循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)方法

宋宇航 楊小林 劉 康 宋桂芹

1.南充市中心醫(yī)院 川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院組織工程與干細(xì)胞研究所，四川南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物教研室，四川南充 637000

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）是從腫瘤部位脫落的腫瘤細(xì)胞，在腫瘤發(fā)育過程中侵入外周血。其被認(rèn)為攜帶著腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的重要信息，與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]。CTCs 檢測(cè)作為新興的液體活檢技術(shù)，具有取樣方便、侵入性小、信息全面、無放射性污染、成本低等優(yōu)勢(shì)，是目前最具發(fā)展?jié)摿Φ哪[瘤無創(chuàng)診斷和實(shí)時(shí)療效監(jiān)測(cè)手段之一，已成為當(dāng)前癌癥診斷領(lǐng)域的前沿?zé)狳c(diǎn)[2]。由于外周血中CTCs的數(shù)量稀少，以及隨著腫瘤轉(zhuǎn)移CTCs 亞型不斷變化，所以對(duì)CTCs 捕獲及鑒定技術(shù)的研究是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。舊技術(shù)的不斷革新及新技術(shù)的不斷挖掘，使得CTCs 的富集率進(jìn)一步提高。本文簡(jiǎn)述了CTCs 的體內(nèi)外檢測(cè)方法，并分析了當(dāng)前CTCs 檢測(cè)面臨的挑戰(zhàn)及策略。

1 CTCs 的體外檢測(cè)方法

CTCs 的富集方法是基于物理或生物特性的。前者取決于腫瘤細(xì)胞的尺寸、電性能等其他物理特性，而后者主要依賴于抗原抗體結(jié)合[3]。近年來，聯(lián)合物理和生物特性檢測(cè)的新型微流控芯片技術(shù)具有自動(dòng)化、微型化、高通量、可集成下游分析等優(yōu)點(diǎn)，在CTCs 檢測(cè)分析中顯示了巨大優(yōu)勢(shì)[2]。

1.1 基于物理特性的富集方法

研究表明，CTCs 比造血細(xì)胞更大、更硬[4]。基于這些物理特性的差異，已經(jīng)開發(fā)了許多技術(shù)來提高CTCs 富集率[5]，其中膜過濾分離腫瘤細(xì)胞技術(shù)（isolation by size of epithelial tumor cells，ISET）系統(tǒng)是最早基于尺寸過濾的CTCs 分離的技術(shù)之一。在該系統(tǒng)中，血液被稀釋，然后用8 μm 孔徑過濾器過濾。CTCs 由于體積較大而被過濾器保留，紅細(xì)胞和白細(xì)胞由于體積小于孔徑而可以通過隨機(jī)分布的孔。但由于CTCs和白細(xì)胞的大小重疊，依賴大小的過濾系統(tǒng)捕獲目標(biāo)細(xì)胞的效率有限[4]。因此，Sun 等[6]提出了一種增加細(xì)胞大小的策略，即在細(xì)胞過濾前利用修飾過的微珠來特異性結(jié)合CTCs，以提高捕獲效率。使用該微流體捕捉系統(tǒng)以1 ml/min 的流速可以從全血樣本中分離出高達(dá)91%的靶細(xì)胞[6]。

與ISET 系統(tǒng)類似，Screen Cell 系統(tǒng)通過使用微孔膜過濾器，通過篩孔大小分離CTCs[7]。該系統(tǒng)基于微過濾技術(shù)的過濾膜，可以使有核細(xì)胞通過，而CTCs被攔截。Screen Cell 系統(tǒng)具有高通量持續(xù)處理大量血液的潛力，并且具有相關(guān)的細(xì)胞和分子生物學(xué)技術(shù)，以及與CTCs 及其潛在基因異常的圖形和鑒定相關(guān)的技術(shù)，可以方便地分析提取到過濾器上的腫瘤細(xì)胞[3]。此外，從血液中分離出來的細(xì)胞能最大程度地保存其活性和完整性，為CTCs 的體外培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。

流體輔助分離技術(shù)（fluid-assisted separation technique，F(xiàn)AST）是一種新型的離心微流控系統(tǒng)[8]。在這種方法中，基于尺寸的分離發(fā)生在離心微流控裝置中的液-液界面上，而不是傳統(tǒng)的液-氣界面上。FAST 能夠直接從全血中分離出高靈敏度、選擇性、快速和無標(biāo)記的CTCs，并且無需事先進(jìn)行樣本操作。

與血液中的白細(xì)胞比較，CTCs 具有更多的負(fù)電荷、更低的細(xì)胞質(zhì)電導(dǎo)率及更高的單位膜電容[9]。介電泳場(chǎng)流分離技術(shù)采用的膜電容是基于細(xì)胞的大小和極化率，可以在30 min 內(nèi)處理3000 萬個(gè)細(xì)胞，回收率高[10]。但是其需要提前獲知細(xì)胞的特定參數(shù)，如細(xì)胞類型和電場(chǎng)頻率等。

1.2 基于生物特性的富集方法

Cell Search?系統(tǒng)是一種基于上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecules，EpCAM）免疫檢測(cè)的CTCs 富集方法，是目前食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的第一種也是唯一一種用于結(jié)直腸、乳腺、前列腺等腫瘤的CTCs 檢測(cè)方法[11]。Cell Search?系統(tǒng)的原理是由于EpCAM 在多種腫瘤細(xì)胞高表達(dá)，用磁珠標(biāo)記的抗體特異性地結(jié)合這些抗原，隨后通過施加磁場(chǎng)富集細(xì)胞[10]。然而Cell Search?系統(tǒng)無法檢測(cè)出失去EpCAM 表達(dá)的細(xì)胞，而這些細(xì)胞通常在上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）期間產(chǎn)生[12]。EMT 對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程至關(guān)重要，這意味著使用該系統(tǒng)檢測(cè)會(huì)漏檢許多參與腫瘤轉(zhuǎn)移的重要CTCs。由于Cell Search?系統(tǒng)僅適用于少數(shù)類型的癌癥，且檢測(cè)靈敏度不高，無法分離活的CTCs，因而較大程度地限制了其在臨床檢測(cè)中的有效應(yīng)用[13]。

與Cell Search?系統(tǒng)類似，磁細(xì)胞分離（magnetic cell separation，MACS）利用涂有EpCAM 抗體的磁珠吸附表達(dá)EpCAM 的細(xì)胞。通過聯(lián)合細(xì)胞角蛋白等標(biāo)記可以提高CTCs 的檢出率。同樣地，MACS 無法檢測(cè)到所有的CTCs，特別是那些缺乏上皮標(biāo)志物的、具有高度惡性潛能的CTCs[14]。此外，使用MACS 富集與事先透化EpCAM 染色并不排除檢出癌癥相關(guān)巨噬細(xì)胞的可能性[14]。

1.3 微流控芯片技術(shù)

利用CTCs 的尺寸大于血細(xì)胞的物理特性及細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)差異，Ahmed 等[15]設(shè)計(jì)了DLD 式微柱陣列，并在微柱表面修飾抗EpCAM 抗體，進(jìn)而構(gòu)建了CTCs 高效率、高純度富集的微流控芯片。根據(jù)DLD 原理，大尺寸的CTCs 會(huì)在微通道內(nèi)不斷與微柱碰撞并發(fā)生側(cè)向位移，而小尺寸的血細(xì)胞則沿著層流水平前進(jìn)不與柱子碰撞，選擇性增強(qiáng)了CTCs 與微柱的碰撞概率。實(shí)驗(yàn)證明，在全血環(huán)境下，CTCs 的富集效率為（92.2±6.4）%，純度高達(dá)（82.3±3.8）%[15]。

1.4 富集細(xì)胞鑒定

以上方法富集得到的CTCs 還需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)鑒定，富集方式即使不同檢測(cè)方法也可以相同[16]。目前CTCs 的鑒定方法有很多，其中最常用的是免疫熒光染色、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-PCR，RT-PCR）。

1.4.1 免疫熒光染色 固定富集的細(xì)胞后，用角蛋白熒光抗體（cytokeratin，CK）、抗CD45 和DAPI 等熒光染料標(biāo)記對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，其中DAPI+/CK+/CD45-的細(xì)胞被鑒定為CTCs[17]。其優(yōu)點(diǎn)是在熒光顯微鏡下可觀測(cè)細(xì)胞蛋白表型及形態(tài)。缺點(diǎn)是蛋白標(biāo)志物的表達(dá)缺乏穩(wěn)定性，不能區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞[16]。

1.4.2 RT-PCR RT-PCR 可通過檢測(cè)外周血中特定的逆轉(zhuǎn)錄DNA 片段來間接證實(shí)CTCs 的存在[18]。RTPCR 具有靈敏度高、可重復(fù)性好、無創(chuàng)等諸多優(yōu)勢(shì)[19]。但由于RT-PCR 只是從基因?qū)用嫔翔b別CTCs，所以無活力的CTCs 在此方法中同時(shí)被鑒定出來。由于在細(xì)胞變形性分析和藥物反應(yīng)測(cè)定方面需要取活細(xì)胞，使其應(yīng)用受限。

2 CTCs 的體內(nèi)檢測(cè)方法

在臨床檢查中，前述幾種檢測(cè)血液樣本中CTCs的體外方法是基于一個(gè)基本假設(shè)，即外周血中CTCs計(jì)數(shù)不會(huì)隨時(shí)間發(fā)生顯著變化，但最近的研究對(duì)這一假設(shè)提出了挑戰(zhàn)[20]。即CTCs 在循環(huán)中的分布可能不是均勻的，在給定時(shí)間點(diǎn)未檢測(cè)到CTCs 的患者可能不是無CTCs[21]。但是，反復(fù)抽取患者血液以明確CTCs的時(shí)間分布是不現(xiàn)實(shí)的。因此，研究該問題的一個(gè)可行策略是通過體內(nèi)檢測(cè)方法監(jiān)測(cè)CTCs。體內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)（in vivo flow cytometry，IVFC）能夠以無創(chuàng)和連續(xù)的方式直接檢測(cè)活動(dòng)物模型中的移動(dòng)細(xì)胞。根據(jù)原理不同，IVFC 可分為熒光IVFC 和光聲流式細(xì)胞術(shù)（photoacoustic flow cytometry，PAFC）。

2.1 熒光IVFC

在使用熒光IVFC 檢測(cè)CTCs 之前，需要對(duì)感興趣的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。熒光IVFC 的基本原理與傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)相似，只是使用生物體內(nèi)的天然血管代替常規(guī)流式細(xì)胞儀中的流動(dòng)室[22]。當(dāng)熒光標(biāo)記的細(xì)胞通過聚焦在血管上的激光束的狹縫時(shí)，可以激發(fā)其發(fā)射熒光。熒光IVFC 可以在幾分鐘到幾小時(shí)內(nèi)連續(xù)測(cè)量最近標(biāo)記的CTCs，并提供時(shí)間信息[23]。與體外檢測(cè)CTCs 方法比較，熒光IVFC 不僅避免了抽血，還避免了體外檢測(cè)方法中涉及的其他過程，如細(xì)胞裂解、離心和富集。這些體外過程會(huì)干擾CTCs 的生物環(huán)境，顯著影響CTCs 檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

2.2 PAFC

PAFC 利用CTCs 與血液背景的光吸收差異可以實(shí)現(xiàn)CTCs 在體檢測(cè)[24]。其原理是使用高頻脈沖激光照射血管，通過放置在組織表面的超聲波探測(cè)器檢測(cè)流經(jīng)血管的靶細(xì)胞產(chǎn)生的瞬時(shí)超聲波信號(hào)。當(dāng)組織受到輻射時(shí)，目標(biāo)細(xì)胞吸收光能，然后將光能轉(zhuǎn)化為熱能。這導(dǎo)致局部溫度升高，引發(fā)組織的熱彈性變化，產(chǎn)生超聲波（即光聲信號(hào)）。由于PAFC 是基于光吸收的對(duì)比，因此其只適用于特定吸收類型的細(xì)胞，如黑色素瘤細(xì)胞[22]。PAFC 不僅能實(shí)時(shí)檢測(cè)體內(nèi)黑色素瘤CTCs，還能消滅黑色素瘤細(xì)胞，具有顯著的治療效果[3]。

3 CTCs 檢測(cè)面臨的挑戰(zhàn)及策略

3.1 CTCs 的稀缺性

研究表明[25]，腫瘤患者外周血中每毫升血液只有0～10 個(gè)CTCs，這對(duì)CTCs 富集設(shè)備的要求極為苛刻。越來越多的新方法使CTCs 的富集效率大大提高，新的標(biāo)志物組合有效降低了假陽性率、假陰性率，但仍難以覆蓋隨疾病進(jìn)展不斷發(fā)生縱向變化的所有CTCs[26]?；谖锢硖匦缘母患椒ň哂忻鈽?biāo)記、高通量、不依賴細(xì)胞表面抗原表達(dá)水平等優(yōu)勢(shì)，但特異性差、富集效率和純度低?；谏锾匦缘母患椒`敏度高、特異性好，但成本高、耗時(shí)長(zhǎng)。聯(lián)合多種原理的富集方法各取所長(zhǎng)、互補(bǔ)所短，能進(jìn)一步提高富集效率。IVFC 雖然能在體內(nèi)實(shí)時(shí)檢測(cè)CTCs，但目前還停留在動(dòng)物模型階段，真正實(shí)現(xiàn)床旁監(jiān)測(cè)還有很長(zhǎng)的距離。發(fā)展具有更高靈敏度和特異性的CTCs 檢測(cè)技術(shù)仍然是未來發(fā)展趨勢(shì)。

3.2 CTCs 的異質(zhì)性

腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性是指同類腫瘤的瘤間，以及同一腫瘤組織的瘤內(nèi)，存在形態(tài)、功能差異的癌細(xì)胞亞群[27]。對(duì)CTCs 而言，其異質(zhì)性主要體現(xiàn)在細(xì)胞表面特征標(biāo)志物種類及數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化，這將對(duì)設(shè)備的CTCs 捕獲效率產(chǎn)生較大影響[28]。研究表明[29]，EMT 在CTCs 的生物學(xué)中起著至關(guān)重要的作用，并有助于CTCs的異質(zhì)性。此外，EMT 不僅促進(jìn)了CTCs 的擴(kuò)散，而且在促進(jìn)其從非干細(xì)胞進(jìn)入干細(xì)胞狀態(tài)方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用[30]。對(duì)此，聯(lián)合多種EMT 和干細(xì)胞標(biāo)記鑒定CTCs 亞型不失為一種有效手段。對(duì)CTCs 亞型的深入認(rèn)識(shí)是未來指導(dǎo)個(gè)體化、精準(zhǔn)化醫(yī)療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

4 現(xiàn)狀及展望

作為一種新興的診斷和治療方法，CTCs 提供了在影像學(xué)方法使用前發(fā)現(xiàn)癌癥的可能性，并結(jié)合其他腫瘤標(biāo)志物指導(dǎo)治療，監(jiān)測(cè)患者術(shù)后治療情況，預(yù)測(cè)患者預(yù)后。目前阻礙深入認(rèn)識(shí)CTCs 的兩個(gè)重要障礙仍然是其稀缺性與異質(zhì)性。因此，發(fā)展具有更高靈敏度和特異性的檢測(cè)技術(shù)是實(shí)現(xiàn)CTCs 精準(zhǔn)捕獲的第一步。對(duì)CTCs 亞型的深入認(rèn)識(shí)則是未來指導(dǎo)個(gè)體化、精準(zhǔn)化醫(yī)療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。盡管已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但在以CTCs 為基礎(chǔ)的液體活檢廣泛應(yīng)用于臨床應(yīng)用的常規(guī)檢測(cè)之前，還有很長(zhǎng)的路要走。