延齡草總皂苷提取純化工藝及其抗炎活性研究△

符德靜，易紅，郭鳳倩，高慧敏，李春，閆利華，王萍，斯琴，劉曉謙*，王智民*

1.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006；

2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所/中藥質(zhì)量控制技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100700

延齡草Trillium tschonoskiiMaxim.又名頭頂一顆珠、芋兒七、獅兒七等，為百合科延齡草屬植物，是著名的恩施土家族四大神藥之一[1]，也是陜西“太白七藥”之一[2]。延齡草以干燥根及根莖入藥，其味甘，性平，有小毒，具有鎮(zhèn)靜安神、活血止血、消炎鎮(zhèn)痛、解毒等功效，主治頭暈?zāi)垦?、跌打損傷、神經(jīng)衰弱、高血壓和腦震蕩后遺癥等[3-6]。延齡草中含有多種有效成分，如甾體皂苷、倍半萜苷、黃酮、多糖等[7-8]。近年來關(guān)注最多是其甾體皂苷類成分，包括偏諾皂苷、薯蕷皂苷及延齡草烯苷等[9-11]，其中重樓皂苷Ⅶ、偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（PRRG）和重樓皂苷Ⅵ均屬于偏諾皂苷，且是其中含量較高的成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，偏諾皂苷具有止血[12]、鎮(zhèn)痛抗炎[13]、抗菌[14]、抗腫瘤[15]等作用，具有明確的藥用價(jià)值。因此，本研究旨在從延齡草中富集3 個(gè)主要偏諾皂苷獲得總皂苷，為延齡草總皂苷有效部位深入的藥效評(píng)價(jià)服務(wù)。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate 3000 型高效液相色譜儀、Multiskan Go 型酶標(biāo)儀［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；N-1100 型EYELA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；HEP-100×60 型顎式破碎機(jī)（鶴壁市銀河分析儀器化工有限公司）；DET-50 型高速萬能粉碎機(jī)（溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司）；BT125D 型十萬分之一電子天平、BSA224S-CW 型萬分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）、JULABO SW22 型恒溫水浴振蕩器（優(yōu)萊博技術(shù)有限公司）；HWSY21-KP6 型電熱恒溫水浴鍋（北京長風(fēng)儀器儀表公司）；DHG-9070A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（杭州艾普儀器設(shè)備有限公司）；L530 型醫(yī)用離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；LDZX-50L-I型立式高壓蒸氣滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；3111型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；CKX41 型光學(xué)倒置顯微鏡（Olympus 公司）；MB100-2A 型微孔板恒溫振蕩器（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品重樓皂苷Ⅶ（P1，批號(hào)：DSTDC003001，純度≥98%）、PRRG（P2，批號(hào)：DSTDP005701，純度≥98%）、重樓皂苷Ⅵ（P3，批號(hào)：DSTDC002901，純度≥98%）均購自四川成都德思特生物科技有限公司；色譜甲醇、乙腈（美國Fisher 公司）；95%乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；HPD300、HPD400、HPD600 型大孔吸附樹脂（河北滄州寶恩吸附材料有限公司）；SP825l、SP700、SP70 大孔吸附樹脂（日本三菱化學(xué)公司）；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純；一氧化氮（NO）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；胎牛血清（批號(hào)：2168090RP）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號(hào)：02221008）、DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號(hào)：8121475）、0.25%胰蛋白酶（批號(hào)：2276965）均購自美國Gibco 公司；脂多糖（LPS，批號(hào)：L2880，美國Sigma 公司）；噻唑藍(lán)（MTT，北京京匯科技有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，上海麥克林生化科技有限公司）；HyClone SV30010 青鏈霉素（雙抗）混合液（美國Cytiva公司）。

延齡草藥材購自湖北巴東一零八藥材種植專業(yè)合作社，經(jīng)中國科學(xué)院昆明植物所李恒研究員鑒定為百合科延齡草屬植物延齡草Trillium tschonoskiiMaxim.的干燥根及根莖。

1.3 細(xì)胞

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

2 方法與結(jié)果

2.1 延齡草總皂苷的含量測定方法建立

2.1.1 色譜條件 參考文獻(xiàn)[16]方法對(duì)其色譜條件適當(dāng)微調(diào)，調(diào)整后的方法：Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～26 min，30%～40%A；26～45 min，40%～41%A）；檢測波長：203 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1。高效液相色譜法（HPLC）圖譜見圖1。

圖1 重樓皂苷Ⅶ、PRRG、重樓皂苷Ⅵ混合對(duì)照品和延齡草樣品的HPLC圖

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 稱取重樓皂苷Ⅶ、PRRG、重樓皂苷Ⅵ對(duì)照品適量[17]，精密稱定，加甲醇配置成質(zhì)量濃度分別為0.098 4、0.587 0、0.829 0 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 藥材含量測定用樣品：稱取延齡草根莖粉末（過50 目篩）0.5 g，精密稱定，置50 mL 錐形瓶中，加入乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。經(jīng)測定所收集的延齡草藥材的總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)以3個(gè)皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和計(jì)為4.97%?？傇碥仗崛∥飿悠罚悍Q取延齡草總皂苷提取物粉末（過80目篩）15 mg，精密稱定，甲醇定容至10 mL 即得延齡草總皂苷提取物供試品溶液。

2.1.4 線性關(guān)系考察 取2.1.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用甲醇分別稀釋1、2、10、12.5、20、25倍，配制成系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品進(jìn)樣，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）與峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到重樓皂苷Ⅶ、PRRG、重樓皂苷Ⅵ的線性回歸方程：YP1=45.358 0X+0.010 4（r=0.999 9）、YP2=55.466 0X+0.018 4（r=1.000 0）、YP3=65.624 0X+0.004 1（r=1.000 0），重樓皂苷Ⅶ、PRRG、重樓皂苷Ⅵ分別在0.004 0～0.098 4、0.023 0～0.587 0、0.033 0～0.829 0 mg·mL-1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 26.0 和GraphPad Prism 7 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（）表示，采用單因素方差分析和雙側(cè)t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 提取工藝

2.3.1 提取溶劑的單因素考察 對(duì)提取溶劑進(jìn)行單因素考察，選取50%、75%、95%乙醇為提取溶劑，料液比1∶10，提取1 h。提取溶劑為50%乙醇、75% 乙醇、95% 乙醇的提取率分別為（80.81±0.88）%、（88.25±1.47）%、（85.31±0.44）%，結(jié)果表明75%乙醇提取效果最佳。

2.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)文獻(xiàn)[18]及單因素考察結(jié)果，確定提取溶劑為75%乙醇，選取液料比（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）作為提取工藝的考察因素，以延齡草總皂苷提取率為考察指標(biāo)。稱取延齡草藥材（過50 目篩）9 份，每份20 g。因素水平及結(jié)果見表1～3。由結(jié)果可知，對(duì)延齡草總皂苷提取率影響順序?yàn)镃＞A＞B。因素A 和因素B 為不顯著因素，因素C 各水平對(duì)延齡草總皂苷的提取率影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。綜合以上結(jié)果，正交試驗(yàn)所得的最優(yōu)工藝為A3B2C3，即75%乙醇，液料比為12∶1，提取3 次，每次90 min?？紤]液料比對(duì)提取率影響不大，從節(jié)約溶劑的角度，調(diào)整液料比為10∶1；隨著提取次數(shù)的增加，提取率逐漸增大，但提取2次和提取3次時(shí)延齡草總皂苷提取率增加不明顯，且提取次數(shù)的增加會(huì)導(dǎo)致能耗增加，故將提取次數(shù)調(diào)整為2 次，即最優(yōu)工藝為以75%乙醇為提取溶劑，按液料比10∶1 加入提取溶劑，加熱回流提取2次，每次1.5 h。

表1 延齡草總皂苷提取工藝正交試驗(yàn)因素水平

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按優(yōu)選的最佳提取工藝進(jìn)3 批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，延齡草總皂苷提取率分別為88.57%、87.72%、89.44%，均值為88.58%，3 批結(jié)果較為一致，表明此工藝條件穩(wěn)定可行。

2.4 大孔樹脂純化富集工藝

2.4.1 提取液的制備 取延齡草根莖粉末100 g，按最佳工藝進(jìn)行提取，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，生藥質(zhì)量濃度為0.1 g·mL-1即為延齡草提取液。

2.4.2 大孔樹脂型號(hào)篩選 稱取經(jīng)預(yù)處理后各型號(hào)（HPD300、HPD400、HPD600、SP70、SP700、SP825l）大孔吸附樹脂各2 g，置100 mL具塞錐形瓶中，分別加入延齡草提取液50 mL（揮至無醇味后，加水定容至藥液質(zhì)量濃度為0.1 g·mL-1），于恒溫水浴振蕩器（25 ℃、120 r·min-1）中持續(xù)振蕩24 h 使其達(dá)到吸附平衡，濾過，取濾液定容至100 mL，得吸附后的溶液，測定溶液中3個(gè)主要皂苷的含量，計(jì)算得到各型號(hào)樹脂的靜態(tài)吸附量和吸附率。將達(dá)到飽和吸附的各型號(hào)樹脂濾出后分別另置100 mL 錐形瓶中，各加入95%乙醇50 mL，在相同條件下恒溫振蕩24 h，進(jìn)行解吸附，濾過，濾液定容至100 mL，得解吸后的溶液，測定延齡草總皂苷含量，計(jì)算各型號(hào)樹脂的解吸率和轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表4。綜合各型號(hào)樹脂的靜態(tài)吸附數(shù)據(jù)，以轉(zhuǎn)移率［按公式（1）計(jì)算］為綜合評(píng)分指標(biāo)，SP700和HPD400型樹脂轉(zhuǎn)移率均較高，鑒于樹脂價(jià)格考量，選擇HPD400 型樹脂進(jìn)行純化。

特殊地，當(dāng)部件任務(wù)ti,,tk可并行執(zhí)行時(shí)，將其視為一個(gè)虛擬任務(wù)tg，tg=ti∪∪tk。根據(jù)式(24)和定義2，若數(shù)據(jù)快照為tg對(duì)應(yīng)的信息，則將任務(wù)對(duì)應(yīng)的物料、工藝、質(zhì)量節(jié)點(diǎn)關(guān)聯(lián)起來，有

表2 延齡草總皂苷提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表3 延齡草總皂苷提取工藝正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

表4 各型號(hào)樹脂延齡草皂苷的靜態(tài)吸附率、解吸率及轉(zhuǎn)移率結(jié)果 %

2.4.3 上樣量和上樣流速的考察 量取5 份經(jīng)預(yù)處理的HPD400 型大孔樹脂30 mL，分別裝于5 根色譜柱（內(nèi)徑1.5 cm，高35 cm，樹脂徑高比約1∶10）中，分別以1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 BV·h-1流速進(jìn)行上樣，分段收集流出液，每個(gè)柱體積為1 個(gè)流分，共收集10 BV，測定各上樣流出液中延齡草總皂苷的含量，并繪制泄漏曲線。由圖2可知，以1 BV·h-1流速上樣總皂苷泄漏點(diǎn)出現(xiàn)最晚，表明其吸附量最多，因此選擇1 BV·h-1為上樣流速。此時(shí)上樣體積為5 BV時(shí)，即折合生藥量15 g時(shí)開始出現(xiàn)泄漏，說明樹脂已經(jīng)達(dá)到吸附飽和，因此最大上樣量定為藥材-樹脂（1∶2），藥液質(zhì)量濃度為0.1 g·mL-1。

圖2 延齡草總皂苷泄漏曲線

2.4.4 洗脫溶劑的考察 取HPD400 型大孔樹脂30 mL，裝于色譜柱中，以1 BV·h-1流速進(jìn)行上樣，上樣量為150 mL 藥液［質(zhì)量濃度為0.1 g·mL-1（生藥）］。上樣吸附完成后，依次用水、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇洗脫，收集洗脫液，洗脫溶劑用量均為3 BV，再分別用6 BV 的50%、60%、70%、95%乙醇進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液。每個(gè)柱體積為1 個(gè)流分，測定各流分中延齡草總皂苷的含量及浸膏含量。由圖3 結(jié)果可知，總皂苷主要集中在50%～70%乙醇洗脫部位，3 個(gè)部位總皂苷洗脫率之和達(dá)90%以上，由表5 可知，以50%乙醇及60%乙醇部位含量較高，為保證總皂苷收率，最終純化工藝定為上樣完畢后，以20%乙醇洗脫除去雜質(zhì)，再用70%乙醇洗脫，收集洗脫液。

表5 各洗脫部位延齡草總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)及浸膏量

圖3 各洗脫部位延齡草總皂苷的洗脫率變化

2.4.5 洗脫流速和洗脫體積的考察 量取3份HPD400型大孔樹脂30 mL，裝于色譜柱中，以1 BV·h-1流速進(jìn)行上樣，上樣量為生藥（g）∶樹脂（mL）為1∶2。上樣吸附完成后，用3 BV 的20%乙醇洗脫，除去雜質(zhì)，收集70%乙醇洗脫部位，共收集10 BV，洗脫流速分別為1、2、3 BV·h-1流速，分段收集洗脫液，每1 BV（30 mL）為1 個(gè)流分，共收集10 份，測定各流分中延齡草總皂苷的含量，計(jì)算洗脫率。由圖4 可知，當(dāng)洗脫溶劑用量達(dá)5 BV 時(shí)各組樣品的總皂苷均基本洗脫完全，因此洗脫劑用量定為5 BV。為節(jié)約時(shí)間和提高洗脫效率，洗脫流速定為3 BV·h-1。

圖4 不同流速下延齡草各流分的洗脫率變化

2.4.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及中試放大試驗(yàn) 按優(yōu)化的純化工藝進(jìn)行放大10 倍驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，延齡草總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35.16%，收率為8.04%，說明該純化工藝穩(wěn)定可行。開展了50 kg級(jí)的中試放大試驗(yàn)，結(jié)果與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基本一致，20%乙醇洗脫部位幾乎不含皂苷成分，說明能夠?qū)⒂行Р课槐Ａ羟页羝渌s質(zhì)；70%乙醇洗脫部位延齡草總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為34.29%，收率為7.42%。逐級(jí)放大實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室工藝一致，表明工藝具備放大的可行性，方法穩(wěn)定、可控。

2.5 延齡草總皂苷提取物的抗炎活性

2.5.1 樣品的制備 取延齡草醇提物（CT，收率為38.10%，總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.10%）及樹脂純化物（CH，收率為7.42%，總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為34.29%），分別精密稱取上述2 種提取物適量，用DMSO 溶解，配制成質(zhì)量濃度為100 mg·mL-1的儲(chǔ)備液，于冰箱4 ℃保存（實(shí)驗(yàn)時(shí)用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)液稀釋成不同的質(zhì)量濃度，DMSO終體積分?jǐn)?shù)不超過0.1%）。

2.5.2 MTT 法檢測細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7 細(xì)胞，按細(xì)胞密度1×105個(gè)/mL，每孔100 μL 接種于96孔板中，分為空白組和實(shí)驗(yàn)組，于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入用完全培養(yǎng)基配制好的不同質(zhì)量濃度（50.00、25.00、10.00、5.00、1.00、0.50、0.10、0.05 μg·mL-1）的CH和CT藥液10 μL，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入等體積完全培養(yǎng)基，隨后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。給藥孵育后，每孔中加入MTT 10 μL（避光加入），置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min 溶解結(jié)晶，置于酶標(biāo)儀中，在570 nm 波長[19-21]下測定吸光度（A）值，按公式（2）計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＞90%可認(rèn)為無細(xì)胞毒性，圖5 結(jié)果表明，CT 組在25.00～0.05 μg·mL-1與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h 無明顯毒性，CH 組在5.00～0.05 μg·mL-1與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h 無明顯毒性，因此兩組可分別在無細(xì)胞毒性的質(zhì)量濃度下進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

圖5 延齡草CH和CT對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響（,n=3）

由圖6可知，與空白組相比，LPS模型組能顯著增加NO的釋放量，說明LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型制備成功。與LPS模型組相比，CT組僅在25 μg·mL-1的質(zhì)量濃度下對(duì)NO的釋放表現(xiàn)出明顯的抑制作用（P＜0.000 1）；CH組在5.00、1.00 μg·mL-1的質(zhì)量濃度下均對(duì)NO 的分泌有顯著的抑制作用（P＜0.000 1，P＜0.05）。延齡草CT 得率為38.10%，延齡草CH 得率為7.42%，說明經(jīng)樹脂純化后，其抗炎效果明顯提升。

圖6 延齡草CH和CT對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響（, n=5）

3 討論

LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生多種炎癥細(xì)胞因子，是經(jīng)典的篩選抗炎藥物的炎癥模型，被廣泛用于藥物體外抗炎研究。NO是各種炎癥介質(zhì)之一，參與介導(dǎo)細(xì)胞免疫和炎癥毒性反應(yīng)，在調(diào)節(jié)多種生理功能方面起重要作用，如擴(kuò)張血管、神經(jīng)傳遞和炎癥應(yīng)答等。以LPS激活RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥信號(hào)通路，在細(xì)胞培養(yǎng)液中釋放產(chǎn)生大量NO，加劇炎癥反應(yīng)，此時(shí)通過藥物進(jìn)行干預(yù)，NO濃度的變化可以用來評(píng)價(jià)藥物抑制炎癥反應(yīng)的強(qiáng)弱。CH和CT均可抑制LPS誘導(dǎo)的NO 的釋放，在1.00～5.00 μg·mL-1藥物質(zhì)量濃度，CH組的抑制作用呈劑量依賴性，可顯著抑制NO 的釋放，其IC50值為3.79 μg·mL-1，而CT 組的IC50值為20.68 μg·mL-1，其效果與純化前相比明顯提升。

在樹脂純化工藝優(yōu)化過程中，考慮到70%洗脫部位總皂苷含量仍偏低，曾嘗試將除雜溶劑的乙醇體積分?jǐn)?shù)提高至30%，但70%洗脫部位總皂苷含量并未提高，且收率反而明顯下降，故仍選擇了20%乙醇洗脫雜質(zhì)。

本研究對(duì)優(yōu)化的提取、純化工藝進(jìn)行了逐級(jí)放大工藝驗(yàn)證，證明了工藝的穩(wěn)定性、可靠性，經(jīng)提取、純化得到的延齡草總皂苷純度較高，工藝穩(wěn)定、可控。

延齡草中的偏諾皂苷含量遠(yuǎn)高于其同屬植物重樓[22-23]，兩者在傳統(tǒng)應(yīng)用習(xí)慣中也較為相似，相比重樓，延齡草作為一種量大、易得的藥材具有更為廣闊的發(fā)展前景。本研究基于延齡草皂苷確切的抗炎活性，開展適合于工業(yè)化生產(chǎn)的延齡草抗炎有效部位的提取、純化工藝研究，為推動(dòng)延齡草的發(fā)展提供支撐。