《中華人民共和國藥典》2020年版收載何首烏和制何首烏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)【鑒別】項的商榷△

王雪婷，楊建波，程顯隆，汪祺，高慧宇，宋云飛，王瑩，魏鋒，馬雙成

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

何首烏為《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版收載品種，為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorumThumb.的干燥塊根，于秋、冬兩季葉枯萎時采挖，削去兩端，洗凈，個大的切成塊，干燥，具有解毒、消癰、截瘧、潤腸通便的功效[1]。制首烏為何首烏的炮制加工品，具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨、化濁調(diào)脂的作用，臨床可用于血虛萎黃、眩暈耳鳴、須發(fā)早白、腰膝酸軟、肢體麻木、崩漏帶下、高脂血癥[1]。何首烏中主要的活性成分為2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、蒽醌（結(jié)合蒽醌和游離蒽醌）、黃酮、萘、酰胺等類成分，但是這些不同類型化合物極性差別較大[2-5]?！吨袊幍洹?020 年版何首烏和制首烏項下【鑒別】項中的供試品溶液制備方式采用加熱回流提取，操作復(fù)雜、費(fèi)時費(fèi)力；薄層鑒別方法采用三氯甲烷-甲醇為展開劑，毒性較大，展開后主斑點數(shù)較少，分離度相對較差，且需要二次展開，操作較為繁瑣。為此，通過前期研究及文獻(xiàn)報道[6-12]，本研究對何首烏和制何首烏的提取方式及薄層色譜鑒別方法進(jìn)行改進(jìn)，以超聲提取代替加熱回流制備樣品，采用毒性較低的二氯甲烷-甲醇-甲酸系統(tǒng)代替三氯甲烷-甲醇系統(tǒng)，同時增加石油醚-乙酸乙酯-甲酸系統(tǒng)對極性較低的成分斑點進(jìn)行鑒別，結(jié)果得到了優(yōu)于《中國藥典》2020年版何首烏【鑒別】項下方法的斑點和顯色效果，有助于何首烏和制何首烏藥品標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步提高和優(yōu)化。

1 材料

1.1 儀器

QUINTIX313-1CN 型萬分之一電子天平（德國Sartorius 公司）；KQ-500DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，頻率：40 kHz）；AST 4 型半自動薄層點樣儀、ADC 2型全自動薄層色譜展開儀、Visualizer 型薄層數(shù)碼成像系統(tǒng)（瑞士卡瑪公司）；硅膠G60薄層板（德國Merck公司）。

1.2 試藥

對照品2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（批號：110844-201915，純度：90.7%）、大黃素（批號：110756-201913，純度：96.0%）、大黃素甲醚（批號：110758-201817，純度：99.2%）、何首烏對照藥材（批號：120934-201410）和制何首烏對照藥材（批號：121454-201806）均購于中國食品藥品檢定研究院；大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號：23313-21-5，純度：98%）、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號：23451-01-6，純度：98%）均購于上海源葉生物科技有限公司；常規(guī)試劑為分析純。

22 批生何首烏樣品和34 批制何首烏樣品均經(jīng)中國食品藥品檢定研究院楊建波副研究員鑒定為何首烏Polygonum multiflorumThunb.的干燥塊根及其炮制品，樣品信息見表1～2。

表1 何首烏樣品信息

制何首烏樣品Z1～Z18、Z34 為實驗室自制：Z1～Z18 采用《中國藥典》2020 年版通則（0213）[13]蒸法炮制加工，取何首烏片（批號：S8、S22）約1 kg，分別加入超純水、黑豆汁670 mL，拌勻，靜置過夜使汁吸盡，置木質(zhì)蒸屜隔水加熱，在2、4、8、12、18、24、30、36、48 h 分別取出一定量樣品，曬干，分別得到清蒸（Z1～Z9）、拌入黑豆汁蒸（Z10～Z18）制何首烏樣品。黑豆汁制法：取黑豆1 kg，加水適量，煮約4 h，熬汁約1.5 kg，豆渣再加水煮約3 h，熬汁約1 kg，合并得黑豆汁約2.5 kg。Z34為燉制何首烏，參照《中國藥典》2020 年版通則（0213）燉法炮制，取何首烏（批號：S8）約1 kg，用黑豆汁拌勻，置非鐵質(zhì)的適宜容器內(nèi)，燉至汁液吸盡，得到制何首烏樣品[5]。

表2 制何首烏樣品信息

Z19～Z20 參照《中國藥典》 2020 年版通則（0213）方法，拌入黑豆汁燉制。

Z21～Z22 樣品制法：輔料為黑豆汁（10%黑豆，首次煮4 h，再次煮3 h，合并2 次黑豆汁即得）；黑豆汁與何首烏塊拌勻，潤12 h；蒸箱蒸8 h，燜過夜（約14 h）；干燥7.5 h（敞開式烘箱，70 ℃）；蒸4 h（沒有燜），曬干。

Z23～Z24 樣品制法：將凈何首烏200 kg 放到不銹鋼盤，取黑豆20 kg，加水適量，煮約4 h，熬汁約20 kg，合并得黑豆汁約45 kg，然后倒入黑豆汁和何首烏攪拌均勻，燜潤12 h 即可。將完全潤透的何首烏放入蒸藥機(jī)，蒸制時間10 h，溫度100 ℃，蒸制5 h后取樣觀察色澤情況（由紅褐色部分變成黑褐色或棕褐色，取樣檢測指標(biāo)成分含量變化），待蒸制10 h后，表面由紅褐色全部變成黑褐色或棕褐色，取樣檢測指標(biāo)成分含量變化。

Z25～Z26 樣品制法：照《中國藥典》2020 年版通則（0213）[13]蒸法，黑豆3 kg，加水80 L 煎煮8 h（煎煮2次，第1次煎煮后浸泡過夜）。煎煮液加何首烏18 kg，浸潤22 h，蒸16 h，中間品蒸制8 h。干燥即得。

Z27～Z28 樣品制法：依據(jù)《中國藥典》2020 年版（一部），取何首烏塊100 kg、黑豆汁25 kg，拌勻上鍋蒸4 h，倒出翻蒸，上鍋再蒸3 h，取出、合并汁液，干燥。

Z29樣品制法：高壓蒸制。

Z30 樣品制法：原料凈制，洗藥機(jī)洗至無泥沙，浸泡2 h，燜潤2～3 h；切至厚度為8～12 mm；溫度100 ℃，蒸4～6 h，至呈棕褐色，燜2 h；干燥溫度50～60 ℃，時間2～3 h，至水分不超過12%。

Z31～Z33 樣品制法：按照《中國藥典》2020 年版的工藝要求，用清蒸法，沒有加任何輔料。

2 方法與結(jié)果

2.1 《中國藥典》2020 年版何首烏【鑒別】（2）項下提取方式的優(yōu)化

2.1.1 對照品溶液的配制 取大黃素、大黃素甲醚、2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的溶液。

2.1.2 供試品溶液的配制

2.1.2.1 《中國藥典》2020 年版制備方法 分別取何首烏藥材（S5、S8、S15、S16 和S19）和何首烏對照藥材，按《中國藥典》2020年版何首烏【鑒別】（2）項下供試品溶液制備方法，分別得到供試品溶液（HS5、HS8、HS15、HS16 和HS19）和對照藥材溶液（DZYC-H1）。

2.1.2.2 改進(jìn)方法 分別取何首烏藥材（S5、S8、S15、S16 和S19）粉末0.25 g，分別置具塞錐形瓶中，加乙醇50 mL，超聲20 min（功率：300 W，頻率：40 kHz），濾過，濾液濃縮至3 mL 作為供試品溶液（CS5、CS8、CS15、CS16 和CS19）。另取何首烏對照藥材0.25 g，同法制成對照藥材溶液（DZYC-C1）。

2.1.3 薄層色譜測定 按照《中國藥典》2020 年版薄層色譜法（通則0502），吸取2.1.2 項下2 種供試品溶液制備方法制得的溶液各2 μL，大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷對照品溶液2 μL，2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷對照品各0.5 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上使成條狀，以三氯甲烷-甲醇（7∶3）為展開劑，展開至約3.5 cm，取出，晾干，再以三氯甲烷-甲醇（20∶1）為展開劑，展開至約7 cm，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。薄層色譜圖見圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過2種制備方式制得的樣品在相同的展開條件下展開結(jié)果并沒有明顯差異，因此可以用操作更加簡單方便的超聲提取代替加熱回流作為樣品制備方式。

圖1 不同制備方法何首烏供試品薄層色譜考察

2.2 《中國藥典》2020 年版何首烏【鑒別】（2）項下展開系統(tǒng)的優(yōu)化

2.2.1 對照品及供試品溶液制備 分別按照2.1.1、2.1.2.2 項下方法制備對照品及供試品溶液。點樣量分別為供試品和大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷各2 μL，2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚各0.5 μL，大黃素1 μL。

2.2.2 薄層色譜測定 采用3 種不同薄層色譜展開系統(tǒng)：1）按《中國藥典》2020 年版方法，以三氯甲烷-甲醇（7∶3）為展開劑，展開至約3.5 cm，取出，晾干，再以三氯甲烷-甲醇（20∶1）為展開劑，展開至約7 cm，取出，晾干。2）以石油醚-乙酸乙酯-甲酸（5∶1∶0.3）為展開劑展開，取出，晾干。3）以二氯甲烷-甲醇-甲酸（5∶1∶0.3）為展開劑展開，取出，晾干，其余條件按照2.1.3 項下方法。結(jié)果見圖2～4。展開后發(fā)現(xiàn)，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸（5∶1∶0.3）和二氯甲烷-甲醇-甲酸（5∶1∶0.3）為展開劑，對于何首烏中的不同極性的化合物都有較好的展開效果，相較于三氯甲烷-甲醇系統(tǒng)，展開后斑點明顯增多。

圖2 何首烏樣品按展開系統(tǒng)（1）展開結(jié)果

圖3 何首烏樣品按展開系統(tǒng)（2）展開結(jié)果

圖4 何首烏樣品按展開系統(tǒng)（3）展開結(jié)果

2.3 檢視條件考察

2.3.1 對照品及供試品溶液制備 分別按照2.1.1、2.1.2.2項下方法制備對照品及供試品溶液。

2.3.2 薄層色譜測定 采用改進(jìn)后的2 種展開系統(tǒng)（2）和（3），以硅膠G板展開晾干后，分別考察噴與不噴10%硫酸乙醇顯色劑時，在日光燈和紫外燈（365 nm）下的斑點情況，結(jié)果見圖5～6。由石油醚-乙酸乙酯-甲酸（5∶1∶0.3）和二氯甲烷-甲醇-甲酸（5∶1∶0.3）展開系統(tǒng)展開后噴以10%硫酸乙醇顯色劑并在紫外燈365 nm下檢視，斑點更為豐富和清晰。

圖5 何首烏樣品展開系統(tǒng)（2）在日光燈和紫外光燈下檢視結(jié)果

2.4 薄層色譜鑒別方法的確定

圖6 何首烏樣品展開系統(tǒng)（3）在日光燈和紫外光燈下檢視結(jié)果

基于供試品制備方式、展開體系和檢視條件的考察，確定改進(jìn)后的薄層鑒別方法：1）取何首烏粉末0.25 g，按2.1.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1 項下方法制備大黃素和大黃素甲醚對照品溶液，照薄層色譜法（通則0502），吸取供試品溶液和對照藥材溶液各2 μL，大黃素甲醚對照品溶液0.5 μL，大黃素對照品溶液0.1 μL，分別點于同一以羧甲基纖維鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上使成條狀。以石油醚-乙酸乙酯-甲酸（5∶1∶0.3）為展開劑展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇顯色劑后，置紫外光燈（365 mn）下檢視。2）取何首烏粉末0.25 g，按2.1.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下方法制備2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗，吸取供試品溶液和對照藥材溶液各2 μL，大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷對照品溶液2 μL，2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷各0.5 μL，分別點于同一以羧甲基纖維鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上使成條狀。以二氯甲烷-甲醇-甲酸（5∶1∶0.3）為展開劑，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇顯色劑，置紫外光燈（365 mn）下檢視。

3 何首烏和制何首烏樣品鑒別

3.1 何首烏樣品鑒別

取何首烏樣品（S1～S22），按2.4 項下薄層色譜鑒別方法，分別使用（1）和（2）條件進(jìn)行薄層色譜鑒定，結(jié)果見圖7～8。

圖7 何首烏樣品按【鑒別】條件（1）檢測結(jié)果

圖8 何首烏樣品按【鑒別】條件（2）檢測結(jié)果

3.2 制何首烏樣品鑒別

取制何首烏樣品（Z1～Z34），按2.4 項下薄層色譜鑒別方法，分別使用（1）和（2）條件進(jìn)行薄層色譜鑒定，結(jié)果見圖9～10。

圖9 制何首烏樣品按【鑒別】條件（1）檢測結(jié)果

4 討論

本研究共收集56 份樣品，其中生何首烏22 批，制首烏34 批。不同批次生何首烏藥材薄層檢視結(jié)果顯示，除貴州銅仁產(chǎn)何首烏外，其他所有產(chǎn)地何首烏藥材與對照藥材相比，主要成分斑點并無明顯差異，說明何首烏樣品的一致性較好。根據(jù)文獻(xiàn)報道，何首烏中以大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷為主的結(jié)合蒽醌具有潛在的肝毒性[14-16]。不同炮制工藝及不同炮制時間制首烏樣品薄層檢視結(jié)果顯示，隨炮制時間延長，制首烏中結(jié)合蒽醌含量顯著下降，可能達(dá)到炮制減毒的效果，與本課題組前期對制何首烏中蒽醌類成分含量測定結(jié)果基本一致[5]。通過對黑豆蒸與清蒸工藝的考察，發(fā)現(xiàn)何首烏經(jīng)過36 h 的炮制后，結(jié)合蒽醌的含量大幅下降，且在薄層色譜鑒別中，基本觀察不到明顯的大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷等結(jié)合蒽醌的主斑點，同制何首烏對照藥材溶液的薄層色譜圖基本一致。然而，本研究所收集的16 批制首烏樣品薄層檢視結(jié)果顯示，大部分樣品都有明顯的大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷等結(jié)合蒽醌斑點，推測其炮制時間不足，與實驗結(jié)果基本一致。

圖10 制何首烏樣品按【鑒別】條件（2）檢測結(jié)果

對于《中國藥典》2020 年版何首烏和制何首烏【鑒別】（2）收載的供試品提取方式，本研究嘗試以超聲提取替代原來的加熱回流提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者薄層展開結(jié)果沒有明顯區(qū)別，因此選用更加簡便的超聲提取作為供試品制備方式。與此同時，對于【鑒別】（2）收載的展開系統(tǒng)，用低毒、易得的石油醚-乙酸乙酯-甲酸及二氯甲烷-甲醇-甲酸代替三氯甲烷-甲醇系統(tǒng)，所獲得的薄層色譜圖較《中國藥典》2020 年版何首烏和制何首烏項下薄層色譜條件更理想。因此，《中國藥典》2020 年版生和制何首烏【鑒別】（2）可采用超聲提取來替代加熱回流提?。徊捎檬兔?乙酸乙酯-甲酸（5∶1∶0.3）為展開系統(tǒng)來鑒別生和制何首烏中大黃素和大黃素甲醚等游離蒽醌，以二氯甲烷-甲醇-甲酸（5∶1∶0.3）為展開系統(tǒng)來鑒別生和制何首烏中大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷等結(jié)合蒽醌及2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷。改進(jìn)后的2 種薄層色譜鑒別方法對何首烏中主要成分2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷和蒽醌類成分（游離蒽醌及結(jié)合蒽醌）均具有較好的展開效果，斑點清晰，且分離度較好，可有效用于生（制）何首烏藥材和飲片的鑒別。