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    基于UPLC指紋圖譜及化學(xué)模式識別分析的四季三黃片質(zhì)量一致性評價△

    2022-11-27 03:26:58雷蓉周亞楠白潔蘇建劉永利
    中國現(xiàn)代中藥 2022年10期
    關(guān)鍵詞:黃片黃芩指紋

    雷蓉,周亞楠,白潔,蘇建,劉永利

    河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院 河北省中藥質(zhì)量評價與標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室,河北 石家莊 050227

    藥品質(zhì)量的一致性是臨床有效性和安全性的重要保證。中成藥組方藥味多,成分復(fù)雜,如何進(jìn)行一致性評價一直是中藥質(zhì)量評價的關(guān)鍵問題,原輔料質(zhì)量、藥品生產(chǎn)工藝參數(shù)和人員變動等因素都會影響到批間的一致性[1-2]。色譜指紋圖譜能較為全面地展現(xiàn)組方中各藥味的化學(xué)組成,在中藥質(zhì)量的整體評價中作為一種較為成熟的技術(shù)得到廣泛應(yīng)用?;瘜W(xué)模式識別技術(shù)主要包括主成分分析(PCA)、聚類分析(HCA)、偏最小二乘法-判別分析(PLSDA)等,通過降維對指紋圖譜數(shù)據(jù)綜合分析,達(dá)到分類、識別并篩選質(zhì)量差異標(biāo)志物的目的。目前,色譜指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別已成為一種重要的中藥質(zhì)量評價方式[3-21]。

    四季三黃片收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》第二十冊,由大黃、黃芩、黃柏、梔子4 味中藥制成,具有消炎退熱、通便利水的功效,臨床上主要用于治療口鼻生瘡、咽喉腫痛、大便秘結(jié)、小便赤黃等癥[22]。本研究采用超高效液相色譜法(UPLC)建立了四季三黃片的指紋圖譜,指認(rèn)了21 個共有峰,在指紋圖譜相似度評價的基礎(chǔ)上,結(jié)合化學(xué)模式識別技術(shù)分析評價了23 批來源于4 個不同生產(chǎn)企業(yè)的樣品質(zhì)量與批間一致性,為四季三黃片整體質(zhì)量評價提供參考。

    1 材料

    1.1 儀器

    超高壓液相-離子阱靜電場軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC LTQ Orbitrap MS,配備Dionex UltiMate 3000 型UPLC 儀、LTQ-Orbitrap Elite 組合型高分辨質(zhì)譜儀,美國Thermo 公司);XPE26 型電子天平(0.001 mg)、XS105DU 型電子天平(0.01 mg)均購于瑞士Mettler-Toledo 公司;KQ-500DE 型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);Milli-Q 型超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

    1.2 試藥

    對照品梔子苷(批號:110749-201919,純度:97.1%)、黃芩苷(批號:110715-201821,純度:95.4%)、鹽酸小檗堿(批號:110713-201212,純度:86.8%)、黃芩素(批號:111595-201808,純度:97.9%)、漢黃芩素(批號:111514-201706,純度:100.0%)、蘆薈大黃素(批號:110795-201710,純度:99.5%)、大黃酸(批號:110757-201607,純度:99.3%)、大黃素(批號:110756-201512, 度:98.7%)、漢黃芩苷(批號:112002-201702,純度:98.5%)、大黃酚(批號:110796-201922,純度:99.4%)、大黃素甲醚(批號:110758-201817,純度:99.2%)均購于中國食品藥品檢定研究院;甲醇、乙腈均為色譜純;三氟乙酸(色譜純,天津化學(xué)有限公司);水為超純水。23批四季三黃片抽自全國各地經(jīng)營、使用單位,涉及4 家生產(chǎn)企業(yè),其中A 企業(yè)樣品4 批次(S1~S4)、B企業(yè)樣品2批(S5~S6)、C企業(yè)樣品6批(S7~S12)、D企業(yè)樣品11批(S13~S23)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜及質(zhì)譜條件

    2.1.1 色譜條件 色譜柱:Shimadzu Shim-pack gist C18(100 mm×2.1mm,2 μm),以乙腈(A)-0.1%三氟乙酸水溶液(B)為流動相,梯度洗脫(0~10 min,10%~15%A;10~20 min,15%~30%A;20~30 min,30%~42%A;30~45 min,42%~75%A);體積流量為0.3 mL·min-1;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為2 μL;檢測波長為254nm。UPLC LTQ Orbitrap MS分析過程以0.1%甲酸水溶液為流動相B,其余條件同上。

    2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)噴霧電壓:+3.5 kV;鞘氣流速:35 arb;輔助氣流速:10 arb;毛細(xì)管溫度:300 ℃;加熱器溫度:300 ℃;掃描方式:傅里葉變換高分辨全掃模式,數(shù)據(jù)依賴性DDA-MS2,掃描范圍:m/z150~2000。

    2.2 溶液的制備

    2.2.1 混合對照品溶液制備 取鹽酸小檗堿、梔子苷、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚對照品適量,精密稱定,加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.08055、0.20330、0.05013、0.08887、0.03105、0.014 20、0.019 97、0.009 18、0.017 90、0.016 94、0.025 91 mg·mL-1的混合對照品溶液。

    2.2.2 供試品溶液的制備 取四季三黃片粉末0.4 g,精密稱定,放置到錐形瓶中,精密加70%甲醇50 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲(700 W,40 kHz)30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用70%甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,用0.22 μm 微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

    2.3 方法學(xué)考察

    2.3.1 精密度試驗 取供試品溶液(S9),按2.1.1 項下色譜條件進(jìn)樣6 次,測定并分析數(shù)據(jù),以4 號峰(黃芩苷)為參照峰,各共有色譜峰相對保留時間的RSD為0.02%~0.19%,相對峰面積的RSD為0.17%~1.66%,表明儀器的精密度良好。

    2.3.2 重復(fù)性試驗 取同一批次的樣品(S9),按2.2.2 項下方法制備供試品溶液,平行6 份,按2.1.1 項下色譜條件測定并分析,以4 號峰(黃芩苷)為參照峰,各共有色譜峰的相對保留時間的RSD 為0.01%~0.11%,相對峰 面積的RSD 為0.41%~1.96%,表明方法的重復(fù)性良好。

    2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取編號S9 供試品溶液,分別在0、1、3、6、12、16、24 h 進(jìn)樣測定并分析,以4 號峰(黃芩苷)為參照峰,各共有色譜峰的相對保留時間的RSD 為0.03%~0.23%,相對峰面積的RSD 為0.30%~2.18%,表明供試品溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.4 指紋圖譜的建立及相似度評價

    2.4.1 指紋圖譜的建立和共有峰的指認(rèn) 取23批四季三黃片的供試品溶液,按2.1.1項下色譜條件檢測,記錄色譜圖。采用“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012版)對23批樣品的色譜圖進(jìn)行分析,將S1樣品的色譜圖設(shè)為參照圖譜,時間窗寬度為0.1 min,多點校正后自動峰匹配,標(biāo)定了21 個共有峰,所有樣品的疊加圖見圖1,典型樣品和對照品色譜圖見圖2,其中11個峰采用對照品比對進(jìn)行了確證,其余的10個共有峰采用LTQ Orbitrap 高分辨質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行指認(rèn),離子碎片信息見表1。共有峰中1 號峰來自于梔子,2、9、18 號峰來自黃柏,3~7、10~14 號峰均來自黃芩,15、16、19~21號峰來自大黃。

    表1 四季三黃片正離子模式下的化合物鑒定及歸屬

    圖1 23批四季三黃片的UPLC疊加圖

    圖2 四季三黃片混合對照品和樣品的UPLC圖

    2.4.2 相似度評價 對23批四季三黃片的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析,結(jié)果見表2。A 企業(yè)的樣品相似度均在0.979以上,B企業(yè)樣品相似度為0.869~0.944,C 企業(yè)樣品相似度為0.442~0.973,D 企業(yè)樣品相似度為0.730~0.933,表明4 家生產(chǎn)企業(yè)樣品質(zhì)量差異較大,A、B、D 3家企業(yè)內(nèi)不同批次樣品質(zhì)量一致性較好,而C企業(yè)不同批次樣品質(zhì)量一致性較差。

    2.5 化學(xué)模式識別

    2.5.1 HCA HCA 可以更直觀地展現(xiàn)樣品批間化學(xué)組分的差異性,利用OriginPro 2021軟件對21個共有峰的相對峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)HCA,結(jié)果見圖3。23批樣品按各生產(chǎn)企業(yè)聚為3類,A、D 企業(yè)各為一類,B、C企業(yè)聚為一類,

    圖3 23批四季三黃片的HCA

    2.5.2 PCA 采用SIMCA 12.0 軟件23 批樣品的21 個共有峰數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA,以主成分特征值及累積方差貢獻(xiàn)率進(jìn)行篩選,通過繪制的得分圖與載荷圖對模型進(jìn)行解釋,進(jìn)一步應(yīng)用Hotelling'sT2和DModX控制圖對樣品批間質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測。

    模型擬合后共提取5 個主成分,累積方差貢獻(xiàn)率為93.7%,見表3。其中PC1和PC2累積方差貢獻(xiàn)率為70.4%,可以代表21 個共有峰的主要信息,繪制得分圖(圖4)、載荷圖(圖5)。由圖4 可知,23批樣品按不同企業(yè)分類明顯,與HCA 結(jié)果一致,表明不同企業(yè)間樣品一致性較差。載荷圖距離原點越遠(yuǎn)的變量,權(quán)重越大,代表該化合物的含量對樣品的整體分布所起的作用越大。由圖5可知,C21(大黃素甲醚)、C2對PC1貢獻(xiàn)較大,C4、C6(黃芩苷)對PC2貢獻(xiàn)較大。

    圖4 23批四季三黃片樣品的PCA散點得分

    圖5 23批四季三黃片樣品的主成分載荷圖

    表2 23批樣品的指紋圖譜相似度評價分析結(jié)果

    表3 四季三黃片PCA特征值與累積方差貢獻(xiàn)率 %

    2.5.3 Hotelling'sT2和DModX 控制限的建立 Hotelling'sT2和DModX控制圖用來監(jiān)測不同批次的產(chǎn)品的一致性,是2 個互補的多變量分析手段,可用于分析超出控制限批次產(chǎn)品的異常波動受哪些變量的影響[20]。Hotelling'sT2和DModX 的控制圖見圖6~7,圖中T2Crit(99%)和D Crit 為控制限,其上限分別為25.95、1.59;圖中的T2Crit(95%)為警戒限,上限為17.06。23 批樣品的波動范圍在均在控制限之下,為正常批次產(chǎn)品。

    圖6 23批四季三黃片樣品的Hotelling's T2控制圖

    2.5.4 PLS-DA 經(jīng)過上述分析,雖然各批次產(chǎn)質(zhì)量均在可控范圍內(nèi),未出現(xiàn)異常批次,但各企業(yè)間樣品分類明顯,為進(jìn)一步篩選出導(dǎo)致23 批樣品產(chǎn)生差異的成分,采用OPLS-DA,利用變量重要性投影(VIP)值進(jìn)行預(yù)測分析(圖8)。以VIP 值>1 為標(biāo)準(zhǔn),篩選出C18、C5、C10、C2、C19、C4、C6、C9、C7、C1、C21 11個化合物為引起樣品間差異的主要因素。其中影響較大的是C18、C5 和C10,其中C18 來源于黃柏,C5 和C10 來源于黃芩,提示生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)關(guān)注黃柏、黃芩投料的原藥質(zhì)量。

    圖7 23批四季三黃片樣品的DModX控制圖

    圖8 四季三黃片的OPLS-DA的VIP值(, n=23)

    3 討論

    3.1 色譜條件優(yōu)化

    在供試品溶液制備方法考察時,分別考察了不同提取方式(超聲、回流)、不同提取溶劑(50%甲醇、70%甲醇、甲醇)、不同提取時間(15、30、45 min)、不同提取溶劑體積(25、50、100 mL)對四季三黃片中有效成分提取的影響,綜合色譜峰數(shù)量及響應(yīng)值,確定采用70%甲醇超聲提取30 min 的方法。

    在考察液相色譜條件時,分別考察了以乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%三氟乙酸和乙腈-0.1%醋酸銨為流動相梯度洗脫,結(jié)果表明,乙腈-0.1%三氟乙酸梯度洗脫呈現(xiàn)的色譜峰分離度良好,峰形最佳。并通過全波長掃描,樣品在254 nm 下色譜峰較多,且峰面積較大,故選擇了254 nm 作為檢測波長。

    3.2 不同企業(yè)間樣品質(zhì)量一致性分析

    由相似度、PCA、HCA 結(jié)果可知,不同企業(yè)間樣品質(zhì)量差異明顯,尤其C 企業(yè)與其他3 家差距大,通過進(jìn)一步對篩選出來的3 個影響較大的差異標(biāo)志性化合物C18、C5 和C10 原始數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)C 企業(yè)樣品中這3個化合物的相對含量均遠(yuǎn)低于其他3個企業(yè),表明C 企業(yè)所投黃柏、黃芩質(zhì)量與其他3 家有較大差異,提示企業(yè)應(yīng)關(guān)注這2種中藥的質(zhì)量。

    3.3 同一企業(yè)不同批次樣品質(zhì)量一致性分析

    由以上結(jié)果可知,A、B、D 3家企業(yè)內(nèi)樣品質(zhì)量一致性較好,而C企業(yè)內(nèi)樣品批次間一致性較差,將其指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA,模型擬合后共提取2個主成分,累積方差貢獻(xiàn)率為82.1%,將6 批樣品明顯沿PC1分成了兩類,其中S8、S12為一類,其余4批為一類,對分布貢獻(xiàn)較大的化合物為C4、C1、C2,其中C4 來源于黃柏,C1 來源于梔子,C2 來源于黃芩,S8、S12中3個化合物的相對含量均明顯低于其他批次,提示C 企業(yè)黃柏和黃芩原料的質(zhì)量不穩(wěn)定,建議重點關(guān)注。

    建立以質(zhì)量一致性為核心的中成藥質(zhì)量評價體系有利于促進(jìn)中成藥質(zhì)量的全面提升。本研究所建立的四季三黃片UPLC 指紋圖譜結(jié)合模式識別分析的方法可對四季三黃片的質(zhì)量一致性進(jìn)行評價,可為全面提升該產(chǎn)品質(zhì)量提供參考。

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