環(huán)狀RNA在眼科疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制研究進(jìn)展△

李華健 李鵬飛 陳雨欣 王 勇

1976年，Sanger等[1]首次在病毒和類病毒中發(fā)現(xiàn)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RNA分子，并將其命名為環(huán)狀RNA(circRNA)。隨后，有學(xué)者在電子顯微鏡下觀察到真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中也存在circRNA[2]。由于傳統(tǒng)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法對(duì)circRNA數(shù)量的檢測(cè)能力非常有限，因此一直以來(lái)circRNA被認(rèn)為是RNA異常剪接的產(chǎn)物。直到近些年由于二代測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，circRNA的重要地位才逐漸被凸顯出來(lái)[3]。目前，人們通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，人類獨(dú)有的circRNA超過(guò)10萬(wàn)種，其中大部分circRNA不僅結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且呈現(xiàn)出時(shí)空表達(dá)特異性，說(shuō)明circRNA可能在調(diào)控基因表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4]。

circRNA根據(jù)基因來(lái)源位置的不同可分為外顯子組成的circRNA(ecircRNA)，外顯子和內(nèi)含子組成的circRNA (ElciRNA)，內(nèi)含子組成的circRNA(ciRNA)和基因間circRNA(intergenic circRNA)[5]。關(guān)于circRNA的形成，目前主流的假說(shuō)是“外顯子跳讀驅(qū)動(dòng)環(huán)化”和“內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化”?！巴怙@子跳讀驅(qū)動(dòng)環(huán)化”指外顯子跳讀形成包含外顯子和內(nèi)含子的套索結(jié)構(gòu)，套索結(jié)構(gòu)中內(nèi)含子被切除形成ecircRNA或不被切除直接形成ElciRNA；“內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化”指含有反向重復(fù)序列的內(nèi)含子配對(duì)使下游外顯子的3’端反向與上游外顯子5’端共價(jià)連接形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，最終形成ecircRNA或ElciRNA。另外，內(nèi)含子套索的脫分支失敗會(huì)導(dǎo)致ciRNA的產(chǎn)生[4,6]。許多circRNA含有單個(gè)或多個(gè)微小RNA(miRNA)結(jié)合位點(diǎn)，可以作為競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA，通過(guò)“海綿吸附”機(jī)制逆轉(zhuǎn)miRNA對(duì)其靶基因的降解作用，促進(jìn)靶基因的表達(dá)[7]。此外，circRNA可與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，影響相關(guān)蛋白作用模式，在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達(dá)[8]。近年來(lái)也有研究發(fā)現(xiàn)，部分circRNA具有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列，能夠進(jìn)入核糖體翻譯多肽及蛋白質(zhì)，從而發(fā)揮生物學(xué)功能[9]。

1 circRNA與角結(jié)膜病

1.1 角膜新生血管角膜新生血管是指角膜緣新生血管侵入角膜的現(xiàn)象，可導(dǎo)致患者視力下降和失明。角膜的免疫、創(chuàng)傷或感染性疾病都可促進(jìn)與角膜新生血管形成相關(guān)的血管生成因子的產(chǎn)生[10]。Zhou等[11]對(duì)堿燒傷誘導(dǎo)的角膜新生血管小鼠的角膜組織進(jìn)行circRNA微陣列芯片分析，共鑒定出229個(gè)差異表達(dá)的circRNA(174個(gè)上調(diào)，55個(gè)下調(diào))，其中cZFP609和cKifap3的異常表達(dá)最明顯。隨后人們?cè)?例化學(xué)燒傷及8例角膜炎患者的角膜樣本中也發(fā)現(xiàn)cZFP609表達(dá)明顯上調(diào)，而cKifap3表達(dá)明顯下調(diào)。深入研究顯示，下調(diào)cKifap3表達(dá)可使其競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-184的能力減弱，進(jìn)而抑制靶分子蛋白激酶B(Akt)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)，抑制角膜新生血管形成。Wu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠相比角膜縫合術(shù)后大鼠角膜上皮中cZNF609表達(dá)顯著升高。cZNF609通過(guò)吸附miR-184，提高Akt、VEGF和β-連環(huán)蛋白(β-catenin)等基因的表達(dá)，促進(jìn)角膜新生血管形成。對(duì)cZNF609的干預(yù)可能是角膜新生血管治療的潛在策略。

1.2 翼狀胬肉翼狀胬肉是一種常見(jiàn)的眼表疾病，以結(jié)膜下纖維組織增生和血管侵入角膜為特征[13]。異常細(xì)胞增殖、傷口愈合缺陷、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、異?；|(zhì)重構(gòu)、血管生成、氧化應(yīng)激和遺傳易感性都與翼狀胬肉的形成和發(fā)展有關(guān)[14]。Liu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，與正常結(jié)膜組織相比，翼狀胬肉中有21個(gè)circRNA存在差異表達(dá)(11個(gè)上調(diào)，10個(gè)下調(diào))。經(jīng)PCR驗(yàn)證，hsa_circ_0007482、hsa_circ_0023988和hsa_circ_0004846在翼狀胬肉組織中表達(dá)上調(diào)，hsa_circ_0000151和hsa_circ_0012935在翼狀胬肉組織中表達(dá)下調(diào)。GO(gene ontology)分析顯示，上調(diào)的circRNA主要與上皮管樣形成和凋亡有關(guān)，而下調(diào)的circRNA主要參與上皮細(xì)胞發(fā)育、血管生成和間充質(zhì)細(xì)胞增殖。KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析顯示，異常表達(dá)的circRNA富集于黏蛋白型O-聚糖生物合成途徑。circRNA的異常表達(dá)可能與翼狀胬肉的形成有關(guān)。

2 circRNA與青光眼

原發(fā)性開(kāi)角型青光眼是一種神經(jīng)退行性疾病，以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞丟失和視野缺損，同時(shí)伴隨病理性高眼壓為特征[15]。此外，Müller細(xì)胞作為視網(wǎng)膜中一種特殊的放射狀膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)元起到支持和滋養(yǎng)的作用，與原發(fā)性開(kāi)角型青光眼的發(fā)病有關(guān)。Wang等[16]對(duì)經(jīng)過(guò)微球注射誘導(dǎo)的大鼠慢性高眼壓模型研究發(fā)現(xiàn)，cZRANB1表達(dá)顯著增加。cZRANB1通過(guò)吸附miR-217提高RUNX2基因的表達(dá)，促進(jìn)視網(wǎng)膜反應(yīng)性膠質(zhì)增生和Müller細(xì)胞活化，加速視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變性，造成視網(wǎng)膜功能損害和視力下降。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，cZNF609在鞏膜上靜脈結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠慢性高眼壓模型中的表達(dá)顯著上調(diào)[17]，沉默cZNF609能夠抑制視網(wǎng)膜反應(yīng)性膠質(zhì)增生和Müller細(xì)胞活化，延長(zhǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活時(shí)間，進(jìn)而延緩原發(fā)性開(kāi)角型青光眼發(fā)病進(jìn)程。上述發(fā)現(xiàn)為視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性病變的發(fā)病機(jī)制研究提供了新的方向。但這些研究都只是在動(dòng)物模型中進(jìn)行，是否在青光眼患者視網(wǎng)膜中存在同樣的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)目前尚不明確。

3 circRNA與白內(nèi)障

白內(nèi)障是世界首位致盲性眼病，其中年齡相關(guān)性白內(nèi)障(ARC)是最為常見(jiàn)的白內(nèi)障類型。其發(fā)病機(jī)制尚不明確，晶狀體上皮細(xì)胞(LECs)的氧化損傷是白內(nèi)障發(fā)生的關(guān)鍵因素。持續(xù)的氧化刺激會(huì)引發(fā)自由基特別是含氧自由基異常增高，進(jìn)而導(dǎo)致LECs細(xì)胞核DNA的氧化損傷、氧化應(yīng)激，引發(fā)LECs損害和凋亡，這是ARC發(fā)病的分子病理基礎(chǔ)。Cui等[18]研究了25例ARC患者和20例透明晶狀體上皮組織發(fā)現(xiàn)，circHIPK3在ARC患者晶狀體中表達(dá)下調(diào)。過(guò)表達(dá)circHIPK3促進(jìn)了人LECs(SRA01/04)的增殖。circHIPK3通過(guò)充當(dāng)miR-221-3p的“分子海綿”，增強(qiáng)p-PI3K和p-AKT基因的表達(dá)，激活下游PI3K/Akt信號(hào)通路(磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路)保護(hù)人LECs免受氧化損傷和凋亡。Du等[19]在3例ARC患者和3例健康者外周血中共發(fā)現(xiàn)242個(gè)差異表達(dá)的circRNA(100個(gè)上調(diào)，142個(gè)下調(diào))，并預(yù)測(cè)了這些circRNA可能的miRNA結(jié)合位點(diǎn)。GO分析顯示，異常表達(dá)的circRNA與細(xì)胞代謝過(guò)程、發(fā)育及RNA轉(zhuǎn)錄有關(guān)。KEGG通路分析顯示，異常表達(dá)的circRNA富集于絲裂原活化蛋白激酶、腫瘤壞死因子以及PI3K/Akt信號(hào)通路。Liu等[20]在年齡相關(guān)性皮質(zhì)性白內(nèi)障(ARCC)患者LECs和紫外線照射的SRA01/04細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)circMRE11A表達(dá)上調(diào)，敲低circMRE11A可以提高LECs活力。共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因(ATM)活化參與DNA的氧化損傷應(yīng)答，然而ATM的過(guò)度活化(ATM-S1891p)，可引起下游p53、p21基因激活從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。circMRE11A與UBX結(jié)構(gòu)包含蛋白1(UBXN1)相互作用，誘導(dǎo)ATM過(guò)度激活，通過(guò)ATM/p53/p21途徑誘導(dǎo)LECs的細(xì)胞周期阻滯，參與ARCC的形成。Li等[21]對(duì)3例ARCC患者和3例對(duì)照受試者LECs中6-甲基腺嘌呤(m6A)修飾的circRNA進(jìn)行了全基因組分析。m6A是最為常見(jiàn)的一類RNA修飾，廣泛存在于酵母、植物、果蠅、以及哺乳動(dòng)物等各類真核生物中。該研究發(fā)現(xiàn)，ARCC患者LECs中有4233個(gè)circRNA表達(dá)上調(diào)和4561個(gè)circRNA表達(dá)下調(diào)。并且總共有2700個(gè)m6A峰在circRNA中顯著差異表達(dá)(1469個(gè)上調(diào)，1231個(gè)下調(diào))。ARCC患者LECs中circRNA的m6A修飾與circRNA的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。他們的研究為circRNA及其m6A修飾參與ARC發(fā)生發(fā)展提供了新的證據(jù)。

研究表明，與非糖尿病患者相比，糖尿病患者的白內(nèi)障發(fā)病年齡更早，進(jìn)展更快，發(fā)病率也更高。這可能與高血糖誘導(dǎo)的LECs增殖、凋亡和自噬有關(guān)[22]。Fan等[23]對(duì)6例糖尿病性白內(nèi)障患者前囊膜組織和3例透明前囊膜組織進(jìn)行circRNA表達(dá)譜分析，共發(fā)現(xiàn)1063個(gè)差異表達(dá)的circRNA，其中135個(gè)circRNA表達(dá)上調(diào)兩倍以上，928個(gè)circRNA表達(dá)下調(diào)兩倍以上。circKMT2E可以作為“分子海綿”吸附miR-204-5p，但是circKMT2E與miR-204-5p之間的結(jié)合位點(diǎn)只是生物信息學(xué)上的預(yù)測(cè)，并沒(méi)有經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

晶狀體后囊膜混濁(PCO)是白內(nèi)障術(shù)后常見(jiàn)的遠(yuǎn)期并發(fā)癥。有研究表明，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是PCO的主要發(fā)病機(jī)制，即上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，向后囊遷移，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白分泌過(guò)多，導(dǎo)致PCO形成。Liu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，circ-CARD6在PCO組織中高表達(dá)，敲低circ-CARD6抑制了LECs的增殖、轉(zhuǎn)移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子7可以促進(jìn)LECs增殖和新生血管生成，circ-CARD6通過(guò)吸附miR-31促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子7基因的表達(dá)，加速PCO形成。因此circ-CARD6有可能成為PCO的防治靶點(diǎn)。

4 circRNA與視網(wǎng)膜病變

4.1 糖尿病性視網(wǎng)膜病變糖尿病性視網(wǎng)膜病變是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥[25]。其特征是視網(wǎng)膜毛細(xì)血管滲漏、炎癥和新生血管生成，發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜。Shan等[26]研究發(fā)現(xiàn)，鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病性視網(wǎng)膜病變小鼠模型和高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中circHIPK3表達(dá)均顯著上調(diào)，沉默circHIPK3可降低人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力，使視網(wǎng)膜毛細(xì)血管滲漏和炎癥得到改善。Zhu等[27]研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞中circDNMT3B表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)circDNMT3B可降低無(wú)細(xì)胞型毛細(xì)血管的生成，減少高糖對(duì)視網(wǎng)膜血管功能的損傷。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β受體拮抗劑BAMBI可以抑制人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管樣形成。circDNMT3B通過(guò)吸附miR-20b-5p增強(qiáng)BAMBI基因表達(dá)，延緩糖尿病性視網(wǎng)膜病變進(jìn)展。但上述實(shí)驗(yàn)都是用高糖刺激人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞短時(shí)間形成的細(xì)胞模型，考慮到糖尿病性視網(wǎng)膜病變的進(jìn)展涉及長(zhǎng)期的高血糖和慢性炎癥，這類細(xì)胞模型可能不是糖尿病性視網(wǎng)膜病變機(jī)制研究的最佳選擇。

4.2 增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變?cè)錾圆Ａw視網(wǎng)膜病變是視網(wǎng)膜脫離手術(shù)失敗的主要原因，是由于增殖膜的收縮從而牽拉視網(wǎng)膜導(dǎo)致其脫離所致，可能與視網(wǎng)膜前膜的形成有關(guān)。Yao等[28]對(duì)30例增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變患者的視網(wǎng)膜前膜和30例白內(nèi)障患者的繼發(fā)性視網(wǎng)膜前膜進(jìn)行circRNA微陣列芯片分析，發(fā)現(xiàn)91個(gè)差異表達(dá)的circRNA(55個(gè)上調(diào)，36個(gè)下調(diào))。circ_0043144在增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變患者的玻璃體液和血清中均顯著上調(diào)。沉默circ_0043144顯著降低趨化因子CCL2、CXCL8和白細(xì)胞介素-8等基因的表達(dá)，抑制人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(ARPE-19)的增殖和遷移能力。但該研究并未對(duì)circ_0043144可能結(jié)合的miRNA或蛋白等中間調(diào)控介質(zhì)展開(kāi)深入研究。

4.3 早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變?cè)绠a(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變是一種視網(wǎng)膜血管增生性疾病。其病理過(guò)程包括兩個(gè)階段:第一階段為早產(chǎn)后高氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管不完全生長(zhǎng)，即血管閉塞期；第二階段為缺氧驅(qū)動(dòng)的病理性血管增生，即新生血管期。Liu等[29]在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，cZNF609的表達(dá)在血管閉塞期顯著下調(diào)，而在新生血管期上調(diào)。沉默cZNF609可減少病理性視網(wǎng)膜血管生成，減輕視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)。肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A活化與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能密切相關(guān)。cZNF609通過(guò)充當(dāng)miR-615-5p的“分子海綿”，增強(qiáng)肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A表達(dá)，促進(jìn)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、管樣形成和凋亡。早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展可能與cZNF609有關(guān)。

5 circRNA與年齡相關(guān)性黃斑變性

年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)可分為干性和濕性兩種亞型。干性AMD以視網(wǎng)膜色素上皮、脈絡(luò)膜毛細(xì)血管和光感受器萎縮為特征。藍(lán)光、吸煙、氧化應(yīng)激、脂褐素積聚和慢性炎癥等均與干性AMD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Chen等[30]對(duì)9例AMD患者和6例健康對(duì)照者的血清進(jìn)行circRNA微陣列芯片分析發(fā)現(xiàn)，AMD患者血清中circNR3C1表達(dá)下調(diào)。敲低circNR3C1導(dǎo)致ARPE-19細(xì)胞的吞噬能力被抑制。研究發(fā)現(xiàn)，磷酸酯酶和張力蛋白同系物PTEN的失活與視網(wǎng)膜變性有關(guān)[31]。circNR3C1通過(guò)吸附miR-382-5p，增加磷酸酯酶和PTEN基因的表達(dá)，抑制Akt/mTOR信號(hào)通路(蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路)，緩解干性AMD進(jìn)展。

濕性AMD的特征是脈絡(luò)膜新生血管的形成，表現(xiàn)為視網(wǎng)膜下水腫、滲出和出血，可致視力減退和視物變形[32]。Liu等[33]利用circRNA微陣列芯片分析了3只脈絡(luò)膜新生血管小鼠和3只對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜色素上皮中circRNA的表達(dá)譜，共鑒定出100個(gè)異常表達(dá)的circRNA(59個(gè)上調(diào)，41個(gè)下調(diào))。其中mmu_circRNA_20332和mmu_circRNA_19555上調(diào)和下調(diào)幅度最大。GO分析顯示異常表達(dá)的circRNA可能與免疫應(yīng)答和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞有關(guān)。上述研究表明，circRNA可能通過(guò)各種分子生物途徑參與AMD的發(fā)生發(fā)展，但尚未發(fā)現(xiàn)確切的調(diào)控機(jī)制。

6 circRNA與眼部腫瘤

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(RB)是嬰幼兒最常見(jiàn)的眼內(nèi)惡性腫瘤，主要是由于視網(wǎng)膜發(fā)育過(guò)程中RB1基因的雙等位基因缺失所引發(fā)，發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜[34]。Zhang等[35]研究了45例RB及其鄰近組織，發(fā)現(xiàn)circ_0000527在RB組織中高表達(dá)。circ_0000527通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA機(jī)制吸附miR-646，提高低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6基因表達(dá)，加速RB細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。circ_0000527可能與RB的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

葡萄膜黑色素瘤(UM)是成人最常見(jiàn)的原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤。易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，目前尚無(wú)有效的治療方法，死亡率高。Yang等[36]利用circRNA微陣列芯片對(duì)5例UM和5例正常葡萄膜組織進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，UM中有50 579個(gè)異常表達(dá)的circRNA(20 654 個(gè)上調(diào)，29 925個(gè)下調(diào))。GO分析顯示，異常表達(dá)的circRNA主要與腺嘌呤核苷酸結(jié)合有關(guān)。KEGG通路分析則顯示circRNA富集于PI3K/Akt信號(hào)通路以及Wnt信號(hào)通路。這項(xiàng)研究首次探索了UM中circRNA的異常表達(dá)，為UM的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。

7 總結(jié)和展望

近年來(lái)，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些circRNA在眼科疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。但目前對(duì)circRNA的研究主要集中在其病理生理過(guò)程中的表達(dá)變化，大多局限于離體細(xì)胞水平，需配合有效、可靠的動(dòng)物模型作深入研究。如何將circRNA具體到臨床實(shí)踐應(yīng)用，切實(shí)提高診斷準(zhǔn)確性、治療有效性還需長(zhǎng)時(shí)間探索。對(duì)于circRNA生物學(xué)功能以及對(duì)下游靶基因的調(diào)控機(jī)制的探索在未來(lái)很長(zhǎng)一段時(shí)間都會(huì)是眼科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。相信隨著高通量測(cè)序技術(shù)和分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，人們會(huì)發(fā)現(xiàn)更多與眼病相關(guān)的circRNA，為各類眼病的診療提供新的依據(jù)和方向。