羊布氏桿菌病快速檢測技術(shù)應(yīng)用比較

(江蘇省常熟市梅李動物防疫站，江蘇 常熟 215511)

0 引言

羊布氏桿菌屬于一種慢性傳染病，對生殖系統(tǒng)的危害性較高，以公羊產(chǎn)生睪丸炎與母羊出現(xiàn)流產(chǎn)等現(xiàn)象為主要特征。該病的臨床表現(xiàn)相對隱蔽，傳染性較高，檢測難度較大。傳統(tǒng)的診斷方法耗時較長、操作繁瑣，需要借助多種精密儀器才能得出判定結(jié)果，難以有效在基層中推廣。為了解決此類問題，本文將對幾種快速檢測技術(shù)的實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行深入討論，從而找出最適合在基層應(yīng)用的檢測方法。

1 實(shí)驗(yàn)過程

1.1 材料準(zhǔn)備

所需準(zhǔn)備的實(shí)驗(yàn)材料主要包括：被檢試樣，以江蘇省常熟市某地區(qū)隨機(jī)收集的160份綿羊血液作為分析對象；菌株與DNA，從畜牧公司采購M5株、從檢驗(yàn)檢疫局獲得大腸桿菌與沙門氏菌的DNA；引物，布氏桿菌與PCR的引物均需根據(jù)國標(biāo)T1088的相關(guān)規(guī)定完成，本文所采用的引物是由某科技公司合成而得；主要試劑，緩沖液、聚合酶、氯化鎂、脫氧核糖核苷三磷酸、分子標(biāo)記、核酸燃料、熒光目視檢測試劑盒與血液基因提取試劑盒；主要儀器，電泳儀、冰箱、離心機(jī)、濁度儀、PCR儀、微量振蕩器與移液器；羊血液基因組，需要根據(jù)提取試劑盒的操作規(guī)范來完成提取操作；M5株與DNA的提取，需要依照國標(biāo)T2714所規(guī)定的方法完成。

1.2 檢測方法

1.2.1 金屬浴LAMP擴(kuò)增

該方法使用的材料劑量為：反應(yīng)緩沖液12.5 μL、引物30 μL、聚合酶1.0 μL、去離子水6.0 μL、模板1.5 μL。而反應(yīng)條件為：金屬干浴鍋63℃ 50 min，90℃ 10 min。實(shí)驗(yàn)流程為：在反應(yīng)管內(nèi)的混合物調(diào)試均勻后放置在金屬浴鍋中完成LAMP的擴(kuò)增，待反應(yīng)結(jié)束后觀測管內(nèi)是否存有白色混濁物，之后將離心機(jī)設(shè)定為6 000 rpm 5 min，觀察是否存在白色沉淀。同時實(shí)驗(yàn)過程所采用的模板應(yīng)為M5株DNA、雙蒸水，二者分別對應(yīng)陽性對照與陰性對照，此外還要提前準(zhǔn)備好待測樣品DNA。

1.2.2 濁度儀LAMP擴(kuò)增

該方法所使用的材料劑量為：反應(yīng)緩沖液12.0 μL、引物2.5 μL、聚合酶1.0 μL、去離子水6.0 μL、模板1.5 μL。反應(yīng)條件為：濁度儀的設(shè)置應(yīng)為80℃ 10 min、63℃ 40 min。實(shí)驗(yàn)流程為：反應(yīng)管內(nèi)的混合物在調(diào)試均勻后放置在濁度儀中完成LAMP的擴(kuò)增。待反應(yīng)結(jié)束后，可觀測柱狀下層的顏色呈現(xiàn)狀況，其中紅色代表陽性，綠色則表示為陰性。而實(shí)驗(yàn)過程中采用的模板則分別為：大腸桿菌DNA、綠膿桿菌DNA、沙門氏菌DNA，三者作為陰性對照。M5株DNA則作為陽性對照。此外還要準(zhǔn)備雙蒸水以及待測樣品DNA。

1.2.3 熒光目視檢測試劑盒法

該方法所使用的材料劑量分別為：反應(yīng)緩沖液12.0 μL、引物3.5 μL、聚合酶1.0 μL、去離子水5.0 μL、模板1.5 μL、黃綠素染料1.0 μL。反應(yīng)條件為：金屬干浴鍋需設(shè)定為63℃ 50 min、90℃ 10 min。實(shí)驗(yàn)流程為：反應(yīng)管內(nèi)的混合物在調(diào)試均勻后放置在金屬干浴鍋中完成LAMP擴(kuò)增，待反應(yīng)結(jié)束后，可觀察反應(yīng)管呈現(xiàn)的具體顏色，并通過紫外線照射來判斷是否有熒光產(chǎn)生。在實(shí)驗(yàn)過程中所使用的模板為M5株DNA與雙蒸水，二者分別作為陽性對照與陰性對照，同時還要準(zhǔn)備好待測樣品DNA。

1.2.4 PCR擴(kuò)增

該方法所使用的材料劑量分別為：反應(yīng)緩沖液13.0 μL、引物1.0 μL、聚合酶0.5 μL、脫氧核糖核苷三磷酸2.0 μL、氯化鎂3.0 μL、去離子水13.0 μL、模板1.5 μL、黃綠素燃料1.0 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 15 s、95℃ 5 min、52℃ 30 s、70℃ 90 s，72℃ 5 min，完成40個循環(huán)。實(shí)驗(yàn)流程為：反應(yīng)管內(nèi)的混合物在調(diào)試均勻后放置在PCR儀上，待反應(yīng)結(jié)束后，提取5 μL的產(chǎn)物，進(jìn)行2.0%的瓊脂糖電泳后，放置在凝膠成像儀中完成觀察記錄。在實(shí)驗(yàn)過程中所使用的模板為M5株DNA與雙蒸水，二者分別作為陽性對照與陰性對照，同時還要準(zhǔn)備好待測樣品DNA。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 金屬浴LAMP擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)過63℃ 50 min、90℃ 10 min的LAMP擴(kuò)增后，在陽性對照管以及待測試樣管中可發(fā)現(xiàn)白色混濁物，在完成6 000 rpm 5 min的離心處理后會出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象，此類現(xiàn)象說明布氏桿菌在擴(kuò)增時會伴有大量的硫酸鎂生產(chǎn)，并在離心后沉淀效果愈發(fā)明顯。而陰性對照管則未發(fā)現(xiàn)明顯變化，證明布氏桿菌未出現(xiàn)擴(kuò)增。使用該檢測方法測試的160份羊血液中，共有12份檢測出布氏桿菌[1]。

2.2 濁度儀LAMP擴(kuò)增結(jié)果

在經(jīng)過63℃ 40 min、80℃ 10 min的濁度儀擴(kuò)增后，可在2號檢測通道觀察到藍(lán)色柱狀圖，并且底部呈現(xiàn)紅色，證明該通道為陽性反應(yīng)，有布氏桿菌擴(kuò)增生成。而其余的通道未產(chǎn)生藍(lán)色柱狀圖并且底部多為綠色，證明陰性對照管沒有完成布氏桿菌的擴(kuò)增。待測試樣管所對應(yīng)的3號通道有明顯的藍(lán)色柱狀圖產(chǎn)生，并且底部同樣呈現(xiàn)為紅色，證明該試管發(fā)生了布氏桿菌的擴(kuò)增。使用該檢測方法測試的160份羊血液中，共有12份檢測出布氏桿菌。

2.3 熒光目視檢測試劑盒法擴(kuò)增結(jié)果

在金屬干浴鍋經(jīng)過90℃ 10 min、63℃ 50 min的擴(kuò)增后，可在陽性反應(yīng)管中看到紅色轉(zhuǎn)換為綠色的顏色變化，證明該試管中出現(xiàn)布氏桿菌陽性擴(kuò)增，而陰性反應(yīng)管的顏色未出現(xiàn)明顯改變，始終為橙紅色，證明未出現(xiàn)布氏桿菌的擴(kuò)增。而待測樣品反應(yīng)管與陽性反應(yīng)管的顏色變化趨勢一致，都是由紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，證明出現(xiàn)了布氏桿菌的擴(kuò)增。之后利用紫外線照射進(jìn)行實(shí)際結(jié)果的觀測，可發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出的布氏桿菌反應(yīng)管在照射下產(chǎn)生熒光，而沒有擴(kuò)增出布氏桿菌的反應(yīng)管則沒有熒光產(chǎn)出。使用該檢測方法測試的160份羊血液中，共有12份檢測出布氏桿菌[2]。

2.4 PCR擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)電泳結(jié)果可知，M5株陽性DNA以及待測試樣在800 bp與180 bp存在條帶，證明有布氏桿菌擴(kuò)增而出，而陰性試樣與5號泳道的待測試樣只在800 bp存在條帶，證明未出現(xiàn)布氏桿菌擴(kuò)增狀況。該檢測結(jié)果與T1011的判定方法相符。該檢測方法同樣以160份羊血液作為實(shí)驗(yàn)對象，發(fā)現(xiàn)的布氏桿菌共計(jì)10份。

3 實(shí)驗(yàn)分析

布氏桿菌對各國畜牧業(yè)都產(chǎn)生了惡劣的影響，不僅使羊群的生殖器官、內(nèi)臟受到破壞，還造成了大量經(jīng)濟(jì)損失，同時也對畜牧人員的生命安全產(chǎn)生威脅。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)一步成熟與發(fā)展，PCR、LAMP等基因檢測方法的應(yīng)用越來越受到人們重視，新的基因檢測方法也在不斷開發(fā)、研究當(dāng)中。

以往的檢測流程過于繁瑣與復(fù)雜，并且對實(shí)驗(yàn)儀器的要求相對嚴(yán)格，這就導(dǎo)致傳統(tǒng)的檢測方法已無法滿足基層測試的相關(guān)需要。但LAMP技術(shù)卻能有效解決此類問題，由于其使用的引物是對DNA鏈上的區(qū)段進(jìn)行針對性設(shè)計(jì)的，相較于傳統(tǒng)的PCR探針只能對2個區(qū)段設(shè)計(jì)引物，更好地實(shí)現(xiàn)了特異性的優(yōu)化，在進(jìn)行反應(yīng)時所采用的置換型合成酶也能夠在60℃～65℃的環(huán)境下完成DNA擴(kuò)增，使檢測的時間被大幅縮短。同時LAMP技術(shù)對實(shí)驗(yàn)儀器的要求較低，具有良好的適用性與經(jīng)濟(jì)性，以上優(yōu)點(diǎn)足以證明LAMP反應(yīng)更適合用在基層檢測中。此外，在DNA合成過程中，需要從DNTPS中提取焦磷酸離子以及鎂離子，確保二者在反應(yīng)溶液中充分反應(yīng)，并生成白色沉淀焦磷酸鎂。本次實(shí)驗(yàn)即是采用此反應(yīng)原理使LAMP方法能夠在金屬浴中被良好應(yīng)用，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示陽性反應(yīng)管內(nèi)會產(chǎn)生白色渾濁，并且反應(yīng)現(xiàn)象十分明顯，達(dá)到肉眼可見的級別。這足以證明LAMP方法可以實(shí)現(xiàn)布氏桿菌的擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)原理與實(shí)際結(jié)果保持一致。同時該方法的操作流程簡易，對設(shè)備的要求較低，對人員的技術(shù)要求偏低。而且LAMP反應(yīng)從始至終都無需完成反應(yīng)管的開啟，這不僅可以防止氣溶膠的形成，避免DNA污染導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，還完全符合基層的快速檢測條件[3]。

為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較高的可信度與可靠性，本次實(shí)驗(yàn)也采用了LAMP濁度儀進(jìn)行布氏桿菌的檢測，該方法可以對生成的焦磷酸鎂沉淀的渾濁度進(jìn)行檢測，之后以數(shù)據(jù)圖的形式呈現(xiàn)基因是否產(chǎn)生擴(kuò)增現(xiàn)象。在反應(yīng)完成后，便可直接觀察通道的改變狀況，如果有藍(lán)色柱狀產(chǎn)生并且底部出現(xiàn)紅色則證明目的基因被有效擴(kuò)增出，代表陽性，反之則代表陰性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LAMP濁度儀的觀測效果良好，可以直接反映基因的具體擴(kuò)增量以及變化情況，但由于設(shè)備本身的造價(jià)較為高昂，因此在基層應(yīng)用中難以得到有效推廣。

LAMP反應(yīng)過程中出現(xiàn)的擴(kuò)增物在與黃綠素染料充分結(jié)合的情況下，能夠產(chǎn)生相應(yīng)的顏色變化，依照此原理，實(shí)驗(yàn)中可通過熒光目視檢測試劑盒進(jìn)行布氏桿菌的檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在加入檢測試劑后，反應(yīng)溶液會變?yōu)榫G色代表陽性，若反應(yīng)溶液無顏色變化則為陰性，而在紫外光照射下出現(xiàn)熒光為陽性，未產(chǎn)生熒光則為陰性。這種可視度較高的變化能夠使判定結(jié)果更加準(zhǔn)確、清晰，但有數(shù)據(jù)顯示該反應(yīng)的時間較長，通常要高于1 h，容易產(chǎn)生假陽性，并且試劑盒的成本較高，還需應(yīng)用紫外照射設(shè)備，因此同樣不適用于基層檢測。

綜上所述，本次實(shí)驗(yàn)所采取的3種LAMP快速檢測方法的檢出效果均好于以往的PCR檢測方法，而且3種方法的陽性檢出率一致，重復(fù)率相同。這其中金屬浴LAMP的應(yīng)用效果佳，并且該方法無論是在試劑方面還是在實(shí)驗(yàn)設(shè)備方面都不需要投入過高的成本費(fèi)用，同時也能保證極高的檢出率和良好的檢測效果，因此相比較于其他兩種LAMP快速檢測法更適合在基層中進(jìn)行應(yīng)用，能夠切實(shí)滿足相關(guān)使用條件，值得推廣。

4 結(jié)語

通過對羊布氏桿菌病快速檢測技術(shù)的材料準(zhǔn)備、實(shí)驗(yàn)流程、實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析討論可知，金屬浴LAMP方法無需昂貴的設(shè)備與試劑，具有檢測準(zhǔn)確度高，經(jīng)濟(jì)性好的優(yōu)勢。金屬浴LAMP檢測方法可以作為基層推廣的主要檢測方法。