HPLC-CAD分析黃芪甲苷提取過程中黃芪皂苷類成分動態(tài)變化

劉蓬蓬，鞠成國，林桂梅，聶紫璇，任天航

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制工藝原理重點(diǎn)研究室，遼寧省中藥炮制專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116600

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌之功?，F(xiàn)代研究表明，黃芪主要含有皂苷類、黃酮類和多糖類成分，具有抗菌、抗炎、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗疲勞、抗骨質(zhì)疏松等藥理作用[1-4]。

《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）自1995年版起以黃芪甲苷作為評價黃芪藥材和飲片質(zhì)量的指標(biāo)性成分之一，且1995－2000年版《中國藥典》測定黃芪甲苷的方法均采用薄層掃描法[5-6]，2005年版《中國藥典》首次采用HPLC 測定黃芪甲苷含量[7]。1995－2015年版《中國藥典》黃芪甲苷的基本提取步驟未發(fā)生改變，僅對個別步驟的溶液使用量進(jìn)行了更改[5-9]。2015年版《中國藥典》黃芪甲苷提取操作過程為：“取本品中粉約4 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)铀?0 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀? mL使溶解，放冷，通過D101 型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑1.5 cm，柱高12 cm），以水50 mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得?！盵9]該提取工作較為繁瑣、耗時，2020年版《中國藥典》黃芪甲苷的提取過程雖有簡化，但依然保留了加入氨試液進(jìn)行提取的操作[10]。

本研究根據(jù)《中國藥典》方法，對黃芪甲苷提取過程的主要步驟進(jìn)行拆分，分析提取過程中黃芪皂苷類成分的變化情況，為制訂新的黃芪甲苷提取方法提供依據(jù)，并為黃芪藥材和飲片的質(zhì)量評價提供參考。

1 儀器與試藥

LC-20AB 高效液相色譜儀，日本島津公司；Corona 電霧式檢測器，美國ESA 公司；METTLER AE240型十萬分之一分析天平，瑞士METTLER公司；FA1004B型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；YP5102 型電子天平，上海光正醫(yī)療儀器有限公司；Milli-Q純水儀，美國Millipore公司。

黃芪購自遼寧省朝陽市朝陽縣黃芪GAP（中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范）種植基地，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)王冰教授鑒定為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.） Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao的干燥根。黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪甲苷（黃芪皂苷Ⅳ）對照品，成都曼斯特生物科技有限公司，批號分別為MUST-16012906、MUST-16031010、MUST-16022804，純度≥98%；正丁醇、氨水、乙醇、甲醇為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號分別為20190111、20190513、20191109、20190312；甲醇、乙腈為色譜純，美國Sigma公司，批號分別為193172、191839；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

取原藥材，除去雜質(zhì)，洗凈，潤透，切厚片，干燥，粉碎（過4號篩），備用。

2.2 對照品溶液制備

2.3 供試品溶液制備

2.3.1 索氏提?。ˋ法）

取樣品粉末4 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 索氏提取和正丁醇萃?。˙法）

取樣品粉末4 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)铀?0 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 索氏提取和正丁醇萃取并經(jīng)D101型大孔吸附樹脂柱洗脫（C法）

取樣品粉末4 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)铀?0 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，殘?jiān)铀? mL使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑1.5 cm，柱高12 cm），以水50 mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3.4 索氏提取和正丁醇萃取并經(jīng)氨試液洗滌（D法）

取樣品粉末4 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)铀?0 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3.5 按藥典全過程提?。‥法）

老區(qū)革命紀(jì)念館的發(fā)展一定要在發(fā)揮紅色資源的同時依據(jù)當(dāng)?shù)鼐唧w情況，定位清晰，統(tǒng)一思想。革命紀(jì)念館只有負(fù)重拼搏,與時俱進(jìn),紅色旅游才將成為革命紀(jì)念館更快發(fā)展的強(qiáng)勁推動力。

取樣品粉末4 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)铀?0 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀? mL使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑1.5 cm，柱高12 cm），以水50 mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.4 色譜條件

采用Ecosil C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動相A為純水、B為乙腈，梯度洗脫（0.01～20 min，32%～32%B；20～25 min，32%～40%B；25～35 min，40～45%B；35～45 min，45%B；45～46 min，45%～100%B；46～70 min，100%B；70～71 min，100%～32%B；71～78min，32～32%B）[11-13]，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量10 μL，氮?dú)鈮毫?5 psi，高頻濾波，量程200 pA。色譜圖見圖1。

圖1 黃芪甲苷拆分提取過程中皂苷成分HPLC圖

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪甲苷對照品溶液適量，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積。以對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果3種成分線性關(guān)系良好，見表1。

表1 3種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取各對照品溶液10 μL，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測得黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ和黃芪甲苷峰面積的RSD分別為0.9%、1.2%、1.1%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件，測得黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ和黃芪甲苷峰面積的RSD 分別為1.3%、1.7%、1.6%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品6份，按“2.3.1”項(xiàng)下A法制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件，測得黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ和黃芪甲苷峰面積的RSD 分別為1.5%、1.9%、1.8%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批已知含量的A法提取樣品4 g，平行6份，精密稱定，分別精密加入黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ和黃芪甲苷對照品溶液適量，按“2.3.1”項(xiàng)下A法制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件測定，計算加樣回收率。結(jié)果黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ和黃芪甲苷的平均回收率分別為100.5%、99.6%、101.3%，RSD分別為1.6%、2.0%、1.9%，表明該方法準(zhǔn)確率高。

2.10 含量測定

取黃芪樣品，按“2.3”項(xiàng)下各法制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件測定黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ和黃芪甲苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 黃芪甲苷拆分提取過程中黃芪皂苷類成分含量（mg/g，n=3）

可以看出，黃芪甲苷提取過程中，黃芪皂苷Ⅰ和黃芪皂苷Ⅱ在氨試液洗滌前含量較高、黃芪甲苷含量較低，而經(jīng)氨試液洗滌后，黃芪皂苷Ⅰ和黃芪皂苷Ⅱ的含量顯著降低、黃芪甲苷含量顯著升高。B法與A法比較，黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ和黃芪甲苷在經(jīng)水飽和正丁醇萃取后含量亦降低，表明水飽和正丁醇的萃取效率不高，引起的損耗較大。而C法與B法、E法與D法比較可見，黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ和黃芪甲苷的含量無明顯差異，表明經(jīng)D101型大孔吸附樹脂柱洗脫富集這一步驟可以省略。

2.11 單體轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

吸取氨試液適量，分別加入黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ和黃芪甲苷對照品溶液中，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件測定分析，色譜圖見圖2，黃芪皂苷類成分轉(zhuǎn)化途徑見圖3。

圖2 黃芪皂苷單體轉(zhuǎn)化HPLC圖

圖3 黃芪皂苷類成分轉(zhuǎn)化途徑

可見，黃芪皂苷Ⅱ在經(jīng)氨試液洗滌后會脫掉木糖基2位上的乙?；D(zhuǎn)化生成黃芪甲苷，而黃芪皂苷Ⅰ在經(jīng)氨試液洗滌后先脫掉木糖基3位上的乙?；牲S芪皂苷Ⅱ，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化生成黃芪甲苷。

3 討論

本研究結(jié)果表明，黃芪甲苷提取過程中在經(jīng)氨試液洗滌后黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ發(fā)生了量變與質(zhì)變，而黃芪甲苷發(fā)生了量變，故采用經(jīng)氨試液作用轉(zhuǎn)化而來的黃芪甲苷數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行黃芪質(zhì)量評定欠妥，無法客觀、真實(shí)反映黃芪中黃芪甲苷含量。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪中黃芪皂苷Ⅰ含量較高且穩(wěn)定，故建議將《中國藥典》黃芪項(xiàng)下的皂苷類成分評價指標(biāo)由黃芪甲苷修訂為黃芪皂苷Ⅰ較為合理。此外，本研究對拆分黃芪甲苷提取過程中的黃芪皂苷Ⅲ含量變化情況亦進(jìn)行了測定分析，而黃芪皂苷Ⅲ含量未發(fā)生明顯變化，表明氨試液不會引起黃芪皂苷Ⅲ變化。同樣，水飽和正丁醇對黃芪皂苷Ⅲ的萃取效率亦不高，引起損耗較大。

黃芪中的皂苷類成分無紫外吸收，一般采用蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）進(jìn)行檢測分析。ELSD是散射光的對數(shù)響應(yīng)值與組分的質(zhì)量的對數(shù)呈線性關(guān)系，但此對數(shù)關(guān)系變異性較大，且其靈敏度較低，最低檢測限在50～100 ng。本研究采用的電噴霧檢測器較ELSD具有更高的靈敏度，對無紫外吸收化合物的最低檢測限達(dá)到1 ng，更適用于含有較弱或無紫外吸收的皂苷類成分分析[14]。

《中國藥典》黃芪含量測定項(xiàng)下尚有另一指標(biāo)性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷，但中藥成分復(fù)雜，是以多成分多靶點(diǎn)綜合發(fā)揮藥效作用。黃芪中包括皂苷類成分如黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪甲苷等，以及毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素、2"-羥基-3",4"-二甲氧基-異黃烷-7-O-β-D-葡萄糖苷、7,2"-二羥基-3",4"-二甲氧基-異黃烷、9,10-二甲氧基-紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、3-羥基-9,10-二甲氧基-紫檀烷等黃酮類成分，故建議可選取上述多種成分同時作為指標(biāo)性成分，通過采用HPLC技術(shù)建立黃芪飲片多成分指紋圖譜和多成分含量的限定范圍，對黃芪飲片質(zhì)量進(jìn)行整體、客觀的評價，從而為臨床應(yīng)用、中藥制劑生產(chǎn)提供藥效穩(wěn)定、質(zhì)量可控的黃芪飲片。