半夏軟腐病生防菌株篩選和田間應(yīng)用探究△

桂穎，蔣春號，程旭，2，王超，3，周冬梅，4，王沫，鄭穎，郭堅(jiān)華*，牛冬冬*

1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210095；

2.襄陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 襄陽 441057；

3.南京國環(huán)有機(jī)產(chǎn)品認(rèn)證中心，江蘇 南京 210042；

4.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 南京 210014；

5.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430070

半夏Pinellia ternata（Thunb.）Brei 為天南星科（Araceae）半夏屬（Pinellia）多年生單子葉草本植物，是我國重要中藥材之一[1-2]。其在我國廣泛分布于除內(nèi)蒙古、新疆、青海、西藏以外的地區(qū)，主產(chǎn)于四川、湖北、河南、貴州、安徽、江蘇等地。半夏塊莖經(jīng)炮制可入藥，性溫，味辛，具有降逆止嘔、燥濕化痰、消痞散結(jié)的功效[3]。其有種子繁殖、塊莖繁殖和珠芽繁殖3 種繁殖方式。但半夏的有性繁殖退化，結(jié)實(shí)率和種子的萌發(fā)率極低，在自然中以無性繁殖為主。塊莖的收獲源于上一生長季節(jié)中已存在的個(gè)體，不增加新的個(gè)體數(shù)，而生產(chǎn)實(shí)際中需種量大，因此，著生于葉腋、花序軸等位置繁殖系數(shù)大的珠芽成為半夏的主要繁殖器官[4-5]。

半夏具有很好的藥效和商業(yè)開發(fā)價(jià)值，也是重要的出口產(chǎn)品。近年來，國內(nèi)銷量及出口量成倍增加，而野生資源及產(chǎn)量卻不斷減少，從而使供求缺口日益擴(kuò)大。其人工栽培日益興盛，使半夏生產(chǎn)中病蟲害愈發(fā)嚴(yán)重。半夏軟腐病是半夏生長過程中主要病害之一，在全國各種植地均有發(fā)生。7月下旬至8月上旬高溫多雨，是半夏軟腐病高發(fā)時(shí)期，通常使用多菌靈、百菌清、甲基硫菌靈、毒克星等化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治。隨著化學(xué)農(nóng)藥的濫用，抗藥性、環(huán)境污染、土壤板結(jié)等問題已經(jīng)愈發(fā)嚴(yán)重。在國家倡導(dǎo)建設(shè)生態(tài)農(nóng)業(yè)、走可持續(xù)發(fā)展道路的形勢下，有必要尋找安全且能保障產(chǎn)量的半夏綠色種植方法。據(jù)中國農(nóng)藥信息網(wǎng)（http://www.chinapesticide.org.cn/hysj/index.jhtml）數(shù)據(jù)顯示，我國國內(nèi)登記用于防治軟腐病的產(chǎn)品共18 種，其中生物農(nóng)藥有4 種，均為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis制劑，主要防治對象為大白菜。因此，軟腐病的生物防治技術(shù)仍有極大的發(fā)展空間，尤其是中藥材生防產(chǎn)品的研發(fā)。

本研究從田間取樣的感病半夏中分離純化病原菌，按照科赫氏法則進(jìn)行了診斷鑒定。針對此病菌，從本課題組生防菌種質(zhì)資源庫中篩選出三菌合劑BBS；開展進(jìn)一步田間試驗(yàn)證明BBS 對半夏的促生作用及對細(xì)菌性軟腐病的防治效果，并且提高了珠芽分化率、增加了繁殖體數(shù)量、促進(jìn)了光合作用和光合產(chǎn)物的積累，從而達(dá)到提高產(chǎn)量的效果。

1 材料

1.1 樣品

本研究所用中藥材樣品由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院王沫教授鑒定為天南星科多年生草本植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Brei 的塊莖。本研究所用生防菌株為蠟質(zhì)芽孢桿菌Bacillus cereusAR156、枯草芽孢桿菌B.subtilisSM21、沙雷氏菌Serratiasp.XY21 等，均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生物農(nóng)藥及綠色植保實(shí)驗(yàn)室前期從不同作物生境分離純化并保存。

1.2 儀器

YP-3002 型電子天平（上海精密儀器儀表有限公司）；PHS-3E 型pH 計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；SPX-2508SH-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；ZQLY-180N 型振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）；BioMate 3S 型紫外分光光度計(jì)、MicroCL17 型離心機(jī)（賽默飛世爾科技公司）；eclipse E100 型顯微鏡［尼康儀器（上海）有限公司］；Avanti J-E 型離心機(jī)［貝克曼庫爾特國際貿(mào)易（上海）有限公司］；T100 型熱循環(huán)儀、PowerPac?Basic型電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 試藥

酵母提取物（批號：4252819-02）、胰蛋白胨（批號：3438287）均購于英國Oxoid 公司；氯化鈉（批號：20210923）、乙醇（批號：20220608）、次氯酸鈉（批號：20220415）、磷酸二氫鉀（批號：20150912）均為分析純，均購于廣東光華科技股份有限公司；瓊脂粉（批號：310U022）、脫脂奶粉（批號：712X052）、溴代十六烷基三甲胺（CTAB）均購于北京索萊寶科技有限公司；蛋白胨（批號：20130607，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；牛肉浸膏（批號：20131015）、葡萄糖（批號：20130903）均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；基因組DNA 試劑盒（上海賽百盛生物工程有限公司）；Platinum?Taq高保真DNA 聚合酶（賽默飛世爾科技有限公司）；磷酸二氫銨、氯化鉀、七水合硫酸鎂、三氯化鐵（Ⅲ）六水合物（純度≥99%）、1,4-哌嗪二乙磺酸（PIPES，純度≥99.5%）、剛果紅、鉻天青S均購于上海晶純生化科技股份有限公司；幾丁質(zhì)（批號：RT3545U495）、羧甲基纖維素鈉（批號：RF2017G615）均購于上海瑞永生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS，批號：C12743758，純度≥98.0%）購于上海麥克林生化科技有限公司。

2 方法

2.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

生防菌篩選小區(qū)試驗(yàn)于2011—2014 年在湖北省漢川市廟頭鎮(zhèn)七屋臺(tái)村開展，最佳施用濃度田間試驗(yàn)于2015—2016 年在同一地方進(jìn)行；2017—2018 年在湖北黃岡英山縣開展最佳用法用量試驗(yàn)；2019 年在河北省邯鄲市廣平縣勝營村開展田間推廣應(yīng)用試驗(yàn)。

2.2 菌株培養(yǎng)方法

從超低溫冰箱中取出保存菌蠟質(zhì)芽孢桿菌AR156、枯草芽孢桿菌SM21、沙雷氏菌XY21 等劃線于28 ℃下培養(yǎng)；待長出單菌落，挑取其接入盛有配制好LB 培養(yǎng)基100 mL 的250 mL 錐形瓶中，置于28 ℃搖床里培養(yǎng)18～20 h 后作為種子液；以1%的接種量將種子液接種于1 L 的大錐形瓶培養(yǎng)基里繼續(xù)于28 ℃搖床培養(yǎng)22～24 h。LB 培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g用超純水定容至1 L，調(diào)pH 至7.5。BBS 制作方法：將AR156、SM21、XY21 菌液濃度分別調(diào)終濃度為1×108CFU·mL-1、體積比1∶1∶1，混合。

2.3 半夏軟腐病的診斷和病原物的分離純化

2011 年從湖北漢川半夏試驗(yàn)田采集發(fā)病樣品，患病葉片初期出現(xiàn)水燙狀軟腐并死亡，病莖呈現(xiàn)軟腐爛狀；患病塊莖部分或全部腐爛且有臭味。取樣品病健交界處于低倍鏡下觀察是否具有噴菌現(xiàn)象。將觀察到噴菌現(xiàn)象的病健交界處的組織先用緩流自來水沖洗1 min，再于超凈工作臺(tái)中用無菌水漂洗3 次后，放到滅菌的1.5 mL 的離心管中，加入無菌水200 μL，發(fā)病組織研碎或用剪刀剪碎后浸泡15 min，讓細(xì)菌釋放到滅菌水中。滅菌接種環(huán)蘸取菌懸液，用三線法分離菌株，做好標(biāo)記后倒置培養(yǎng)皿，放在26～28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。5 d 內(nèi)連續(xù)觀察，根據(jù)菌落特征選擇目標(biāo)菌株挑單菌落，在營養(yǎng)瓊脂（NA）平板上劃線培養(yǎng)，直到所有單菌落形態(tài)一致?？商羧? 個(gè)單菌落在NA 斜面（用試管）上劃線培養(yǎng)24～48 h，4 度冰箱培養(yǎng)保存。每月繼代1 次，備用；或取純化好的菌落1 環(huán)置于含1 mL 的30%甘油的滅菌的1.5 mL 或2 mL 離心管中，振蕩混合均勻，于-70 ℃保存。NA 培養(yǎng)基配制方法：牛肉浸膏3 g、蛋白胨5 g、葡萄糖2.5 g 用超純水定容至1 L，調(diào)pH至7.0±0.1后加瓊脂粉18 g。

2.4 柯赫法則驗(yàn)證半夏軟腐病病原菌

將2.3 項(xiàng)下從發(fā)病部位分離獲得的純化培養(yǎng)物接種到LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床中過夜培養(yǎng)。采用針刺浸泡法接種細(xì)菌[6]，選取直徑為1.5 cm左右的健康塊莖，用75%乙醇浸泡1 min后，在50%次氯酸鈉加入0.1% SDS 溶液中置于搖床10 min 進(jìn)行表面消毒，用無菌水漂洗5 遍。用無菌針在塊莖表面扎10 個(gè)孔，在稀釋到1×106CFU·mL-1的菌液中浸泡5 min，置于鋪有濕潤濾紙的無菌培養(yǎng)皿中；對照組用無菌培養(yǎng)基浸泡。將培養(yǎng)皿置于28 ℃培養(yǎng)箱，每24 h 觀察1 次，約48 h可觀察到塊莖變軟，對半切開后組織軟腐潰爛。

半夏塊莖發(fā)病后，在超凈臺(tái)內(nèi)切取小塊發(fā)病組織，放入盛有無菌水1 mL 的2 mL 離心管中，切碎組織后靜置15 min，取上層液體在NA 平板上劃線培養(yǎng)，放置于28 ℃培養(yǎng)箱中，每天連續(xù)觀察菌落形態(tài)。

2.5 病原菌16S rRNA 基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增鑒定

采用基因組DNA 試劑盒提取細(xì)菌的基因組DNA 后，使用Platinum?Taq高保真DNA 聚合酶進(jìn)行16S rRNA 片段擴(kuò)增。16S rRNA 片段擴(kuò)增引物序列U8-27（F）：5'-AGAGTTTGATC（AC）TGGCTCAG-3'；L1494-1514（R）：5'-CTACGG（AG）TACCTTGTTACGAC-3'。反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+3.75 μL，dNTP 2 μL，引物P1/P2 0.6 μL，模板DNA 1 μL，rTaq酶0.5 μL，加超純水至25 μL。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃5 min；94 ℃1 min，56 ℃1 min，72 ℃2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min后至12 ℃恒溫。

2.6 半夏軟腐病生防菌篩選試驗(yàn)

2.6.1 生防菌對病原菌平板抑制活性檢測 采用平板對峙法檢測本課題組菌種庫中的生防菌對分離所得病原細(xì)菌和已獲得的常見病原菌的拮抗活性，病原指示菌為鑒定為病原物的BX23、鐮刀菌屬（Fusariumsp.），培養(yǎng)平板分別使用LB 固體培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。按參考文獻(xiàn)[7]方法，進(jìn)行3 次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，每株參試菌株設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

2.6.2 細(xì)菌水解酶活性的測定 蛋白酶活性測定：在蛋白酶平板（A：脫脂奶粉8 g，溶于水300 mL中，115 ℃滅菌10 min；B：瓊脂8 g，定容至300 mL，121 ℃滅菌20 min，A 與B 分別滅菌后混合）上接菌，30 ℃培養(yǎng)3 d后觀察有無透明圈，并記錄大小。

幾丁質(zhì)酶活性測定：將細(xì)菌在以膠體狀幾丁質(zhì)為唯一碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)（磷酸二氫銨1.0 g、氯化鉀0.2 g、水合硫酸鎂0.2 g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的膠體狀幾丁質(zhì)100 mL，瓊脂20 g，pH 為7.0），接菌后30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察有無透明圈，并記錄大小。

纖維素酶活性測定：把準(zhǔn)備好的菌株接到纖維素酶活性測定平板上（蛋白胨10 g、酵母粉10 g、羧甲基纖維素鈉10 g、氯化鈉5 g、磷酸二氫鉀1 g、瓊脂18 g，pH 為7.0），30 ℃培養(yǎng)3 d 后，用1 g·L-1的剛果紅染1 h 后，倒掉染液，再用1 mol·L-1氯化鈉溶液浸泡1 h，觀察有無透明圈，并記錄大小。

產(chǎn)嗜鐵素活性測定：A ［鉻天青S 60.5 mg溶于去離子水50 mL，三價(jià)鐵溶液（1 mmol·L-1FeCl3·6H2O，10 mmol·L-1鹽酸為溶劑）10 mL，CTAB 72.9 mg 溶于去離子水40 mL，上述3 個(gè)溶液混合定容至100 mL，pH 調(diào)至中性，121 ℃滅菌20 min］、B［PIPES 30.24 g加入水-瓊脂（WA）培養(yǎng)基900 mL，pH 為6.8，121 ℃滅菌20 min］液混合倒平板，接菌后30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察，記錄結(jié)果。WA培養(yǎng)基：瓊脂4 g，超純水補(bǔ)足100 mL。

2.6.3 潛力生防菌的賦值評估 對拮抗細(xì)菌的生防潛力進(jìn)行賦值評估，平板拮抗BX23、Fusarium.sp活性、產(chǎn)幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和蛋白酶活性各3 分，其中抑菌圈或透明圈半徑0～3 mm 賦1 分，3～6 mm賦2 分，＞6 mm 賦3 分；產(chǎn)嗜鐵素活性1 分，總分為16分。

2.6.4 生防菌篩選小區(qū)試驗(yàn) 生防菌篩選小區(qū)試驗(yàn)面積共2000 m2：每個(gè)小區(qū)規(guī)格為16.0 m×1.5 m，各處理組中間起壟20 cm 做間隔；所有田塊使用同批次半夏種苗225 g·m-2。設(shè)置處理組1～30 分別為1×107CFU·mL-1備選生防菌1～30 號處理，處理組31～33分別為相同濃度的A+X、A+S、X+S處理，處理組34～36分別為BBS和乙蒜素（ethylicin，E）、清水處理（CK），播種時(shí)種子處理（菌液濃度統(tǒng)一稀釋調(diào)節(jié)成5×107CFU·mL-1攪拌浸種10～15 min）。每個(gè)處理重復(fù)3 次。各個(gè)處理組在2013 年8 月進(jìn)行塊莖浸泡和灌根處理，在9 月下旬再次灌根處理，并于2014 年10 月收獲，期間統(tǒng)計(jì)軟腐病發(fā)病情況和產(chǎn)量。

由于BBS 前期在其他作物上的防病促生效果，正在將此菌劑開展微生物肥料登記工作，商品名“寧盾”。

2.7 半夏軟腐病有效生防菌劑的最佳濃度、用法和用量篩選小區(qū)試驗(yàn)

2.7.1 “寧盾”最佳施用濃度篩選小區(qū)試驗(yàn) 將2.6項(xiàng)下篩選出的最佳生防菌劑“寧盾”開展施用濃度篩選試驗(yàn)。每個(gè)小區(qū)規(guī)格為16.0 m×1.5 m，各處理組中間起壟20 cm間隔；所有田塊使用同批次半夏種苗225 g·m-2。設(shè)置處理組分別為1×106、1×107、1×108CFU·mL-1的“寧盾”（S6～S8）和CK，每個(gè)處理重復(fù)3 次。各個(gè)處理組在2015 年9 月進(jìn)行塊莖浸泡和灌根處理，并于2016年10月收獲，期間統(tǒng)計(jì)軟腐病發(fā)病情況和產(chǎn)量。

2.7.2 “寧盾”最佳用法用量篩選小區(qū)試驗(yàn) 每個(gè)小區(qū)規(guī)格為16.0 m×1.5 m，各處理組中間起壟20 cm做間隔；所有田塊使用同批次半夏種苗225 g·m-2?！皩幎堋卑匆韵虏煌梅ㄟM(jìn)行試驗(yàn)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。

用法1：菌液稀釋至5×107CFU·mL-1攪拌浸種10～15 min；用法2：菌原液7.5 mL·m-2，稀釋至5×107CFU·mL-1攪拌浸種10～15 min，播種后剩余菌液澆到塊莖上之后覆土；用法3：菌原液3 mL·m-2稀釋至5×107CFU·mL-1攪拌浸種10～15 min，播種后剩余菌液澆到塊莖上之后覆土；出苗后用菌原液4.5 mL·m-2以同樣濃度對根部噴淋1 次；用法4：菌原液3 mL·m-2稀釋至5×107CFU·mL-1攪拌浸種10～15 min，播種后剩余菌液澆到塊莖上之后覆土；出苗后用菌原液3 mL·m-2以同樣濃度灌根1 次；20 d 后地上部噴霧2 次，每次處理間隔15 d，每次噴霧的菌原液用量0.75 mL·m-2。常規(guī)處理：播種前使用80% E 乳油2000～2500 倍液浸種，出苗后使用多菌靈50～100 mL 和代森錳鋅25 mL，兌水15 kg噴霧3～4 次。

2.8 田間生防效果驗(yàn)證

2.8.1 試驗(yàn)地點(diǎn)、試驗(yàn)地規(guī)劃及試驗(yàn)方案 河北省邯鄲市試驗(yàn)點(diǎn)“寧盾”處理半夏面積43 300 m2，常規(guī)對照面積3333 m2；實(shí)驗(yàn)組和CK 中間起壟20 cm間隔；所有田塊使用同批次半夏種苗225 g·m-2。處理組按照上述用法4 進(jìn)行處理；常規(guī)對照種植體系以當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)種植體系為準(zhǔn)。

本研究中，除使用“寧盾”來防治病害之外，在處理組中還使用辛硫磷、苦參堿等與“寧盾”具有兼容性的化學(xué)殺蟲劑防治地下害蟲、蚜蟲等蟲害，出苗后使用稻草覆蓋防治草害，構(gòu)成了有益微生物驅(qū)動(dòng)的全程綠色種植體系（簡稱BeMMG 體系）。當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)對照體系中施用多菌靈、波爾多液或代森鋅防治軟腐病，施用吡蟲啉、噻蟲胺防治蟲害，施用精喹禾靈防治草害。

2.8.2 植物生長指標(biāo)及產(chǎn)量測定 按公式（1）計(jì)算出苗率。

半夏生長期采用五點(diǎn)取樣法，調(diào)查半夏的株高、葉片長、葉綠素和珠芽分化率。按公式（2）計(jì)算倒苗時(shí)倒苗率。

半夏收獲時(shí)挖出處理組及CK 的半夏球莖，按公式（3）使用游標(biāo)卡尺測量半夏塊莖的直徑。

除盡泥土和雜物后分別稱質(zhì)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，折算每公頃產(chǎn)量并比較球莖大小及外觀，記錄。

2.8.3 軟腐病防效統(tǒng)計(jì) 軟腐病分級按以下標(biāo)準(zhǔn)。0 級：健株無?。? 級：腐爛面積10%以下；2 級：腐爛面積10%～50%；3 級：腐爛面積50%以上；4級：全株枯死。按公式（4）～（7）分別計(jì)算病害嚴(yán)重度、防治效率、發(fā)病率和增產(chǎn)率。

3 結(jié)果

3.1 半夏軟腐病的診斷其病原物鑒定結(jié)果

健康半夏地上部通常有葉片2～5 枚，有時(shí)1 枚，幼苗葉片卵狀心形至戟形，為全緣單葉；老株三出復(fù)葉，呈橢圓形或披針形，兩頭尖銳（圖1A）；塊莖呈球形，具須根。感病半夏地上部癥狀表現(xiàn)為葉片初期出現(xiàn)水燙狀，后期表現(xiàn)軟腐并最終死亡，病莖呈腐爛狀倒伏；患病塊莖呈軟腐爛狀，其內(nèi)組織呈石灰粉粒狀，濕性腐爛且有臭味（圖1B～C）。通過柯赫氏法則驗(yàn)證了引起半夏球莖病害的病原菌，首先對發(fā)病半夏球莖進(jìn)行分離，將主要分離物BX23進(jìn)行純化培養(yǎng)，采用針刺浸泡和針刺法對健康半夏球莖進(jìn)行回接。如圖1C 所示，BX23 可造成半夏塊莖出現(xiàn)同樣的軟腐癥狀。再對BX23 處理發(fā)病球莖進(jìn)行分離，并將分離物進(jìn)行純培養(yǎng)。提取細(xì)菌的基因組DNA 后，進(jìn)行16S rRNA 基因片段擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見圖2。從回接發(fā)病的組織中分離得到菌株與BX23 測序比對結(jié)果相同。菌株的16S rRNA 基因測序表明，序列全長1509 bp，與美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）上相似序列經(jīng)基于局部比對算法的搜索工具（Blast）比對，其與胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜軟腐亞種Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorumNkyhuaya菌株（HM622348.1）、Ecc131-1菌株（FJ593031.1）、301480菌株（FJ593025.1）報(bào)告的序列相同點(diǎn)均為99%，半夏軟腐病原菌初步鑒定為胡蘿卜軟腐果膠桿菌Pectobacterium carotovorum。

圖1 半夏生長形態(tài)及軟腐病發(fā)病癥狀

圖2 半夏軟腐病病原菌16S rRNA PCR片段擴(kuò)增結(jié)果

3.2 生防菌株室內(nèi)篩選及賦值

為了比較15 種備選的生防菌對病原菌的拮抗效果，進(jìn)而從中篩選出效果最佳的生防菌進(jìn)行田間試驗(yàn)，筆者進(jìn)行平板抑制活性檢測和水解酶活性檢測，并根據(jù)抑菌圈和水解透明圈直徑對不同生防菌進(jìn)行賦值評價(jià)。如表1 所示，生防菌株AR156、SM21、XY21 具有較高的賦值。對這3 種菌株設(shè)計(jì)不同的組合，分別進(jìn)行賦值評估，結(jié)果證明AR156+SM21+XY21，即BBS組合菌劑具有最高賦值得分。

表1 參試生防菌株對半夏軟腐病病原物BX23的拮抗活性

3.3 生防菌株田間小區(qū)試驗(yàn)篩選結(jié)果

本研究于2014 年在湖北漢川通過小區(qū)試驗(yàn)來篩選對半夏軟腐病具有防治效果的生防菌，采取五點(diǎn)取樣法采集半夏地下塊莖，每重復(fù)各取面積為0.2 m2的5 點(diǎn)；各點(diǎn)半夏球莖挖出后集中在一起，清理泥土雜物后測定數(shù)據(jù)；由于田中幾乎不見發(fā)病球莖，推斷發(fā)病球莖前期已完全腐爛，在此以直徑≥1 cm 球莖的數(shù)量作為半夏細(xì)菌性軟腐病防治效果的參考數(shù)據(jù)。如表2所示，備選生防菌中，JC03菌株和AG11菌株對軟腐病防效較好，防治效率分別為58.51%和55.71%，但在相同濃度下BBS 菌劑使用效果最佳，防治效率和增產(chǎn)率分別為84.30%和35.70%。BBS中3 種有效菌株兩兩組合的效果次于三菌合劑的效果。因此，選擇BBS（其間獲得微生物肥登記，商品名為“寧盾”）用于后期試驗(yàn)中。

表2 田間小區(qū)試驗(yàn)中各處理對半夏對防病促生效果（n=5）

3.4 “寧盾”最佳濃度和用法用量的確定

為探究在節(jié)約成本的前提下哪種濃度的使用效果最佳，本研究于2016 年在湖北漢川設(shè)置了最佳施用濃度篩選試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，“寧盾”菌劑在濃度為1×107、1×108CFU·mL-1的條件下使用效果均較好，對軟腐病的防治效率分別為76%、77.67%，增產(chǎn)率分別為25.58%、25.00%（表3）。從節(jié)約成本的角度考慮，建議選擇1×107CFU·mL-1為施用濃度，即原液稀釋約200倍。

表3 2016年各濃度BBS菌劑處理對半夏防病效果和增產(chǎn)效果（n=5）

為了確定“寧盾”最佳使用方案，于2018 年在湖北英山開展最佳用法用量篩選小區(qū)試驗(yàn)，設(shè)計(jì)了4種處理方法。試驗(yàn)結(jié)果表明在相同的用量下，以方法4為最佳用法，即“寧盾”菌劑以1×107CFU·mL-1的濃度對半夏浸種后澆灌，并在出苗后的不同時(shí)期進(jìn)行灌根和葉面噴霧處理，防治半夏軟腐病效果達(dá)到83.2%、增產(chǎn)29.89%（表4）。說明半夏軟腐病菌在種植全程均可侵染，將微生物菌劑分成多次施用可取得更好的防病、促生效果。

表4 不同處理對半夏的防病促生效果（n=5）

3.5 大田試驗(yàn)中“寧盾”對半夏軟腐病的防治效果

2013 年，BBS 登記為微生物肥［登記證號：微生物肥〔2013〕準(zhǔn)字（1096）號］，商品名為“寧盾”。在2019 年于河北邯鄲開展半夏全程綠色種植試驗(yàn)時(shí)，“寧盾”能顯著降低半夏軟腐病的發(fā)生。“寧盾”處理組的軟腐病發(fā)病率和病害嚴(yán)重度分別為6.7%、3.0%，而CK 為46.7%和26.7%，“寧盾”處理對半夏軟腐病的防治效率為88.7%，該結(jié)果與上述篩選試驗(yàn)結(jié)果一致?？傮w來看，處理組的防治效果明顯高于CK，證明生防菌劑“寧盾”能有效防治半夏軟腐病。

3.6 田間試驗(yàn)中“寧盾”對半夏的促生效果

田間試驗(yàn)結(jié)果證明，“寧盾”對半夏具有良好的促進(jìn)生長效果。如圖3 所示，與CK 相比，“寧盾”處理后98 d 植株出苗率和存活率更高，地上部生長也更茂密，葉片更大更綠，株高較高。移栽后98 d通過五點(diǎn)取樣法，測量各處理中半夏各項(xiàng)生長指標(biāo)。如表5 所示，與CK 相比，“寧盾”處理組的半夏在株高、葉片長和珠芽分化率上均有不同程度提高。其中，出苗率、珠芽分化率和分蘗數(shù)分別增加52.8%、65.7%和19.2%，表明施用“寧盾”能促進(jìn)半夏地上部生長，特別是對珠芽的分化的促進(jìn)作用顯著。珠芽作為半夏主要繁殖器官，因此推測“寧盾”處理可以加大半夏繁殖基數(shù)，在生產(chǎn)實(shí)踐中提高半夏產(chǎn)量。

表5 “寧盾”處理98 d對半夏的促生效果（n=100）

圖3 “寧盾”處理98 d后對半夏的田間促生效果

從邯鄲試驗(yàn)點(diǎn)的產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看，“寧盾”處理240 d 后半夏塊莖平均直徑為1.61 cm，產(chǎn)量達(dá)7650 kg·hm-2；而CK 平均直徑為1.49 cm，產(chǎn)量為6300 kg·hm-2。在相同投量下，“寧盾”處理使產(chǎn)量提高21.43%。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，“寧盾”確實(shí)能夠促進(jìn)光合作用和光合產(chǎn)物積累、增加繁殖體數(shù)量，進(jìn)而提高半夏的產(chǎn)量。

4 討論

半夏軟腐病主要為害葉、莖和塊莖。癥狀表現(xiàn)為患病葉片，初期出現(xiàn)水燙狀軟腐并死亡，病莖呈軟腐爛狀；患病塊莖迅速部分或全部腐爛且有臭味。高溫高濕和通風(fēng)不良是發(fā)病的主要條件，因此做好排水工作十分重要。在常規(guī)種植體系中，防治軟腐病的藥劑有：50%氯溴異氰尿酸WP（消菌靈）、0.3%四霉素AS、3%中生霉素WP（橫掃殲菌）、20%噻森銅SC、青枯立克、25%大蒜素WP 等，但化學(xué)藥劑之間不宜隨意混用，使用不當(dāng)容易造成藥害。另外，廣譜殺菌劑不僅對病原菌起作用，還可能影響其他有益微生物，破壞土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。因此，急需有效、安全、可靠的生物防治方式來控制這一病害。

據(jù)中國農(nóng)藥信息網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，我國國內(nèi)登記用于防治軟腐病的產(chǎn)品共18 種，其中生物農(nóng)藥有4種，均為防治大白菜軟腐病的枯草芽孢桿菌B.subtilis。根據(jù)美國國家農(nóng)藥通訊網(wǎng)（National Pesticide Information Center）產(chǎn)品在線搜索網(wǎng)站（http://npic.orst.edu/NPRO/#）記錄，目前投入使用的防治細(xì)菌性軟腐病的產(chǎn)品共200 種，其中生防菌產(chǎn)品有21種，為解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens和枯草芽孢桿菌B.subtilis產(chǎn)品，但防治草藥病害的生防產(chǎn)品寥寥無幾。由此可見，目前國內(nèi)外已產(chǎn)業(yè)化防治軟腐病的生防產(chǎn)品組成單一，具有田間防效不穩(wěn)定的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是中藥材軟腐病及其生物防治產(chǎn)品仍有巨大發(fā)展空間。

細(xì)菌性軟腐病可由多種革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌引起，其中Dickeyaspp.和Pectobacteriumspp.是研究最為廣泛的軟腐病病原菌[8]。D.zeae在香蕉上引起香蕉細(xì)菌性軟腐病，造成葉片萎蔫、假莖塌陷和異味[9]。Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum（Pcc）可以造成大白菜、馬鈴薯及天南星科中藥材大角蓮Typhonium giganteum軟腐病[10-12]。有報(bào)道，研究人員鑒定了浙江蕭山和湖北京山縣發(fā)病半夏中病原物為Pcc[13-14]，本研究證明了引起湖北漢川地區(qū)半夏軟腐病的病原菌為Pectobacterium carotovorum。在生物防治方面，研究表明解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens菌株對馬鈴薯軟腐病菌Pectobacterium carotovorum菌株Ⅱ16 具有拮抗作用[15]，B.amyloliquefaciensKC-1能有效防治Pcc引起的大白菜軟腐病[10]。Maciag等[16]開發(fā)了由5 種生防菌株（S.plymuthicaA294、Enterobacter amnigenusA167、Rahnella aquatilisH145、S.rubidaeaH440和S.rubidaeaH469）制成的粉劑配方可顯著降低馬鈴薯塊莖的軟腐病嚴(yán)重度和發(fā)病率。這些結(jié)果表明，生防菌株組合可作為一種軟腐病防治策略。

通過多角度賦值和小區(qū)篩選試驗(yàn)，本研究比較了15 種備選生防菌的生防效果，篩選獲得由蠟質(zhì)芽孢桿菌B.cereusAR156、枯草芽孢桿菌B.subtilisSM21、沙雷氏菌S.sp.XY21組成的“寧盾”。本課題組前期在湖北省孝感市開展的中藥材茅蒼術(shù)生防試驗(yàn)中篩選出“寧盾”對茅蒼術(shù)軟腐病防效最佳灌根濃度為75 L·hm-2[17]，并發(fā)現(xiàn)在該濃度使用“寧盾”對扁豆進(jìn)行灌根有增產(chǎn)作用和作物品質(zhì)改良作用[18]。沈建華等[19]研究結(jié)果表明，微生物菌劑“菌刀”通過灌根處理加葉面噴施處理的施用方法在“陽光玫瑰”葡萄上效果最好；另有研究表明，土壤消毒與塊莖處理結(jié)合的方法防治半夏塊莖腐爛病效果顯著[20]。根據(jù)半夏軟腐病多發(fā)生在高溫多濕季節(jié)和越夏種莖儲(chǔ)藏期間，首先半夏塊莖發(fā)生腐爛，后蔓延到地上部分，最后黃倒苗而死亡的特點(diǎn)[21]。本研究確定了“寧盾”最佳使用方法為“浸種+灌根+噴淋+噴霧”及其最佳使用濃度為1×107CFU·mL-1。半夏軟腐病菌可在土壤和病殘?bào)w中越冬，環(huán)境條件適宜時(shí)可隨雨水、灌溉水、昆蟲、肥料、土壤等多種途徑傳播蔓延，因此半夏軟腐病可在生長周期內(nèi)全程侵染，7月下旬至8月上旬高溫多雨，是病害高發(fā)生時(shí)期[21]；半夏種植土壤沙性較強(qiáng)，便于采收挖掘塊莖，但不利于微生物的快速定殖，這也許可以解釋為什么微生物菌劑分成多次施用效果更佳。

與CK 相比，“寧盾”處理組的半夏在株高、葉片長、分蘗數(shù)和珠芽分化率上均有提高。珠芽多著生于葉腋，可用來繁殖或入藥，多認(rèn)為是腋芽形成的地上變態(tài)莖或腋芽變態(tài)，也稱為“小塊莖”“珠芽”“地上塊莖”[22]。因此，推測“寧盾”處理可以促進(jìn)地上部塊莖的分化，從而提高半夏繁殖用種量，在生產(chǎn)實(shí)踐中提高半夏的種植產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)，“寧盾”處理組的半夏倒苗期相對推遲的現(xiàn)象，地下部塊莖的生長期延長亦可增加半夏產(chǎn)量。而收獲期測產(chǎn)結(jié)果表明，“寧盾”處理組收獲的半夏塊莖直徑和產(chǎn)量均顯著高于CK，證實(shí)了“寧盾”能夠增加繁殖體數(shù)量，促進(jìn)光合作用和光合產(chǎn)物積累，從而達(dá)到提高產(chǎn)量的效果。本研究鑒定了半夏軟腐病菌為Pectobacterium carotovorum，發(fā)現(xiàn)“寧盾”對半夏軟腐病具有良好的防治效果并能提高半夏品相與產(chǎn)量，為軟腐病的生物防治和該生防菌劑的產(chǎn)業(yè)化可行性提供依據(jù)。