離子色譜-串聯質譜法檢測酒類產品中10種有機酸

穆瑛琦, 吳奕萱, 王 逍, 胡利明, 柯潤輝*

(1. 北京工業(yè)大學環(huán)境與生命學部, 北京 100124; 2. 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司, 北京 100015; 3. 中輕檢驗認證有限公司, 北京 100016)

有機酸是一類含有羧基的酸性化合物,存在廣泛,種類繁多,是重要的生理活性物質[1]。同時,有機酸還有助于增加食品的感官特性和健康特性,對食品的品質控制起到重要作用[2]。

有機酸是酒類口味的重要組成部分,賦予酒體特定的口感和味道,有機酸的缺乏或者過量都會導致酒的口感不協調[3]。不同的原料與釀造工藝使不同類型的酒中有機酸組成和含量有一定的差別,對酒的感官品質有很大影響,是酒類產品風味與營養(yǎng)的質量指標[4]。因此,有機酸的分析對酒類釀造過程的調控及成品的評定與質量監(jiān)控都有重要意義。但是,對于復雜基質中低含量的目標物進行有效分離和準確測定是酒中有機酸檢測時所面臨的重大挑戰(zhàn)[5]。

常用的有機酸檢測方法有液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法、氣相色譜法、毛細管電泳法、離子色譜法(IC)等[6-10]。液相色譜法中部分有機酸會出現共洗脫現象[11],分離效果較差;液相色譜法與液相色譜-串聯質譜法在測小分子有機酸時均需要用極性大、pH低的洗脫液,對色譜柱破壞較大,不宜批量檢測[12];氣相色譜法適用于相對分子質量較低揮發(fā)性有機酸的檢測,對于相對分子質量較高的有機酸則需要進行衍生化處理,操作煩冗,重復性較差,質量控制相對較難[13];毛細管電泳法檢測速度快、實驗成本低,適用于有機酸的快速分析,但相比于色譜法,其精密度和靈敏度較差[14]。相對來說,離子色譜法是分析有機酸的一種有效方法,具有操作簡便、分離良好、靈敏度高等優(yōu)點[15],但其局限性在于目標物的定性只能依靠保留時間,且易受其他共存離子的干擾[16,17]。三重四極桿質譜憑借抗干擾能力強、靈敏度高、選擇性好、適用范圍廣等優(yōu)勢,已成為痕量物質定性確證和定量分析的首選方法[18]。通過聯用,離子色譜-串聯質譜儀(IC-MS/MS)將離子色譜與三重四極桿質譜的優(yōu)點相結合,既提高了極性物質的分離能力,又提高了在復雜基質中對極性物質檢測的選擇性與靈敏度,與此同時還能夠提供物質的相對分子質量與結構信息。應用IC-MS/MS來分析酒中有機酸,不僅可以實現多種有機酸的同時測定,而且可以對其結構進行確證,提高檢測的靈敏度和準確性。目前,采用固相萃取法對酒中有機酸進行樣品前處理,并結合IC-MS/MS對有機酸進行分析的研究鮮有報道。

本研究通過設計新型的連接流路,解決了離子色譜與質譜相連接時所面臨的流速不兼容及緩沖鹽污染質譜的難題,搭建了離子色譜-三重四極桿質譜串聯的分析裝置,以酒類樣品中有機酸為切入點,探索離子色譜-串聯質譜技術在極性物質檢測中應用的有效性和實用性。同時,對樣品前處理技術、色譜分離條件、質譜檢測參數等做了探討研究,建立了一種高效、準確、綠色測定酒類樣品中有機酸的方法,極大地降低了基體干擾,提高了分析方法的信噪比和靈敏度,為酒類品質管理和質量評價提供了強有力的方法支持。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Dionex ICS3000型離子色譜儀(美國Dionex公司); ACQUITY TQD三重四極桿質譜儀(美國Waters公司); Dionex IonPacTMAS11-HC型陰離子分析柱(250 mm×4 mm)、Dionex IonPacTMAS11-HC型保護柱(50 mm×4 mm)、Dionex ADRS 600 (4 mm)陰離子抑制器(美國Thermo公司); Milli-Q純水儀(美國Millipore公司);渦旋混合器(德國IKA公司);氮吹儀(北京帥恩科技有限公司)。

草酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、奎尼酸、烏頭酸和乳酸(純度>98%,壇墨質檢科技股份有限公司); IC-RP固相萃取柱和石墨化炭黑固相萃取柱均購自博納艾杰爾科技公司;Poly-sery固相萃取柱(德國CNW公司); 0.22 μm水相濾膜(上海安譜科學儀器有限公司)。

樣品:清香型、濃香型、醬香型白酒,以及黃酒、干紅葡萄酒均購自市場。

1.2 標準溶液的配制

分別稱取10種有機酸標準品5 mg于5 mL容量瓶中,用超純水進行溶解并定容,配制成質量濃度為1 mg/mL的單標準儲備液,于-18 ℃下避光保存。用超純水稀釋并配制成為不同濃度的混合標準溶液,于4 ℃下冰箱冷藏保存。使用時用超純水逐級稀釋,配制成0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的系列混合標準溶液。

1.3 樣品前處理方法

白酒:取白酒樣品5 mL于15 mL離心管中,氮吹至1 mL后用4 mL超純水復溶至5 mL,吸取復溶液1 mL稀釋100倍,將復溶液及稀釋后的溶液通過0.22 μm濾膜,收集濾液上機分析。

黃酒及干紅葡萄酒樣品:取黃酒及干紅葡萄酒樣品各10 mL于15 mL離心管中,在8 000 r/min條件下離心10 min,將上清液移入新的離心管中待用。分別用10 mL甲醇、10 mL水活化石墨化炭黑固相萃取小柱,將黃酒及干紅葡萄酒樣品分別通過石墨化炭黑固相萃取小柱進行凈化,棄去前3 mL流出液,收集后段流出液。將黃酒流出液用去離子水稀釋50和200倍,將葡萄酒流出液用去離子水稀釋100和400倍,通過0.22 μm濾膜,收集濾液上機分析。

1.4 檢測條件

1.4.1色譜條件

色譜柱采用Dionex IonPacTMAS11-HC型陰離子分析柱(250 mm×4 mm), Dionex IonPacTMAS11-HC型保護柱(50 mm×4 mm),柱溫30 ℃,檢測池溫度35 ℃,流速1.0 mL/min。流動相為由淋洗液自動發(fā)生器在線產生的KOH溶液。梯度洗脫程序為:0～15.0 min, 0.8 mmol/L KOH; 15.0～25.0 min, 0.8～50.0 mmol/L KOH; 25.0～30.0 min, 50.0～70.0 mmol/L KOH; 30.0～35.0 min, 70.0 mmol/L KOH; 35.0～35.1 min, 70.0～0.8 mmol/L; 35.1～38.0 min, 0.8 mmol/L KOH。進樣量25 μL; Dionex ADRS 600 (4 mm)型陰離子抑制器,抑制電流175 mA。

1.4.2質譜條件

離子源:電噴霧電離(ESI)源;掃描方式:負離子模式掃描;多反應監(jiān)測(MRM)模式;毛細管電壓為3.10 kV;離子源溫度為120 ℃；錐孔氣流速為50 L/h;錐體電壓50 V;霧化氣體流量7.0 L/h;碰撞氣體流量0.15 mL/min;碰撞池出口電位5 V;脫溶劑氣溫度為400 ℃,流速為850 L/h;采用MRM模式采集各標準樣品的母離子及對應的響應較強的子離子,使用分析軟件(MassLynx, 4.1版)進行系統控制和數據處理,10種有機酸的保留時間、母離子、子離子及錐孔電壓(cone voltage)和碰撞能量(collision energy)等參數見表1。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

白酒屬于蒸餾酒,雜質較少。但實驗發(fā)現,若白酒稀釋后直接進樣,由于乙醇的存在會對乳酸的峰形造成干擾,使得乳酸的離子峰變寬,無法準確定量。本實驗利用氮吹儀將白酒樣品中的大量乙醇揮發(fā)去除[19],再用去離子水進行稀釋,進樣檢測。通過實驗驗證,10種有機酸回收率為88.3%～111.5%,回收率良好。

黃酒和干紅葡萄酒相比于白酒組分較為復雜，黃酒中焦糖色色素為主要干擾物質；干紅葡萄酒中色素、多酚類物質以及糖等都有可能對有機酸的檢測產生干擾[20]。

為了提高有機酸的回收率，本實驗首先對比了不同固相萃取柱對于干紅葡萄酒的凈化效果，選擇了Poly-sery去除食品中著色劑專用SPE柱、IC-RP固相萃取柱和石墨化炭黑固相萃取小柱進行測定。發(fā)現采用Poly-sery柱以及IC-RP柱時，10種有機酸的回收率均較低，部分有機酸回收率低于70%(見圖1)，凈化效果較差。石墨化炭黑柱對10種有機酸的回收率均良好，故選用石墨化炭黑固相萃取柱進行凈化。隨后，使用石墨化炭黑固相萃取柱對黃酒進行凈化，結果表明，10種有機酸回收率為89.5%～107.2%，回收率較好。為實驗方法統一，故選擇石墨化炭黑固相萃取柱對黃酒及干紅葡萄酒進行凈化。

表1 10種有機酸的保留時間及質譜參數

圖1 3種固相萃取柱對干紅葡萄酒中10種有機酸回收率的影響(n=6)Fig. 1 Effects of the three SPE columns on the recoveries of the 10 organic acids in dry red wine (n=6)

2.2 離子色譜條件的優(yōu)化

2.2.1色譜柱的選擇

有機酸類物質屬于極性物質,在反相C18色譜柱上保留較差,而Dionex IonPacTMAS11-HC型陰離子分析柱(250 mm×4 mm)和Dionex IonPacTMAS19型陰離子分析柱(250 mm×4 mm)都屬于高柱容量色譜柱,具有較強的親水性,對于有機酸這類極性物質具有良好的保留特性。AS11-HC色譜柱的固定相填料主要為高交聯度的乙基乙烯基苯-二乙烯基苯共聚物(EVB-DVB)聚合物,AS19色譜柱的固定相填料主要為超孔型EVB-DVB顆粒,它們本身帶有正電荷，對淋洗液中陰離子和樣品陰離子的靜電吸附作用不同。本文對比了AS11-HC和AS19色譜柱對于10種有機酸的分離情況,發(fā)現在使用AS11-HC色譜柱時,10種有機酸的分離效果更好,最終選擇Dionex IonPacTMAS11-HC型陰離子分析柱(250 mm×4 mm)進行分離。

2.2.2梯度洗脫程序的優(yōu)化

有機酸類化合物具有酸性和親水性,在較強的堿性溶液中以陰離子形式存在。離子色譜中的淋洗液發(fā)生器可以在線產生不同濃度的KOH溶液,消除人工配制淋洗液所帶來的誤差和可能的空氣污染,保障了淋洗液的高純度及穩(wěn)定性,增強了系統的重現性和靈敏度[21]。因此,本文選擇淋洗液發(fā)生器產生的KOH溶液作為淋洗液。

對于小分子有機酸,電荷數是影響其柱保留的主要因素。本實驗中分離的有機酸包括一元、二元和三元羧酸,在水或稀堿液中會解離成一價、二價和三價陰離子,不同價態(tài)離子與離子交換劑親和力不同,電荷越高,親和力越大。因此,為了改善分離效果,達到最短時間內得到最佳分離的目的,本文考察不同濃度的KOH淋洗液對標準樣品分析的影響,并進行梯度洗脫程序優(yōu)化實驗。奎尼酸和乳酸是一價無機陰離子,對離子交換劑的親和力較弱,出峰時間較早,所以前15 min需要用低濃度(小于5 mmol/L)的KOH進行洗脫。故本實驗前15 min選取了0.8、1.5、3.0 mmol/L的KOH對奎尼酸和乳酸的分離效果進行考察(見圖2), 15 min后的淋洗液梯度統一為40～60 mmol/L KOH梯度洗脫?？梢钥吹角?5 min隨著淋洗液濃度的增加,奎尼酸和乳酸的分離時間不斷提前,分離度不斷減小。結果表明,當初始淋洗液濃度為0.8 mmol/L KOH時兩種酸的分離效果最好。

圖2 采用不同初始濃度淋洗液時10種有機酸的總離子流圖Fig. 2 Total ion chromatograms of the 10 organic acids with different concentrations of initial elutions

草酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸和烏頭酸是二價無機陰離子,檸檬酸為三價無機陰離子,對離子交換劑的親和力較強,出峰時間較晚,所以20 min后需要用較高濃度的KOH進行洗脫。故考察15 min后不同梯度程序對8種酸的分離影響(見圖3)。結果表明,隨著淋洗液濃度的增加,8種有機酸的出峰時間均提前,分離效果相近。當選用圖3a的梯度程序時,10種有機酸的整體出峰時間為38 min,而選用圖3c的梯度程序時,整體出峰時間為32 min,為了實現快速分離檢測,故選擇圖3c的梯度程序進行洗脫分離。

圖3 采用不同淋洗液梯度時10種有機酸的總離子流圖Fig. 3 Total ion chromatograms of the 10 organic acids with different gradient elutions a. 0-15.0 min, 0.8 mmol/L KOH; 15.0-25.0 min, 0.8-30.0 mmol/L KOH; 25.0-30.0 min, 30.0-50.0 mmol/L KOH; 30.0-35.0 min, 50.0 mmol/L KOH; 35.0-35.1 min, 50.0-0.8 mmol/L KOH; 35.1-38.0 min, 0.8 mmol/L KOH. b. 0-15.0 min, 0.8 mmol/L KOH; 15.0-25.0 min, 0.8-40.0 mmol/L KOH; 25.0-30.0 min, 40.0-60.0 mmol/L KOH; 30.0-35.0 min, 60.0 mmol/L KOH; 35.0-35.1 min, 60.0-0.8 mmol/L KOH; 35.1-38.0 min, 0.8 mmol/L KOH. c. 0-15.0 min, 0.8 mmol/L KOH; 15.0-25.0 min, 0.8-50.0 mmol/L KOH; 25.0-30.0 min, 50.0-70.0 mmol/L KOH; 30.0-35.0 min, 70.0 mmol/L KOH; 35.0-35.1 min, 70.0-0.8 mmol/L KOH; 35.1-38.0 min, 0.8 mmol/L KOH.

2.2.3流速的選擇

在確定了分析柱和淋洗液的情況下,對流速進行了優(yōu)化。分別考察了流速0.8、1.0、1.2 mL/min對分離效果的影響。實驗結果表明,流速越高,分析時間越短,但分離度會受到一定影響。當流速為1.2 mL/min時,出峰時間較為靠前,但柱壓接近2.0×107Pa上限,長時間高壓檢測,對色譜柱及儀器的使用壽命有較大影響[22]。當流速為0.8 mL/min時,發(fā)現色譜峰峰形較寬。綜合測定時間、響應值、色譜柱使用壽命以及峰形,最終確定流速為1.0 mL/min。

2.3 離子色譜與質譜連接方式的優(yōu)化

離子色譜淋洗液中含有KOH,當其進入到ESI源時無法完全揮發(fā),進而堆積在電噴霧噴嘴處,對儀器部件產生腐蝕,對儀器的損傷較大。在測定時需要避免難揮發(fā)緩沖鹽進入質譜檢測器。離子色譜中的電解抑制器可以實現在線除鹽,消除淋洗液中的鹽或堿對ESI源的影響和對質譜部件的損害。通過選擇ADRS 600 (4 mm)型抑制器,調節(jié)抑制器的電流,使抑制器電解水產生H+,通過陽離子交換膜使K+與H+進行交換然后排至廢液。最終進入質譜的為經過抑制器抑制后的產物純水[23]。

本實驗選擇使用AS11-HC型號色譜柱進行分離待測物,最佳流速為1.0 mL/min,而質譜的最適流速為0.3～0.5 mL/min,若以1.0 mL/min的流速直接進入質譜檢測器會使溶劑揮發(fā)不完全,而未霧化的液滴還有可能進入質譜,污染質譜內部,使背景噪聲增大,影響檢測。所以本實驗在進入質譜檢測器前安裝了一個三通進行分流,使進入質譜的流速保持在0.5 mL/min,將分流出的一部分淋洗液回流至抑制器中進行再生。在保證被測物質良好分離的情況下,降低背景噪聲,同時以適于質譜檢測的流速進入質譜,得到良好的檢測結果。儀器連接方式見圖4。

圖4 儀器連接示意圖Fig. 4 Schematic diagram of the instrument connection

表2 10種有機酸的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量限

2.4 質譜條件的選擇與優(yōu)化

本實驗選擇三重四極桿質譜作為檢測器測定樣品的含量,其抗干擾能力強,靈敏度高,能準確進行定性和定量。采用注射泵以流動注射的方式分別在正離子和負離子模式下對1 mg/L的10種有機酸標準溶液進行全掃描,結果表明:有機酸標準樣品在負離子模式下響應值較好。錐孔電壓和碰撞能量是影響質譜測定結果的重要因素,錐孔電壓直接影響各組分的靈敏度,過高的錐孔電壓會導致分子離子在離子源內發(fā)生碰撞解離,從而影響母離子的豐度,進而影響檢出限和靈敏度。通過全掃描逐個進行前體離子掃描,根據離子信號強度選出目標前體離子,母離子為[M-H]-型,利用儀器手動優(yōu)化功能,分別對錐孔電壓和碰撞能量等進行優(yōu)化,同時考察霧化氣溫度,毛細管溫度等指標,確定測定的最佳質譜條件。10種有機酸的MRM色譜圖見圖5。

圖5 10種有機酸的MRM色譜圖Fig. 5 Chromatograms of the 10 organic acids in MRM mode

2.5 方法學評價

2.5.1線性范圍和檢出限

將10種有機酸的標準儲備液配制成不同濃度的混合標準工作液。按前文1.4.1和1.4.2節(jié)中所述的離子色譜和質譜條件進行測定。以10種有機酸的質量濃度為橫坐標,色譜峰面積為縱坐標,繪制標準工作曲線,見表2。可以發(fā)現,10種有機酸在各自的質量濃度范圍內線性關系良好,相關系數(r2)均大于0.99。以色譜峰信噪比S/N=3和S/N=10的濃度分別確定方法的檢出限(LOD)以及定量限(LOQ), 10種有機酸的檢出限在1.0～8.0 μg/L之間,定量限在3.5～26.5 μg/L之間。

2.5.2精密度和回收率

將低、中、高3個水平的適量混合標準溶液加入到3種酒類樣品中,進行加標回收測定,每個加標水平測定6次,回收率和精密度結果如表3所示。白酒、黃酒和干紅葡萄酒樣品中10種有機酸在低、中、高3個加標水平下均有較好的準確度和精密度。平均加標回收率為83.0%～112.1%,相對標準偏差≤ 9.1%,可用于3種酒樣品中10種有機酸含量的測定。

表3 10種有機酸在不同添加水平下的回收率和相對標準偏差(n=6)

2.6 實際樣品的檢測

采用所建立的方法對市場上購買的白酒(清香型、濃香型和醬香型)、黃酒、干紅葡萄酒進行測定(見表4),經過不同稀釋倍數換算后,得到3種酒類樣品中10種有機酸的測定值。結果表明，白酒中,醬香型白酒含有的有機酸種類較多,所以醬香型白酒相對于其他兩種香型白酒口感更為豐富[24], 3種香型的白酒中,乳酸含量均為最高,其中醬香型白酒中乳酸含量最高。黃酒與干紅葡萄酒中均含有8種有機酸,其中黃酒中乳酸及琥珀酸含量較高,干紅葡萄酒中乳酸、琥珀酸及酒石酸含量較高。

3 結論

本文搭建了離子色譜-三重四極桿質譜檢測平臺,并建立了一種固相萃取結合離子色譜-串聯質譜同時測定白酒、黃酒、干紅葡萄酒3種酒類樣品中10種有機酸的檢測方法。采用陰離子分析柱解決了常規(guī)方法中極性物質不易保留的難題;采用質譜對有機酸進行定性與定量,與常規(guī)方法相比,提高了抗干擾能力與靈敏度,同時避免了假陽性結果的出現。對實際樣品的檢測表明,該方法能夠滿足3種酒樣品中10種有機酸的分析要求,為不同酒品中有機酸的定性和定量分析提供了基礎數據與技術支持。