身痛逐瘀湯疏通淋巴管瘀滯促進骨修復的實驗研究

鄭揚康 王鵬禹 趙力 徐浩 孫悅禮 趙永見 梁倩倩* 王擁軍*

1．上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院，上海 200032 >2．上海中醫(yī)藥大學脊柱病研究所，上海 200032 3. 筋骨理論與治法教育部重點實驗室，上海 200032 4．上海中醫(yī)藥大學，上海 201203

淋巴管系統(tǒng)具有免疫監(jiān)控和維持體液平衡的重要生理功能[1]。在皮膚、筋膜、肌肉組織和骨膜等器官含有較豐富的淋巴管，可將組織間液和代謝廢物回流至淋巴循環(huán)[2-4]。Szczesny等[5]發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷性骨折早期會出現(xiàn)淋巴管“瘀滯”，淋巴管回流功能若未及時恢復會繼發(fā)創(chuàng)傷后淋巴水腫[6-7]。Arslan等[8]將大鼠后肢回流淋巴管和淋巴結(jié)摘除，成功建立慢性淋巴水腫模型后再造成脛骨骨折，發(fā)現(xiàn)慢性淋巴水腫會延遲骨折愈合。因此，及時恢復創(chuàng)傷后淋巴管回流，可能是促進骨折愈合的潛在靶點。

中醫(yī)學認為骨折早期以“活血化瘀、消腫止痛”為治療原則[9]，身痛逐瘀湯是清代名醫(yī)王清任的五逐瘀湯之一，臨床常用于骨折伴有明顯疼痛患者[10-13]。身痛逐瘀湯能否通過改善淋巴管回流功能以促進骨修復的機制尚需深入研究。因此，本研究擬通過建立脛骨骨折復合髓內(nèi)固定小鼠模型，采用身痛逐瘀湯灌胃，從疏通淋巴管瘀滯角度探究身痛逐瘀湯促進骨修復的藥效。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物：6～8周齡SPF級雄性C57BL /6小鼠共40只，購于上海杰思捷實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK(滬) 2018-0004，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心。飼養(yǎng)室的溫度和濕度各控制在23 ℃和60 %，保證充足的日照、鼠糧和飲用水。本研究通過上海中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審核批準，倫理批號為PZSHUTCM211101023。

1.1.2藥物與試劑：身痛逐瘀湯由秦艽3 g、川芎6 g、桃仁9 g、紅花9 g、甘草6 g、羌活3 g、沒藥6 g、當歸9 g、五靈脂6 g、香附3 g、牛膝9 g、地龍6 g組成[11]，上述中藥材均購自上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院中藥房。按照小鼠與人體表面積等效劑量比值為9.1計算小鼠(20 g)與人(60 kg)的臨床用藥劑量，則身痛逐瘀湯組小鼠灌胃身痛逐瘀湯的生藥濃度為1.375 g/mL。取上述中藥3劑加水浸泡過夜，共煎煮兩次，去除藥渣后混合兩次湯劑，分裝后于50 mL離心管中并-80 ℃冷庫保存。

異氟烷(沃瑞德，中國)，Veet脫毛膏(利潔時，中國)，吲哚菁綠(Acorn，美國)，TM-100型醫(yī)用超聲耦合劑(津亞，中國)。

1.1.3主要儀器：vivaCT40小鼠Micro-CT 掃描機(Scanco Medical AG公司，瑞士)；電子數(shù)字稱(KUBEI，中國)；多通道小動物氣體麻醉機(Matrx VMR，美國)；近紅外成像系統(tǒng)(Olympus MVX10，日本)；微量注射器(HAMILTON，中國)，1 mL無菌注射器(0.45×16 mm，山東威高)；ElectroForce 3200生物力學機(TA-Bose，美國)；痛閾測量儀(Ugo Basile，意大利)，自制軟組織腫脹測量儀。

1.2 分組與造模

采用隨機數(shù)字表法標記小鼠，隨機分為生理鹽水組和身痛逐瘀湯組，每組各20只。造模前兩天將小鼠右后肢用Veet脫毛膏脫毛，避免損傷皮膚。右側(cè)脛骨骨折復合髓內(nèi)固定造模方法：小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后，取仰臥位，從小鼠右膝中點以下作約1.5 cm縱行切口，暴露脛骨中段外側(cè)緣，鈍性分離脛骨周圍肌肉，避免損傷后肢回流淋巴管與淋巴結(jié)。將1 mL無菌注射器針頭從脛骨平臺中點穿入，沿脛骨長軸刺入骨髓腔約1.5 cm，回退針頭至脛骨平臺近側(cè)0.2 cm，用刀片輕輕割斷脛骨中段，骨折斷端對合齊后將針頭再向下插入髓腔至髓內(nèi)固定。當髓內(nèi)針與骨骼髓腔內(nèi)壁接觸緊密，輕輕順時或逆時針旋轉(zhuǎn)髓內(nèi)針，可見踝關(guān)節(jié)隨同方向轉(zhuǎn)動即證明對位對線良好，造模成功。剪斷外露于脛骨平臺的針帽，縫合皮膚并涂抹抗菌藥膏以預防感染[14]。

1.3 干預方法

造模后30 min后，身痛逐瘀湯組給予濃度1.375 g/mL身痛逐瘀湯藥液0.2 mL/d，生理鹽水組給予同體積0.2 mL的0.9 % NaCl溶液，兩組均連續(xù)灌胃5 d。至造模后14 d和28 d分別取骨折側(cè)脛骨進行Micro-CT掃描和三點彎曲試驗。

1.4 檢測項目與方法

1.4.1近紅外成像監(jiān)測后肢淋巴管回流功能：在術(shù)前及術(shù)后第1天和7天，分別皮內(nèi)注射小鼠足底0.2 μg/mL的吲哚菁綠溶液5 μL，即刻采用NIR-ICG淋巴成像技術(shù)記錄足底熒光信號標記為0 h，24 h后再次記錄足底熒光信號標記為24 h。運用Image J軟件定量分析圖片中ICG的熒光強度，并計算0 h和24 h兩個時間點的足底ICG熒光強度差值，即足底ICG清除率=(S0 h-S24 h)/S0 h×100 %[15]。

1.4.2改良肢體腫脹測量儀檢測骨折處軟組織腫脹度：造模前及成功后第1天、2天、3天、5天、7天，將小鼠右后肢膝關(guān)節(jié)以下完全浸入新型實用測腫儀，測量3次后取平均值記為實驗結(jié)果，計算骨折處軟組織腫脹度=造模后腫脹體積/造模前腫脹體積×100 %。

1.4.3足底熱敏痛閾檢測：造模后第1天，將提前禁食禁水的小鼠提前放入痛閾測量儀的封閉小室適應(yīng)2 h，待其安靜后，使用30 %的輻射熱誘導小鼠縮爪反應(yīng)。當小鼠感到疼痛并抬起后爪時，儀器自動記錄小鼠的爪子收縮時對應(yīng)的反應(yīng)時間。每只老鼠需重復測試5次。去掉5次測量結(jié)果的最高與最低值后，剩余3個值的平均值即為每只小鼠的平均反應(yīng)時間[16]。

1.4.4Micro-CT掃描：取75 %乙醇處理過的小鼠脛骨組織標本，放入 Micro-CT儀檢測艙，進行X線掃描，觀察各組小鼠脛骨骨折愈合及骨痂形成情況。隨后對脛骨樣本(脛骨平臺至踝關(guān)節(jié)之間的部位)進行斷層掃描成像，檢測參數(shù)：電壓70 kV、電流142 μA、9 μm分辨率，0.5 mm鋁過濾器。應(yīng)用配套軟件三維重建骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，并對骨痂的骨小梁參數(shù)進行定量分析[14]。

1.4.5三點彎曲試驗：取材后小心地將脛骨標本剔除所有附著肌肉，并用生理鹽水溶液浸泡后的紗布包裹于4 ℃保存。待所有標本收集齊后，將標本逐個平放于力學分析機器內(nèi)，保持骨痂部位統(tǒng)一角度放置于測試儀中點，鎖定標本兩端，打開電腦設(shè)置程序，進行實驗分析。

1.5 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計結(jié)果均為計量資料，采用均數(shù)±標準差描述，應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計分析。兩組獨立數(shù)據(jù)如果服從正態(tài)分布且方差齊，則采用t檢驗；若方差不齊則采用t’檢驗。兩組獨立數(shù)據(jù)如果不服從正態(tài)分布，則使用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗。兩組多個時間點測量數(shù)據(jù)采用重復測量方差分析和簡單效應(yīng)檢驗。檢驗水準α=0.05，P<0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 對下肢淋巴管回流功能的影響

圖1顯示，造模后第1天和第7天，身痛逐瘀湯組殘留的ICG熒光染料顯著少于生理鹽水組。表1顯示，造模后第1天和第7天，身痛逐瘀湯組骨折側(cè)足底NIR-ICG清除率均顯著高于生理鹽水組(P<0.001)。

圖1 兩組小鼠骨折側(cè)足底NIR-ICG的代表性圖片F(xiàn)ig.1 Representative images of plantar ICG clearance at fractured hindlimbs by NIR

表1 兩組小鼠骨折側(cè)足底ICG清除率比較(%)Table 1 Plantar ICG clearance at fractured hindlimb(%)

2.2 對骨折斷端軟組織腫脹度的影響

圖2顯示，骨折后第2天，和身痛逐瘀湯組對比，生理鹽水組骨折側(cè)脛骨和踝關(guān)節(jié)等部位有明顯的軟組織腫脹，皮膚表面伴小面積潰瘍。表2顯示，造模后第2、3、5、7天，身痛逐瘀湯組骨折側(cè)后肢的軟組織腫脹度均明顯低于生理鹽水組(P<0.001)。

圖2 術(shù)后第2天兩組小鼠骨折斷端軟組織腫脹的代表圖Fig.2 Representative picture of soft tissue swelling at fractured hindlimb on day 2

2.3 對足底熱敏痛閾的影響

表3顯示，骨折后第1天，身痛逐瘀湯組的熱敏痛閾反應(yīng)時間明顯高于生理鹽水組(P<0.01)。

表2 兩組骨折處軟組織腫脹度比較(%)Table 2 Soft tissue swelling degree of fractured side(%)

表3 兩組小鼠的熱敏痛閾反應(yīng)時間比較(s)

2.4 對骨痂形態(tài)計量學的影響

圖3顯示，骨折后第14天，身痛逐瘀湯組小鼠比生理鹽水組的骨痂量更多且更致密，骨折線更模糊。表4顯示，與生理鹽水組相比，身痛逐瘀湯組小鼠骨痂組織的骨體積分數(shù)(BV/TV)和骨小梁厚度(Tb.N)均顯著性升高(P<0.05)，但兩組的骨小梁數(shù)量(Tb.Th)和骨小梁分離度(Tb.Sp)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖3 兩組小鼠Micro-CT重建代表性圖片F(xiàn)ig.3 Micro-CT reconstruction images of callus morphology

表4 兩組骨痂計量學比較Table 4 Quantitative analysis of callus morphology

2.5 對骨折愈合生物力學性能的影響

表5顯示，骨折后第28天，身痛逐瘀湯組小鼠骨痂的最大應(yīng)力、屈服應(yīng)力明顯高于生理鹽水組(P<0.001)。

表5 兩組小鼠脛骨骨折愈合后的生物力學比較(MPa)Table 5 Biomechanical comparison of healing tibia(MPa)

3 討論

當人體遭受外傷，骨骼斷裂，經(jīng)脈受損，血液離開血液循環(huán)之“經(jīng)道”，停留于臟腑、胞宮、腠理之間則形成脈外瘀血。查閱既往古籍與文獻，瘀血不利于骨修復的原因包括纖維蛋白未及時清除會減少骨折斷端軟骨內(nèi)血管生成和骨化[17]，不利于局部組織的血供[18]，血液高凝狀態(tài)造成肺栓塞[19]，瘀血留滯、氣血不暢、不通則痛。然而，目前未有研究從淋巴管瘀滯的角度探討?zhàn)鲅獙切迯偷挠绊憽?/p>

Szczesny等[5]推測創(chuàng)傷后淋巴管瘀滯的機制可能與滲入組織間隙的血液發(fā)生凝固進而堵塞毛細淋巴管或淋巴液直接凝固有關(guān)，Wandolo等[20]發(fā)現(xiàn)瘀血里的紅細胞裂解物(血紅蛋白、含鐵血黃素和肌紅蛋白)可直接抑制淋巴管的搏動。淋巴管作為引流組織間液、轉(zhuǎn)運組織代謝產(chǎn)物的主要通道之一，對維持人體津液輸布和平衡有重要作用[21]。故疏通淋巴管瘀滯是緩解骨折早期血瘀證的重要切入點。

身痛逐瘀湯出自王清任的《醫(yī)林改錯》，具有活血祛瘀、通絡(luò)止痛無功效。方中君藥為川芎，性辛溫發(fā)散，善走竄，為血中之氣藥；輔以臣藥當歸、桃仁、紅花共同活血祛瘀；佐以沒藥和五靈脂以化瘀止痛，地龍、秦艽和羌活以祛風除濕，香附可疏肝理氣，牛膝可引血下行；使甘草調(diào)和諸藥。現(xiàn)代研究證實身痛逐瘀湯具有明顯的抗血栓、抗炎、鎮(zhèn)痛等多種藥效[22]。由于復方具有多成分與多靶點的復雜性，以上藥效可能均是身痛逐瘀湯明顯改善創(chuàng)傷后淋巴管瘀滯的藥理機制。

既往臨床研究評價身痛逐瘀湯促進骨修復的可信度不高，因其設(shè)計多疊加其他治療方法進行評價，且存在樣本量少、缺乏合理的對照組、以次要指標(如關(guān)節(jié)活動度、炎癥因子水平)評價骨修復、納入不同部位和不同程度骨折患者等不足。本研究采用空白對照設(shè)計，以Micro-CT和三點彎曲試驗作為主要指標直接評價身痛逐瘀湯對骨修復的療效。綜上所述，本研究基于疏通淋巴管瘀滯，增強淋巴管回流的角度，采用小鼠骨折模型證實身痛逐瘀湯具有明顯促進骨修復的作用，為中醫(yī)骨傷科早期活血化瘀法促進骨修復提供科學依據(jù)，開拓了中醫(yī)活血化瘀法促進骨修復藥理機制研究的新領(lǐng)域。