靜注人免疫球蛋白純化用層析介質(zhì)使用壽命的驗(yàn)證

張寶獻(xiàn)，劉亞芳，張劍濤，李冠軍，李光飛，孫振國，張學(xué)成

1.華蘭生物工程重慶有限公司研發(fā)部，重慶 408102；2.華蘭生物工程股份有限公司開發(fā)部，河南 新鄉(xiāng) 453003

靜注人免疫球蛋白是以健康人血漿經(jīng)低溫乙醇法制備的組分Ⅱ沉淀為原料，經(jīng)Fractogel?EMD TMAE（簡稱TMAE）陰離子交換層析、納米膜除病毒過濾、超濾、調(diào)制、除菌分裝和低pH孵放病毒滅活制備［1］。層析介質(zhì)的純化性能直接影響終產(chǎn)品藥物的安全性和有效性，層析介質(zhì)的重復(fù)使用可大大降低生產(chǎn)工藝成本，但同時(shí)其性能也會隨著重復(fù)使用次數(shù)的增加而降低。層析填料在生物藥物純化過程中屬于關(guān)鍵原材料，《中國藥典》三部（2020版）中《生物制品生產(chǎn)用原材料及輔料質(zhì)量控制》將層析填料分為第3級中等風(fēng)險(xiǎn)的原材料，需進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量控制［2］。近幾年來，對層析填料的管理和驗(yàn)證已成為法規(guī)監(jiān)管和現(xiàn)場核查的重點(diǎn)項(xiàng)目之一，《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》中已明確提出需對純化用材料（如層析柱填料）重復(fù)使用的可接受限度進(jìn)行驗(yàn)證，即層析填料的壽命驗(yàn)證［3］。

本研究在不改變工藝參數(shù)的條件下，對靜注人免疫球蛋白制備工藝中使用的TMAE層析介質(zhì)在縮小模型的使用壽命進(jìn)行界定，通過對離子交換層析洗脫組分中的雜質(zhì)蛋白分析確定雜質(zhì)蛋白成分，并進(jìn)行檢測分析，以確保產(chǎn)品具有良好的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 靜注人免疫球蛋白樣品 由華蘭生物工程股份有限公司制備。

1.2 主要試劑及儀器Fractogel?EMD TMAE層析介質(zhì)及層析柱購自德國默克公司；IgA和IgM酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自美國ICL Lab公司；MK3多功能酶標(biāo)儀和LP Vortex Mixer漩渦振蕩器購自芬蘭Thermo公司；GENIO電泳儀購自意大利Italy INTERLAB公司；UV-2600型分光光度計(jì)和TSKgel 3000SW購自日本島津公司；AKTA Pure150型層析系統(tǒng)和Severs-900型總有機(jī)碳分析儀購自美國GE公司；IX-51型顯微鏡購自日本奧林巴斯株式會社。

1.3 縮小模型的建立 通用的縮小模型的建立原則是采用線性縮小的方法學(xué)［5-9］。依據(jù)該線性縮小方法學(xué)，1個(gè)生產(chǎn)規(guī)模的層析柱的線性縮小模型參數(shù)見表1。在第1個(gè)和每次隔20個(gè)循環(huán)后，對收集液進(jìn)行IgA、IgM、分子大小分布檢測。在每20個(gè)循環(huán)后進(jìn)行N+1次空白試驗(yàn)，空白試驗(yàn)使用與料液性質(zhì)一致（相同pH，電導(dǎo)）的緩沖液替代料液進(jìn)行上樣，通過層析圖譜對比分析是否有紫外吸收峰出現(xiàn)，再生之后繼續(xù)進(jìn)行純化水清潔2～3個(gè)層析凝膠體積（column volume，CV），開始取樣檢測總有機(jī)碳（total organic carbon，TOC）。每次空白試驗(yàn)后進(jìn)行1次柱效檢測，并對層析介質(zhì)運(yùn)行過程中的層析圖譜、蛋白回收率、IgA、gM、分子大小分布、壓力、理論塔板數(shù)、對稱系數(shù)和TOC進(jìn)行趨勢分析。對每次層析的參數(shù)進(jìn)行比對，分析隨著循環(huán)次數(shù)的增加關(guān)鍵參數(shù)的變化情況，從而確定層析介質(zhì)使用壽命。層析介質(zhì)壽命的界定需考察其性能指標(biāo)隨周期延長的變化［10-13］。

表1 生產(chǎn)規(guī)模與縮小模型參數(shù)Tab.1 Parameters in production scale and downsizing model

1.4 層析流程

1.4.1 層析介質(zhì)的清洗和消毒 在純化處理下一批次樣品前，用0.5 mol／L氫氧化鈉對層析介質(zhì)進(jìn)行清洗和消毒，消毒時(shí)間30～60 min。

1.4.2 層析介質(zhì)的平衡和上樣 層析上樣前，先用層析緩沖液對層析介質(zhì)進(jìn)行平衡。平衡完畢后，按照15倍柱體積上樣量上樣，上樣過程中保留時(shí)間為20 min。

1.4.3 層析介質(zhì)的洗脫和再生 樣品上樣結(jié)束后，分別使用3倍柱床體積的洗脫液和再生液對層析介質(zhì)進(jìn)行處理，最終保存在20%的乙醇溶液中。

1.5 IgA和IgM含量檢測 采用ELISA法，按照試劑盒說明書操作，其中IgA應(yīng)≤100μg／mL，IgM應(yīng)≤50μg／mL。

1.6 層析柱清洗效果驗(yàn)證 顯微鏡觀察使用再生和清潔程序是否可去除功能基團(tuán)上強(qiáng)的吸附物質(zhì)以及積累的污染物，確定清潔步驟是否有效。

1.7 分子大小分布檢測 采用分子排阻高效液相色譜法。測定方法和結(jié)果分析按照《中國藥典》三部（2020版）通則3122［2］進(jìn)行，IgG單體和二聚體含量之和應(yīng)不低于95.0%。

1.8 TOC檢測 采用經(jīng)過校正的儀器進(jìn)行在線監(jiān)測，測定方法和結(jié)果分析按照《中國藥典》四部（2020版）通則0682［4］進(jìn)行。

1.9 電泳及痕量雜蛋白分析 分別收集離子交換層析后流穿液和洗脫液，采用Protein A特異性吸附層析，進(jìn)行8%SDS-PAGE，并進(jìn)行痕量雜蛋白分析。

1.10 層析紫外色譜圖疊加對比 選取其中20次循環(huán)層析純化280 nm紫外色譜圖進(jìn)行疊加對比分析，觀察層析圖譜是否發(fā)生明顯變異或峰形出現(xiàn)拖尾等惡化現(xiàn)象。

2 結(jié)果

2.1 洗脫成分分析 離子交換層析洗脫組分中的雜質(zhì)蛋白主要有相對分子質(zhì)量900 000、170 000、100 000、50 000這4個(gè)條帶，見圖1。依據(jù)大小推測為IgM、IgA以及一些小分子雜蛋白。

圖1洗脫成分的SDS-PAGE非還原電泳圖Fig.1 Non-reduced SDS-PAGE profile of eluate

2.2 層析柱清洗效果驗(yàn)證 顯微鏡觀察顯示，凝膠介質(zhì)使用后，凝膠表面吸附有雜質(zhì)蛋白；使用洗脫及再生溶液接觸層析介質(zhì)30～60 min，再次觀察可見凝膠顆粒表面光滑。見圖2。表明使用再生和清潔程序可去除功能基團(tuán)上強(qiáng)的吸附物質(zhì)以及積累的污染物，此清潔步驟有效。

圖2 層析介質(zhì)清洗前（A）、后（B）的顯微鏡觀察（×400）Fig.2 Microscopy of chromatographic medium before（A）and after（B）cleaning（×400）

2.3 層析柱縮小模型層析的效果 在240次循環(huán)的層析介質(zhì)壽命驗(yàn)證過程中，IgA檢測均值≤100μg／mL，IgM≤50μg／mL，IgG單體與二聚體含量之和＞95.0%，均符合產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，見表2。

在240次循環(huán)的層析介質(zhì)壽命驗(yàn)證過程中，層析介質(zhì)對料液中的雜質(zhì)蛋白保持穩(wěn)定的去除能力，分離純化效果未發(fā)生衰減。隨著層析介質(zhì)使用次數(shù)增加，在層析介質(zhì)允許的壓力報(bào)警值以下，層析介質(zhì)的壓力呈逐步升高的趨勢，蛋白回收率下降，在可接受范圍內(nèi)。見表2。

每20次循環(huán)進(jìn)行1次理論塔板數(shù)和對稱系數(shù)檢測，共進(jìn)行了12次檢測，理論塔板數(shù)可達(dá)2 000以上，均值為3 196，對稱系數(shù)均在0.8～1.5范圍內(nèi)，均值為1.13，均在要求范圍之內(nèi)，見表2。表明層析介質(zhì)可耐受240次靜注人免疫球蛋白樣品的層析使用。

表2 層析柱縮小模型純化靜注人免疫球蛋白樣品的層析效果Tab.2 Purification effect of human immunoglobulin for intravenous injection with chromatographic column in downsizing model

2.4 層析空白對照TOC檢測 層析空白對照運(yùn)行次數(shù)21、41、61、81、101、121、141、161、181、201、221、241的TOC檢測結(jié)果分別為32.4、53.3、30.4、31.3、34.1、33.8、42.1、45.7、51.1、44.0、33.8、47.0 ppb，均值為39.9 ppb，均小于0.5 mg／L（藥典規(guī)定純化水檢測標(biāo)準(zhǔn)），表明清潔步驟有效。

2.5 層析紫外色譜圖疊加對比20次循環(huán)的層析圖譜表現(xiàn)出較高的一致性，表明隨著層析純化次數(shù)的增多，層析圖譜未發(fā)生明顯變異或峰形出現(xiàn)拖尾等惡化現(xiàn)象，見圖3。

圖3 層析過程280 nm紫外色譜疊加圖Fig.3 UV superposition diagram at 280 nm of chromatographic process

3 討論

本研究層析介質(zhì)為TMAE強(qiáng)陰離子交換凝膠，其功能性離子交換集團(tuán)通過線性聚合物鏈結(jié)合，因此，膠粒具有很高的機(jī)械和化學(xué)穩(wěn)定性，可用于分離生化制品、蛋白質(zhì)、多肽等物質(zhì)的純化。根據(jù)該特性將雜質(zhì)蛋白吸附于凝膠上，目標(biāo)蛋白在流穿液中，實(shí)現(xiàn)對靜注人免疫球蛋白的純化。每種層析凝膠的使用壽命應(yīng)進(jìn)行獨(dú)立、專一的研究，建立該層析凝膠使用壽命的研究數(shù)據(jù)，并在常規(guī)商業(yè)化生產(chǎn)過程中對該數(shù)據(jù)進(jìn)行同步確認(rèn)。

在建立縮小模型中通常保持層析柱柱高，線性流速不變，降低層析柱的柱直徑和體積流速。另外，上樣載量、緩沖液體積與柱體積的比值也要保持不變。有時(shí)由于硬件原因不能保持柱高和線性流速時(shí)，可考慮通過同時(shí)改變柱高和線性流速而保持保留時(shí)間不變的方案?？s小模型中的前3個(gè)循環(huán)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與以往的生產(chǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，做差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果無顯著性差異，說明縮小模型的建立有效，可代表原生產(chǎn)規(guī)模的層析效果和行為。

層析填料的壽命衰減是一個(gè)層析性能逐漸退化的過程，并受多種因素的影響：層析介質(zhì)位于純化不同階段、層析模式、介質(zhì)類型、層析料液的蛋白濃度、上樣量和料液中雜質(zhì)污染過程；所采用的層析介質(zhì)清洗方案的有效性、其對清洗方案的耐受性及其理化性質(zhì)；層析介質(zhì)的儲存條件和裝填頻率等也會影響其使用壽命。因此，需通過系統(tǒng)化的使用壽命研究方案進(jìn)行數(shù)據(jù)的收集和分析，從而建立一個(gè)合理的使用壽命周期。迄今，已開發(fā)了很多方法來提高層析填料的壽命和性能，再生條件優(yōu)化可有效延長使用壽命，澄清技術(shù)的改進(jìn)改變了原料的性質(zhì)和后續(xù)的層析工藝條件，如流速、流動(dòng)相黏度等，也可有效延長層析填料的壽命。層析介質(zhì)的壽命評估必須考慮填料的購置成本、清洗成本、使用次數(shù)、驗(yàn)證成本等綜合因素決定，越長的壽命，風(fēng)險(xiǎn)越大，驗(yàn)證費(fèi)用大，并不一定能真正節(jié)省成本［14-16］。

層析填料的壽命判斷標(biāo)準(zhǔn)主要是層析性能的改變，如動(dòng)態(tài)結(jié)合載量的改變、收率的降低以及雜質(zhì)分離效果的降低等。洗脫收集譜圖的變化也可作為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，層析填料的污染往往會導(dǎo)致峰展寬。層析柱的柱效測量標(biāo)準(zhǔn)，如理論塔板數(shù)和對稱系數(shù)也可用來反映層析填料的壽命變化。層析介質(zhì)的清洗驗(yàn)證與層析介質(zhì)的壽命對于生物藥物的生產(chǎn)十分重要，優(yōu)化清洗試劑以及清洗的操作程序可延長層析介質(zhì)的壽命。同時(shí)，層析系統(tǒng)的選擇（包括層析儀、層析柱以及裝柱、層析柱運(yùn)行的輔助設(shè)備）也會影響層析介質(zhì)的壽命。

本研究對靜注人免疫球蛋白層析介質(zhì)進(jìn)行了240次循環(huán)上樣、洗脫和清洗循環(huán)后，層析圖譜擬合度較好，無多余的雜峰或發(fā)生峰的偏移，表現(xiàn)出較高的一致性；制品關(guān)鍵參數(shù)IgA、IgM和IgG單體與二聚體含量之和均符合產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，將靜注人免疫球蛋白TMAE層析介質(zhì)的純化使用次數(shù)暫定為240次。該層析工藝的清洗方法能夠有效去除層析過程中結(jié)合在層析柱上的雜質(zhì)成分，使用240次不會對層析介質(zhì)的分離純化性能造成影響?？s小規(guī)模試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)僅能證明在層析柱縮小模型的效果，目前使用的TMAE凝膠在商業(yè)規(guī)模下已使用150次，次數(shù)還在不斷增加，目前產(chǎn)品質(zhì)量檢測結(jié)果穩(wěn)定且均符合規(guī)定，繼續(xù)使用縮小規(guī)模驗(yàn)證TMAE的使用壽命，可為商業(yè)規(guī)模提供數(shù)據(jù)支持，降低商業(yè)規(guī)模中生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)［17-18］。