子癇前期患者血清環(huán)狀RNA HIPK3水平變化及其對妊娠結(jié)局的預(yù)測效能

沈家慧，胡海珊，歐曼穎，鄒聰聰，謝春麗，黃煒

1海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院海南省人類生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 570102；2海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科；3海南醫(yī)學(xué)院熱帶轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

子癇前期（PE）是一種多發(fā)生于妊娠20周后的妊娠期并發(fā)癥，可使孕產(chǎn)婦出現(xiàn)心、肝、腎等多器官損傷，也可引發(fā)胎兒生長受限、宮內(nèi)窘迫，對母嬰妊娠結(jié)局產(chǎn)生不利影響［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，PE發(fā)病與胎盤灌注不足、環(huán)狀RNA（circRNA）異常表達(dá)、滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤、氧化應(yīng)激、子宮—胎盤血管結(jié)構(gòu)異常、炎癥反應(yīng)、自噬、血管內(nèi)皮損傷等相關(guān)［3-4］。circRNA是非編碼RNA的一種，可調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、剪切，影響蛋白質(zhì)翻譯，是診斷PE、心血管疾病等的潛在標(biāo)志物［5］。HIPK3是circRNA家族的一員，其在PE患者胎盤組織中呈低表達(dá)。研究認(rèn)為，HIPK3可能是治療PE的分子靶點(diǎn)［6］。本研究觀察了PE患者血清HIPK3水平變化，初步分析HIPK3與PE患者臨床參數(shù)的相關(guān)性，探討血清HIPK3檢測對PE患者妊娠結(jié)局的預(yù)測價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對象分組與臨床資料收集選取2018年4月—2021年6月入院的PE患者95例為PE組，年齡23～38（31.14±5.38）歲，孕次1～3（1.87±0.56）次，分娩孕周33～41（37.19±2.53）周；患者均符合第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》中PE的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］，均為單胎妊娠，自然受孕，檢查資料齊全，自愿參與本研究；排除孕前合并慢性腎炎、糖尿病、腎病綜合征、高血壓者，合并心臟病、甲狀腺功能亢進(jìn)、嚴(yán)重肝損傷者，合并免疫功能障礙、凝血功能異常、腫瘤者，有其他妊娠疾病者，有急慢性感染或傳染病史者，有煙酒不良嗜好者。另選取同期孕檢的健康孕婦95例為對照組，年齡23～38（30.96±5.21）歲，孕次1～3（1.92±0.58）次，分娩孕周33～41（37.12±2.50）周，均為單胎妊娠、自然受孕、無糖尿病或其他妊娠相關(guān)疾病，血壓＜140/90 mmHg，無蛋白尿。PE組與對照組年齡、孕次、分娩孕周差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。本研究符合《赫爾辛基宣言》。收集兩組孕婦總蛋白、白蛋白、24 h尿蛋白、舒張壓、收縮壓、肌酐、尿酸、胱抑素C、尿素氮等臨床指標(biāo)，收集PE患者孕前體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、PE嚴(yán)重程度、分娩方式、分娩情況等資料。與對照組相比，PE組白蛋白、總蛋白水平降低，24 h尿蛋白、舒張壓、收縮壓、肌酐、尿酸、胱抑素C、尿素氮水平升高（P均＜0.05）。詳見表1、表2。

表1 PE組與對照組血清蛋白水平及血壓比較（±s）

表1 PE組與對照組血清蛋白水平及血壓比較（±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別PE組對照組n 95 95白蛋白（g/L）30.11±3.03*34.53±3.27 24 h尿蛋白（mg）1 952.34±142.70*86.21±9.67總蛋白（g/L）55.22±5.85*63.13±6.51舒張壓（mmHg）107.45±10.99*74.22±7.84收縮壓（mmHg）139.38±12.46*112.23±9.41

表2 PE組與對照組腎功能指標(biāo)比較（μmol/L，±s）

表2 PE組與對照組腎功能指標(biāo)比較（μmol/L，±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別PE組對照組n 95 95肌酐56.60±9.53*42.53±5.51尿酸319.56±37.91*265.48±28.70胱抑素C 1.73±0.55*1.14±0.37尿素氮4.24±1.18*3.08±1.03

1.2 血清HIPK3水平檢測收集兩組妊娠29～33周時(shí)的清晨空腹外周血5～6 mL，分離血清。采用Trizol LS Reagent抽提總RNA，用First-Strand cDNA Synthesis Kit制備cDNA，Realtime PCR Master Mix（SYBR Green）、qRT-PCR儀擴(kuò)增cDNA。擴(kuò)增條件：98.2℃預(yù)變性10 min，96.5℃變性40 s、60.5℃退火25 s、70.4℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。HIPK3上游引物序列為5＇-TTCAACATATCTACAATCTCGGT-3＇，下游引物序列為5＇-ACCATTCACATAGGTCCGT-3＇；內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5＇-CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGACAG-3＇，下游引物序列為5＇-AGGGGTCTTACTCCTTGGAGGCCA-3＇。以2－ΔΔCt表示HIPK3相對表達(dá)量。

1.3 妊娠結(jié)局觀察收集PE組與對照組孕婦發(fā)生HELLP綜合征、產(chǎn)后出血、胎盤早剝、胎兒窘迫、早產(chǎn)、胎兒生長受限、胎兒死亡的情況。根據(jù)PE組是否發(fā)生上述不良妊娠結(jié)局，進(jìn)一步分為妊娠結(jié)局不良者和妊娠結(jié)局良好者。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例和百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson法。影響因素分析采用Logistic回歸分析法。采用受試者工作特征（ROC）曲線評價(jià)血清HIPK3對PE患者妊娠結(jié)局的預(yù)測效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組與PE組血清HIPK3水平及不良妊娠結(jié)局比較PE組血清HIPK3水平為0.47±0.16，低于對照組的1.03±0.34（P＜0.05）。與對照組相比，PE組HELLP綜合征、產(chǎn)后出血、胎盤早剝、胎兒窘迫、早產(chǎn)、胎兒生長受限、胎兒死亡發(fā)生率升高（P均＜0.05）。詳見表3。

表3 PE組、對照組不良妊娠結(jié)局比較［例（%）］

2.2 PE患者血清HIPK3水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性PE患者血清HIPK3水平與白蛋白、總蛋白呈正相關(guān)（r分別為0.567、0.581，P均＜0.05），與24 h尿蛋白、舒張壓、收縮壓、胱抑素C水平呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.543、-0.497、-0.595、-0.532，P均＜0.05）。

2.3 PE患者妊娠結(jié)局的影響因素分析與妊娠結(jié)局良好者相比，妊娠結(jié)局不良者重度PE患者占比、收縮壓、胱抑素C水平升高，血清HIPK3水平降低（P均＜0.05）。見表4～6。以PE患者妊娠結(jié)局為因變量（妊娠結(jié)局良好=0，妊娠結(jié)局不良=1），以PE嚴(yán)重程度（輕度=0，重度=1）、收縮壓（實(shí)測值）、胱抑素C（實(shí)測值）、HIPK3（實(shí)測值）為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，重度PE、收縮壓是PE患者不良妊娠結(jié)局的危險(xiǎn)因素，HIPK3是PE患者不良妊娠結(jié)局的保護(hù)因素（P均＜0.05）。見表7。

表4 不同妊娠結(jié)局PE患者分娩方式、初產(chǎn)婦情況、PE嚴(yán)重程度比較（例）

表5 不同妊娠結(jié)局PE患者年齡、孕前BMI、分娩孕周、血清蛋白、尿蛋白水平比較（±s）

表5 不同妊娠結(jié)局PE患者年齡、孕前BMI、分娩孕周、血清蛋白、尿蛋白水平比較（±s）

妊娠結(jié)局結(jié)局良好結(jié)局不良n 57 38年齡（歲）30.67±5.31 31.85±5.49 BMI（kg/m2）22.18±2.66 22.30±2.71分娩孕周（周）37.15±2.52 37.24±2.54白蛋白（g/L）30.52±3.10 29.50±2.97 24 h尿蛋白（mg）1 941.27±140.34 1 968.95±145.62總蛋白（g/L）55.87±5.95 54.25±5.71

表6 不同妊娠結(jié)局PE患者血壓、肌酐、尿酸、胱抑素C、尿素氮、HIPK3水平比較（±s）

表6 不同妊娠結(jié)局PE患者血壓、肌酐、尿酸、胱抑素C、尿素氮、HIPK3水平比較（±s）

注：與妊娠結(jié)局不良者相比，*P＜0.05。

妊娠結(jié)局結(jié)局良好結(jié)局不良n 57 38舒張壓（mmHg）106.36±10.62 109.09±11.03收縮壓（mmHg）132.37±11.73*159.90±13.67肌酐（μmol/L）55.37±9.21 58.45±9.78尿酸（μmol/L）315.59±37.26 325.52±38.57胱抑素C（μmol/L）1.42±0.47*2.20±0.73尿素氮（μmol/L）4.03±1.34 4.56±1.52 HIPK3 0.58±0.20*0.31±0.11

表7 PE患者妊娠結(jié)局影響因素的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

2.4 血清HIPK3對PE患者妊娠結(jié)局的預(yù)測效能ROC曲線分析顯示，血清HIPK3預(yù)測PE患者妊娠結(jié)局的曲線下面積（AUC）為0.889（95%CI0.824～0.954），截?cái)嘀禐?.40，約登指數(shù)為0.658，靈敏度、特異度分別為81.6%、84.2%。見圖1。

圖1 血清HIPK3預(yù)測PE患者妊娠結(jié)局的ROC曲線

3 討論

PE是一種多發(fā)于妊娠中晚期的高血壓疾病，其發(fā)病率逐年上升，是造成孕產(chǎn)婦、圍產(chǎn)兒死亡的重要原因［8-10］。本研究發(fā)現(xiàn)，PE組HELLP綜合征、產(chǎn)后出血、胎盤早剝、胎兒窘迫、早產(chǎn)、胎兒生長受限、胎兒死亡發(fā)生率高于對照組，表明PE患者及其胎兒發(fā)生不良妊娠結(jié)局的概率較大，及時(shí)診治PE非常必要。circRNA在血清中可穩(wěn)定存在，具有時(shí)空特異性、高度保守性等特點(diǎn)，可影響蛋白質(zhì)翻譯，調(diào)控miR表達(dá)，與PE等高血壓相關(guān)疾病進(jìn)展有關(guān)［11-14］，有助于輔助診斷PE。然而，目前臨床上仍缺乏能夠有效預(yù)測PE患者妊娠結(jié)局的血清標(biāo)志物。因此，尋找與PE病理參數(shù)變化相關(guān)且可有效預(yù)測妊娠結(jié)局的血清指標(biāo)，對及時(shí)干預(yù)PE、改善PE患者及其胎兒的結(jié)局有積極意義。

近期研究顯示，circRNA 0085296在PE患者中表達(dá)失調(diào)，其可通過靶向調(diào)控miR-942-5p表達(dá)，調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、侵襲，影響血管生成，從而影響PE進(jìn)展，故circRNA 0085296可能是PE的治療靶點(diǎn)［15］。另有研究發(fā)現(xiàn)，circRNA 0007121在PE患者胎盤組織中表達(dá)下調(diào)，其可通過與miR-182-5p靶向結(jié)合進(jìn)而調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲、遷移、上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制PE的進(jìn)展［16］。以上研究表明，PE發(fā)生發(fā)展可能與circRNA異常表達(dá)相關(guān)。HIPK3作為circRNA的成員之一，其在PE中表達(dá)水平降低，HIPK3可通過靶向調(diào)控miR-346表達(dá)水平，進(jìn)而影響滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移、侵襲。研究認(rèn)為，HIPK3可能參與PE的發(fā)生發(fā)展［17］。ZHANG等［6］也得出了類似的結(jié)論。本研究中，PE組血清HIPK3水平低于對照組，與相關(guān)研究結(jié)果一致，提示HIPK3表達(dá)下調(diào)可能與PE病理變化顯著有關(guān)。推測HIPK3可能與miR靶向結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移、侵襲，抑制滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤能力，使胎盤子宮螺旋動(dòng)脈重塑不足，造成血管阻力增加，胎盤血供減少［6，17］，從而調(diào)控PE進(jìn)展，具體機(jī)制有待深入研究。

PE患者多伴腎功能異常、血壓升高等［18-19］。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，PE組白蛋白、總蛋白水平降低，24 h尿蛋白、舒張壓、收縮壓、肌酐、尿酸、胱抑素C、尿素氮水平升高，與相關(guān)研究結(jié)果類似［18-19］，且PE患者血清HIPK3水平與白蛋白、總蛋白、24 h尿蛋白、舒張壓、收縮壓、胱抑素C顯著相關(guān)，提示HIPK3水平可能與PE患者腎功能異常、血壓升高關(guān)系密切，這為臨床治療PE患者腎功能損傷提供了新方向。多因素分析顯示，PE嚴(yán)重程度是導(dǎo)致PE患者不良妊娠結(jié)局的重要因素。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清HIPK3預(yù)測PE患者妊娠結(jié)局的AUC為0.889，靈敏度為81.6%，特異度為84.2%，當(dāng)血清HIPK3水平低于0.40時(shí)，PE患者發(fā)生不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)較高。這提示血清HIPK3對PE患者妊娠結(jié)局有一定預(yù)測價(jià)值，HIPK3有望成為評估PE妊娠結(jié)局的血清標(biāo)志物。

綜上，PE患者血清HIPK3水平降低，與白蛋白、總蛋白、24 h尿蛋白、舒張壓、收縮壓、肌酐、尿酸、胱抑素C、尿素氮等臨床指標(biāo)密切相關(guān)，且HIPK3對于PE患者妊娠結(jié)局有一定預(yù)測價(jià)值。然而，HIPK3在PE發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制尚未完全明確，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將結(jié)合基礎(chǔ)研究加以探究；另外，因樣本量較少，本研究未能深入分析血清HIPK3水平與PE患者妊娠結(jié)局的關(guān)系，后期將增加樣本量，就血清HIPK3對HELLP綜合征、早產(chǎn)、胎兒死亡等妊娠結(jié)局的預(yù)測價(jià)值進(jìn)行分層探究。