史紫娟,曾杉,林碧珊,高永堅(jiān),劉勇,梁思韻,區(qū)淑蘊(yùn)
國藥集團(tuán) 廣東環(huán)球制藥有限公司,廣東 佛山 528305
地骨皮為茄科植物枸杞Lycium chinenseMill.或?qū)幭蔫坭絃.barbarumL.的干燥根皮,具有涼血除蒸、清肺降火之功效,用于陰虛潮熱、骨蒸盜汗、肺熱咳嗽等癥[1]。地骨皮含有生物堿、黃酮、蒽醌及有機(jī)酸等多種化學(xué)成分,其中生物堿類主要有地骨皮甲素和地骨皮乙素等[2-3]。地骨皮甲素和地骨皮乙素屬于酚酰胺類,是地骨皮中的特有成分,也是其主要的藥效成分?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,地骨皮具有降血壓、調(diào)血脂、降血糖、抑菌抗炎、免疫調(diào)節(jié)、解熱鎮(zhèn)痛等作用[4-5]。本研究參考《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》中地骨皮的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[6],以地骨皮乙素為定量指標(biāo),采用超高效液相色譜法(UPLC)測定地骨皮藥材、飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑中地骨皮乙素的含量,對地骨皮藥材進(jìn)行質(zhì)量控制。
中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為中藥配方顆粒臨床療效的標(biāo)準(zhǔn)參照物,在《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》等文件中明確要求有關(guān)中藥配方顆粒的所有研究均應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行對比研究[7-9]。因此,本研究建立地骨皮藥材-飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑的UPLC特征圖譜及有效成分的定量檢測方法,深入開展藥材-飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相關(guān)性分析,為地骨皮的質(zhì)量控制及中藥配方顆粒和經(jīng)典名方的研究提供參考。
H-Class型UPLC儀(美國Waters公司);XPR105 DR 型天平、AL104 型天平(瑞士Mettler-Toledo 公司);KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);FTS-40F 型陶瓷保健壺(潮州市一壺百飲電器實(shí)業(yè)有限公司);TRL-0.5 型真空冷凍干燥機(jī)(大連雙瑞科技有限公司);Synergy UV 型超純水儀(美國Millipore公司)。
對照品地骨皮甲素(批號(hào):DST170724-101,純度≥96%)、地骨皮乙素(批號(hào):DST170724-105,純度≥98%)均購自成都德思特生物技術(shù)有限公司;甲醇和乙腈(美國BCR 公司,色譜純);甲酸、磷酸、三氟乙酸(Aladdin 公司,色譜純);水為超純水。
18 批地骨皮藥材分別產(chǎn)自陜西、河南、山西、寧夏等地,經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為茄科植物枸杞Lycium chinenseMill.的干燥根皮,按《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020 年版標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)全部合格,并參考其地骨皮項(xiàng)下炮制方法制成地骨皮飲片[1]。具體炮制方法:除去泥沙、異物及殘留木心等雜質(zhì),噴淋10 s,于烘箱60 ℃干燥2 h。藥材產(chǎn)地分別為陜西省渭南市(S1~S3)、河南省洛陽市(S4~S6)、山西省運(yùn)城市(S7~S12)、寧夏固原市(S13~S15)、寧夏銀川市(S16~S18)。
取地骨皮飲片100 g,加水煎煮2 次,一煎加10 倍量水浸泡30 min,加熱25 min,用350 目篩趁熱濾過;二煎藥渣再加8 倍量水,加熱20 min,趁熱濾過,合并2 次濾液。減壓濃縮至150 g 左右的浸膏,即得地骨皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑。浸膏加水稀釋至含固率約15%,再進(jìn)行冷凍干燥,即得地骨皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉。
2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),流動(dòng)相為甲醇(A)-0.15%三氟乙酸水溶液(B),洗脫梯度(0~5 min,8%~14%A;5~14 min,14%~25%A;14~23 min,25%~50%A;23~26 min,50%~90%A);檢測波長為280 nm;柱溫為40 ℃;流速為0.25mL·min-1,進(jìn)樣量為1μL。理論板數(shù)按地骨皮乙素峰計(jì)算應(yīng)不低于10 000。
2.2.3 藥材和飲片供試品溶液的制備 取本品粉末約0.2 g,精密稱定,置25 mL 量瓶中,加入甲醇-0.5%乙酸溶液(1∶1)的混合溶液適量,超聲處理(500 W,40 kHz)30 min,放冷,用甲醇-0.5%乙酸溶液(1∶1)的混合溶液定容至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液的制備 取本品凍干粉約0.1 g,精密稱定,與2.2.3 項(xiàng)下“置25 mL 量瓶中”后相同操作,取續(xù)濾液,即得。
2.2.5 方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn):取地骨皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6 次,結(jié)果各特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 均小于2%,表明儀器精密度良好。
重復(fù)性試驗(yàn):取地骨皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉,平行制備6 份供試品溶液進(jìn)樣測定,結(jié)果各特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 均小于3%,表明該方法重復(fù)性良好。
穩(wěn)定性試驗(yàn):取地骨皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液,分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測定,結(jié)果各特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 均小于3%,表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。
2.2.6 樣品測定 按2.2.3 和2.2.4 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件分別對18 批地骨皮藥材、飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行測定,記錄色譜圖,見圖1~3。
圖1 18批地骨皮藥材UPLC特征圖譜
圖2 18批地骨皮飲片UPLC特征圖譜
圖3 18批地骨皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC特征圖譜
2.2.7 共有峰的標(biāo)定 將各批地骨皮藥材、飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑所得結(jié)果分別導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”(2012版),設(shè)參照圖譜、對色譜圖進(jìn)行多點(diǎn)校正、峰匹配,采用平均數(shù)法生成多批樣品的特征圖譜與對照特征圖譜。選擇分離度較好、峰面積穩(wěn)定的色譜峰作為共有峰,最終藥材、飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑分別各確定了5個(gè)共有峰,見圖1~3。通過對照品指認(rèn)了2 個(gè)特征峰,其中2 號(hào)峰為地骨皮乙素、3 號(hào)峰為地骨皮甲素,見圖4。地骨皮藥材、飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑對照特征圖譜見圖5。以峰2(地骨皮乙素)為參照峰,分別計(jì)算地骨皮藥材、飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑中各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積,結(jié)果見表1。結(jié)果表明,不同產(chǎn)地的藥材物質(zhì)群接近,炮制不會(huì)對物質(zhì)群造成太大改變。
表1 地骨皮藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC特征圖譜分析(, n=18)
表1 地骨皮藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC特征圖譜分析(, n=18)
圖4 地骨皮乙素、地骨皮甲素對照品溶液的UPLC圖
圖5 地骨皮藥材、飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑對照特征圖譜
2.2.8 相關(guān)性分析 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”(2012 版),對各批供試品特征圖譜與對照圖譜進(jìn)行比較,分別計(jì)算18 批地骨皮藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相似度,結(jié)果見表2。18 批地骨皮藥材與對照特征圖譜的相似度為0.951~0.994,飲片相似度為0.942~0.991,標(biāo)準(zhǔn)湯劑相似度為0.978~0.999。說明不同來源的地骨皮藥材和飲片主成分具有較好的一致性。所標(biāo)定5 個(gè)共有特征峰經(jīng)多批次產(chǎn)品驗(yàn)證,各峰均可在標(biāo)準(zhǔn)湯劑、藥材和飲片特征圖譜中得到追蹤,表明地骨皮從藥材到標(biāo)準(zhǔn)湯劑過程中各成分得到了有效的轉(zhuǎn)移。
從各元素的沸點(diǎn)可知,由鐵到砷揮發(fā)率越來越大,所以控制適當(dāng)?shù)恼婵斩群蜏囟?,鉛、鉍、砷、銻能以氣態(tài)揮發(fā)出來,而鐵、銅則留在錫液中。
表2 18批地骨皮藥材、飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相似度
《中國藥典》2020 年版地骨皮藥材及飲片均沒有相應(yīng)的含量測定項(xiàng),本研究參考《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》中地骨皮的含量測定項(xiàng)方法[6],采用UPLC 同時(shí)建立了地骨皮藥材、飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑中地骨皮乙素的含量測定方法,可為制定地骨皮配方顆粒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。
2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 同2.2.1項(xiàng)下方法。
2.3.2 對照品溶液的制備 取地骨皮乙素對照品適量,精密稱定,加甲醇-0.5%乙酸溶液(1∶1)的混合水溶液制成質(zhì)量濃度為120 μg·mL-1的對照品溶液。
2.3.3 供試品溶液的制備 地骨皮藥材和飲片供試品溶液的制備同2.2.3 項(xiàng)下方法,標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液的制備同2.2.4項(xiàng)下方法。
2.3.4 方法學(xué)考察
2.3.4.1 線性關(guān)系考察 精密稱取地骨皮乙素對照品20.03 mg,置25 mL量瓶中,加甲醇-0.5%乙酸溶液(1∶1)的混合水溶液溶解并定容至刻度,作為對照品儲(chǔ)備溶液。分別精密量取上述儲(chǔ)備液稀釋成質(zhì)量濃度分別為25.04、50.08、100.15、200.30、400.60、801.20 μg·mL-1的對照溶液,按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定,記錄色譜峰面積。以地骨皮乙素的峰面積為縱坐標(biāo)(Y),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:Y=1 480.247X+4 499.614(r=1.000),表明25.04~801.20 μg·mL-1時(shí),地骨皮乙素質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好。
2.3.4.2 精密度試驗(yàn) 取地骨皮乙素對照品溶液,按2.3.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算地骨皮乙素峰面積的RSD為0.2%,表明儀器精密度良好。
2.3.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取地骨皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑約0.1 g,精密稱定,按2.3.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,精密吸取供試品溶液,按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件,分別在0、2、4、6、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣,計(jì)算地骨皮乙素峰面積的RSD 為0.4%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.3.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取地骨皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑約0.1 g,精密稱定,按2.3.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,精密吸取供試品溶液,按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件測定,測定供試品溶液中地骨皮乙素含量并計(jì)算RSD為0.9%,表明該方法重復(fù)性良好。
2.3.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批已知含量的地骨皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑約50 mg,平行稱取6 份,精密稱定,置25 mL 具塞錐形瓶中,分別按1∶1 加入地骨皮乙素對照溶液,按2.3.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,精密吸取供試品溶液,按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件測定,結(jié)果地骨皮乙素的平均回收率為101.6%,RSD 為0.8%。
2.3.5 地骨皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率測定 將18 批地骨皮飲片按2.1 項(xiàng)下方法制備成標(biāo)準(zhǔn)湯劑,測定樣品的出膏率,按公式(1)計(jì)算出膏率。
2.3.6 地骨皮藥材、飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品測定根據(jù)已建立的含量測定方法對18 批地骨皮藥材、飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行定量測定并計(jì)算飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑的轉(zhuǎn)移率,結(jié)果見表3。結(jié)果表明18 批地骨皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率為10.22%~14.34%,均值為12.89%,地骨皮乙素的轉(zhuǎn)移率為33.63%~56.82%,均值為44.84%;按照均值的70%~130%計(jì)算地骨皮乙素的轉(zhuǎn)移率為31.39%~58.29%,18 批地骨皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的轉(zhuǎn)移率均在此范圍內(nèi),未出現(xiàn)離散數(shù)據(jù)。
表3 地骨皮藥材、飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑測定結(jié)果 %
本研究參考《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》中地骨皮藥材的特征圖譜方法[6],對檢測波長、流動(dòng)相、色譜柱、柱溫、流速等系統(tǒng)適應(yīng)性條件進(jìn)行優(yōu)化,通過全波長掃描確定280 nm 下色譜圖基線平穩(wěn)、分離度較好,色譜峰信息更多且響應(yīng)值較高,故選擇280 nm 作為特征圖譜的檢測波長。考察了不同體系流動(dòng)相甲醇-0.15%三氟乙酸水溶液、乙腈-0.15%三氟乙酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液對特征圖譜的影響,結(jié)合分離度和峰形選擇甲醇-0.15%三氟乙酸水溶液作為流動(dòng)相體系。比較了3種不同類型色譜柱Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、YMC Triart C18(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)、WatersCSH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)的分離效果,最終選擇Waters BEH C18色譜柱??紤]到柱溫和流速會(huì)影響分離度,所以考察了20、30、40 ℃的柱溫,確認(rèn)40 ℃柱溫時(shí)分離度最佳??疾炝?.20、0.25、0.30 mL·min-1的流速,結(jié)果流速為0.25 mL·min-1時(shí),各特征峰的分離度及峰形更優(yōu)。
本研究考察了不同溶劑[甲醇、50%甲醇、甲醇-0.5%乙酸溶液(1∶1)的混合水溶液、水]、提取方法(回流、超聲)、提取時(shí)間(20、30、40 min)對地骨皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜提取效果的影響,結(jié)果顯示,用甲醇-0.5%乙酸溶液(1∶1)的混合水溶液超聲提取30 min 時(shí)提取效果最好,特征峰的數(shù)量和響應(yīng)值最優(yōu)。
本研究制備的18 批地骨皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率為10.22%~14.34%,平均出膏率為12.89%。測定標(biāo)準(zhǔn)湯劑中地骨皮乙素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.47%~14.35%,平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.95%;地骨皮乙素從飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑的轉(zhuǎn)移率為33.63%~56.82%,平均轉(zhuǎn)移率為44.84%。本研究利用UPLC 特征圖譜、出膏率、含量測定及轉(zhuǎn)移率,對地骨皮藥材、飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行了質(zhì)量傳遞性研究,是經(jīng)典名方及中藥配方顆粒所倡導(dǎo)的研究方法,具有良好的科學(xué)性和合理性[10]。18 批地骨皮藥材、飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑的特征圖譜通過擬合共確定了5 個(gè)特征峰,通過對照品指認(rèn)了地骨皮甲素和地骨皮乙素,將多批結(jié)果導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”(2012 版)進(jìn)行計(jì)算,結(jié)果18 批地骨皮藥材、飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相似度均大于0.90,說明三者特征圖譜具有良好的相關(guān)性。地骨皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜與地骨皮藥材和飲片特征圖譜化學(xué)成分基本一致,能夠準(zhǔn)確地反映藥材-飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑之間化學(xué)成分的可追溯性。通過標(biāo)準(zhǔn)化工藝得到的地骨皮標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量穩(wěn)定,建立的特征圖譜方法和指標(biāo)性成分的定量檢測方法可同時(shí)用于地骨皮藥材、飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑的分析測定,研究結(jié)果可為地骨皮配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究及后期經(jīng)典名方的研究提供參考。