?WCX SPE柱都無法去除化妝品中的基質干擾,Cleanert?ODS和Oasis?MCX SPE兩柱可以去除化妝品中的基質干擾，考慮到待測物的性質,實驗選擇Oasis?MCX SPE柱做進一步優(yōu)化。

進一步考察了不同規(guī)格的Oasis?MCX SPE柱(3 mL/60 mg, 30 μm)與Oasis?MCX SPE柱(6 mL/150 mg, 30 μm)對回收率的影響。分別取200.0 μL混合標準儲備液Ⅰ與混合標準儲備液Ⅱ于陰性樣品中,按1.3節(jié)方法處理,在1.4.2節(jié)條件下進行HPLC分析。結果發(fā)現(xiàn),規(guī)格為3 mL/60 mg的MCX固相萃取柱所需的洗脫溶液體積更小,實驗靈敏度更高。因此,實驗選擇SPE柱的規(guī)格為3 mL/60 mg。

2.1.5SPE提取條件的優(yōu)化

甲醇和乙腈是化妝品常用的提取溶劑,在實驗操作中發(fā)現(xiàn),甲醇提取的溶液經離心后有渾濁現(xiàn)象,因此選乙腈作為樣品提取溶劑?？疾炝瞬煌w積比的乙腈與1%三氯乙酸水溶液對SPE回收率的影響。分別取200.0 μL混合標準儲備液Ⅰ與混合標準儲備液Ⅱ于陰性樣品中,采用不同體積比的乙腈與1%三氯乙酸水溶液提取,按1.3節(jié)方法處理后,在1.4.2節(jié)條件下進行HPLC分析。結果表明,乙腈與1%三氯乙酸水溶液體積比為4:1時(即80%乙腈水溶液(含0.2%三氯乙酸))作為提取溶劑時,各物質的回收率最好。

2.1.6SPE淋洗溶液的優(yōu)化

淋洗溶液的選擇對SPE前處理有著重要的影響,合適的淋洗溶液,既不會把吸附在SPE柱填料上面的目標產物洗掉,又能清洗掉一些干擾雜質。實驗主要考察了甲醇、含1%甲酸的甲醇、乙腈、含1%甲酸的乙腈對14種藥物回收率的影響。分別取200.0 μL混合標準儲備液Ⅰ與混合標準儲備液Ⅱ于陰性樣品中,按1.3節(jié)方法處理,分別用甲醇、含1%甲酸的甲醇、乙腈、含1%甲酸的乙腈淋洗,在1.4.2節(jié)條件下進行HPLC分析。結果表明,乙腈與1%甲酸乙腈作為淋洗溶液時,14種化合物的回收率較低。1%甲酸甲醇作為淋洗溶液時,沙星類物質的回收率較低。甲醇作為SPE淋洗溶液時,各物質的回收率均較好。因此,選擇甲醇為淋洗溶液。

2.1.7SPE洗脫溶液的優(yōu)化

洗脫劑的選擇和用量是前處理的關鍵,選擇最佳洗脫劑需要兼顧14種化合物的回收率以及洗脫劑的用量,實驗考察了含0.5%、1%、2%、3%、4%、5%氨水的甲醇對目標物的洗脫效果。分別取200.0 μL混合標準儲備液Ⅰ與混合標準儲備液Ⅱ于陰性樣品中,按1.3節(jié)方法處理,依次用不同含量的氨水甲醇洗脫,在1.4.2節(jié)條件下進行HPLC分析。結果表明,當洗脫劑中氨水含量為2%時,各化合物的回收率均達到79%以上,考慮到堿性太強可能會對目標物的IMS響應有抑制作用,因此選擇2%氨水甲醇作為洗脫溶劑。同時考察了2%氨水甲醇的洗脫體積,結果發(fā)現(xiàn)1.0 mL的2%氨水甲醇即可將各化合物完全洗脫。因此,洗脫溶液體積取1.0 mL。

2.2 方法學考察

2.2.1專屬性和遷移時間

溶劑空白測定如圖3所示,在各物質出峰的位置(均在11 min之后)無干擾峰出現(xiàn),表明方法專屬性良好。

圖3 溶劑空白的離子遷移譜圖Fig. 3 IMS spectrum of the blank solvent

為了消除溫度、氣壓等外界因素的影響,通常采用遷移時間和約化遷移率(K0)對各物質進行定性[13]。

其中L為遷移管的長度;td為遷移時間;U為遷移管電壓;P為環(huán)境氣壓;T為遷移管溫度。根據(jù)公式可以得出K0·td為定值,當儀器參數(shù)一定時,就可以用校正物質的K0來計算被測物質的K0。

在上述優(yōu)化條件下,儀器校正后,取各IMS標準溶液依次注入IMS儀,在1.4.1節(jié)條件下進行分析,各物質的遷移時間和K0見表2,各物質(10 mg/L)的IMS譜圖見圖4。

圖4 14種抗菌藥物的離子遷移譜圖Fig. 4 IMS spectra of the 14 antibacterial drugs 1. fluconazole; 2. norfloxacin; 3. ciprofloxacin; 4. pefloxacin; 5. bifonazole; 6. sarafloxacin hydrochloride; 7. miconazole nitrate; 8. clotrimazole; 9. enoxacin; 10. naftifine hydrochloride; 11. econazole nitrate; 12. ofloxacin; 13. difloxacin hydrochloride; 14. ketoconazole.

2.2.2IMS檢出限

將各物質單標準儲備溶液用80%乙腈水溶液(含0.2%三氯乙酸)稀釋至一定濃度,加入陰性樣品中,按1.3節(jié)方法處理,在1.4.1節(jié)條件下進行IMS分析,以S/N為3時的濃度為各物質的檢出限,結果見表2。

表2 ESI-IMS法測定14種抗菌藥物的遷移時間、約化遷移率及檢出限(n=6)

2.2.3遷移時間測定重復性的考察

將各物質的IMS標準溶液每個月內隨機選5天進行IMS分析,在1.4.1節(jié)條件下平行采集6次,觀察3個月內各物質遷移時間的穩(wěn)定性。14種化合物遷移時間的標準偏差均在0.05 ms以內,且遷移時間的RSD均在0.5%以內,表明遷移時間的重復性較好。

2.2.4SPE回收率考察

取已知陰性的乳劑化妝品樣品18份,每份約0.25 g,置于15 mL離心管中,分別加入100.0、150.0、200.0 μL混合標準儲備液Ⅰ(每個水平3份)與混合標準儲備液Ⅱ(每個水平3份)。按1.3節(jié)方法處理,在1.4.2節(jié)條件下進行HPLC分析,結果見表3。

2.3 實際樣品的檢測

對25批祛痘類化妝品進行測定,按1.3節(jié)方法處理后,進行IMS分析。結果有1批化妝品檢測到與硝酸益康唑遷移時間一致的遷移峰,其IMS譜圖見圖5a;而未經SPE處理的樣品的IMS譜圖見圖5b,在12.45 ms處存在與諾氟沙星、12.83 ms處存在與培氟沙星等物質相近的峰,易造成假陽性結果。對比SPE前后的IMS譜圖,可以看出經SPE處理后峰高可達到2 V以上,未經SPE處理的峰高僅為0.05 V左右,說明樣品得到了凈化和富集,降低了基質抑制效應,避免了假陰性結果。同時采用本文建立的HPLC法檢測上述祛痘類化妝品,與IMS檢測結果一致,陽性樣品的液相色譜圖見圖6,HPLC方法測定出硝酸益康唑的添加量為2.3 μg/g,與文獻報道化妝品中抗菌藥的非法添加量[21](氧氟沙星添加量高至36 517.1 μg/g,灰黃霉素添加量最低為1.0 μg/g, 無硝酸益康唑的非法添加量)相比,硝酸益康唑的添加量較低,如不經SPE處理,有可能造成假陰性結果,進一步說明SPE處理的必要性。

表3 液相色譜法測定14種抗菌藥物在陰性樣品中3個水平下的加標回收率和精密度(n=3)

圖5 經(a)MCX固相萃取和(b)直接提取的陽性樣品的離子遷移譜圖Fig. 5 IMS spectra of a positive sample after (a) MCX SPE and (b) direct extraction

圖6 陽性樣品的HPLC圖Fig. 6 HPLC chromatogram of a positive sample

3 結論

本實驗以14種抗菌藥物為例,選擇并優(yōu)化了SPE前處理方法,建立了祛痘類化妝品中非法添加化學藥物的快速篩查方法,在后續(xù)實際工作中,可進一步擴大非法添加譜庫種類。該方法相較于直接提取法,可以消除大部分表面活性劑、基質增稠劑等干擾雜質,大幅降低基質對IMS的抑制效應,顯著減少IMS儀器清洗和維護的頻次,并對提取液進行了濃縮,提高了靈敏度,進而有效降低了假陽性和假陰性的發(fā)生。雖然SPE前處理增加了分析時間,但平均增加分析時間有限,且可放在快檢車中進行現(xiàn)場操作。凈化后的樣品溶液可直接采用本文建立的HPLC方法驗證準確性,大大提升了工作效率。該方法快速、高效、靈敏度高,為化妝品中非法添加篩查檢測提供了一種有效的分析手段,同時也擴大了IMS的應用范圍,拓寬了快檢研究思路。