選擇性多聚腺苷酸化在心血管疾病中的研究進展

李曉慶 黃菁菁 季軍 高偉 魯翔

選擇性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation，APA)作為一種mRNA轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控機制普遍存在于真核生物中。mRNA成熟的重要步驟之一即前體mRNA(pre-mRNA)在3′非編碼區(qū)(3′UTR)的多聚腺苷酸化位點進行核內(nèi)剪切并添加一個多聚腺苷尾[poly (A)尾]。大多數(shù)人類基因在3′UTR具有一個以上的多聚腺苷酸化位點，這些位點的交替使用可生成具有不同3′UTR長度的mRNA異構(gòu)體[1]。通過APA機制產(chǎn)生多種mRNA異構(gòu)體的同時也改變了其3′UTR區(qū)含有的順式調(diào)控元件，因此可導(dǎo)致產(chǎn)物受到microRNA、RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding protein，RBP)等不同反式作用因子的調(diào)控，如較長3′UTR的mRNA轉(zhuǎn)錄可能具有更多的miRNA和RBP的結(jié)合位點，促進mRNA的降解，進而影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。這些都在一定程度上增加了不同組織中遺傳信息從DNA傳遞至蛋白質(zhì)的復(fù)雜性，使得生物體產(chǎn)生多種不同的生理病理功能[2]。

近些年來研究表明APA模式是具有組織特異性的，如大腦中的mRNA通常具有較長的3′UTR，而睪丸中的mRNA具有較短的3′UTR[3]。此外APA還參與了疾病的發(fā)生發(fā)展過程，如3′UTR在腫瘤發(fā)生和T細(xì)胞擴增過程中的增殖階段會縮短，而在分化和發(fā)育過程中會延長[4]。心血管疾病是包括一系列涉及心臟、血管(動脈、靜脈、微血管)的疾病，目前仍然是全世界最主要的死因之一。近些年APA在心血管疾病病理生理進程中的調(diào)控作用也被逐漸證實。一些研究發(fā)現(xiàn)，APA參與調(diào)控了包括心臟發(fā)育、動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)、心肌肥厚(cardiac hypertrophy，CH)和心力衰竭(heart failure，HF)等多種心血管疾病的病理生理過程。本文將從APA的調(diào)控因子和機制出發(fā)，試對其在心血管疾病中的作用進行綜述。

1 APA調(diào)控因子和機制

APA調(diào)控因子包括切割及多聚腺苷酸化特異因子(cleavage and polyadenylation specificity factor，CPSF)，切割激活因子(cleavage-stimulating factor，CstF)，RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase, RNAP Ⅱ)和RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein，RBP)等。在mRNA轉(zhuǎn)錄延長的過程中，CPSF和CstF結(jié)合在RNAP Ⅱ上，促進mRNA 3′UTR的加工修飾[5]。CPSF復(fù)合體通過CPSF-30中的鋅指結(jié)構(gòu)以及WDR33(WD repeat-containing protein 33)中N端富含賴氨酸/精氨酸的模體, 識別并結(jié)合于mRNA 3′端相對保守的多聚腺苷酸化信號位點AAUAAA[6]；同時，CstF復(fù)合物通過CstF-64亞基中的RRM結(jié)構(gòu)域, 識別并結(jié)合在下游富含GU/U的DSE區(qū)。以上兩個過程共同參與了多聚腺苷酸化位點的選擇[7]。隨之，poly(A)信號(PAS)上游20 nt處的UGUA序列招募切割因子(cleavage factor，CF)，CF在PAS下游10～30 nt處進行切割，然后多聚腺苷酸化聚合酶(PAP)編碼poly(A)尾巴完成mRNA的多聚腺苷酸化[8]。

許多蛋白因子不僅作為選擇性剪切和多聚腺苷酸化的參與者，也作為調(diào)控因子參與到APA的調(diào)控機制中。例如，Nudt21編碼的切割因子CFIm25亞基能夠優(yōu)先選擇遠(yuǎn)端的PAS，然而當(dāng)其表達下調(diào)時則會選擇近端的PAS，從而影響了APA事件的發(fā)生。同時CFIm25還能通過APA偶聯(lián)染色質(zhì)信號的調(diào)節(jié)影響細(xì)胞的命運[9]。不同類型的PAP負(fù)責(zé)編碼poly(A)尾的同時，在PAS的選擇和基因表達方面也發(fā)揮了一定的作用[10]。多聚腺苷酸結(jié)合核蛋白1(PABPN1)作為多聚腺苷酸化中普遍存在的蛋白質(zhì)，能夠作用于PAP并增強其編碼poly(A)尾的能力。同時PABPN1可以控制poly(A)尾的長度在250 nt以內(nèi)，并且PABPN1會優(yōu)先選擇作用于遠(yuǎn)端的PAS。但是,如果下調(diào)PABPN1的表達，多聚腺苷酸化就會優(yōu)先發(fā)生在較不經(jīng)典的近端PAS[11]。此外,還有像CPEB1、Nova這樣的反式作用因子也可通過調(diào)控APA機制改變相應(yīng)致病基因的3′UTR長度，從而參與到疾病的發(fā)展過程中[12]。

2 APA在心血管系統(tǒng)中的研究

2.1 APA與心臟發(fā)育 心臟是胎兒體內(nèi)第一個有功能的器官, 心臟發(fā)育是一個復(fù)雜的形態(tài)發(fā)生過程，它同時受到遺傳和表觀遺傳機制的調(diào)控, 但遺傳學(xué)已不足以解釋心臟發(fā)育的病理生理進程[13]。近些年來，越來越多的研究證實APA機制在心臟發(fā)育進程中發(fā)揮重要作用。Blech-Hermoni等[14]發(fā)現(xiàn)CELF1(CUG-BP, Elav-like family member 1)是一種高度保守的RNA結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)pre-mRNA的選擇性剪接、聚腺苷化、mRNA穩(wěn)定性和翻譯。在心臟中，CELF1在心肌中表達，其水平在發(fā)育過程中受到嚴(yán)格調(diào)控，且在胚胎發(fā)生期間CELF1表達水平在心肌中達到峰值，這提示了CELF1通過APA機制在心臟發(fā)育進程中發(fā)揮重要作用。Qian等[15]的研究發(fā)現(xiàn)心臟轉(zhuǎn)錄因子Nkx2-5可以抑制miR-1的表達水平，而miR-1負(fù)調(diào)控心臟發(fā)育相關(guān)蛋白Cdc42的表達水平，因此Cdc42與Nkx2-5對心臟發(fā)育有協(xié)同作用。Nimura等[16]的研究進一步發(fā)現(xiàn)在心臟發(fā)育進程中，同源蛋白Nkx2-5和5′-3′外切酶Xrn2通過參與APA的調(diào)節(jié)發(fā)揮獨特的作用。Nkx2-5通過將Xrn2招募到靶向基因區(qū)域來調(diào)控APA, Xrn2具有5′-3′核酸外切酶活性并有助于基因末端的轉(zhuǎn)錄終止。Xrn2與mRNA抑制因子結(jié)合到轉(zhuǎn)錄起始位點(transcription start sites, TSSs)和其他下游區(qū)域，并參與RNAP Ⅱ延伸的調(diào)控。Nkx2-5缺失影響Xrn2與靶基因位點的結(jié)合，這不僅可以導(dǎo)致RNAPⅡ的占用增加，而且可以促進心臟發(fā)育相關(guān)基因長3′ UTR的mRNA表達增加[17]。APA調(diào)控過程還可以促進機體產(chǎn)生必要數(shù)量的心肌蛋白，例如由Tnnt2和Atp2a2編碼的心肌肌鈣蛋白T(cTnT)。cTnT的組成部分是肌節(jié)組裝所必需的，對維持正常的心臟功能至關(guān)重要，這也間接提示了APA機制對心臟發(fā)育的重要作用[18]。

2.2 APA與AS AS是一種緩慢的、進行性的心血管疾病，其中炎癥反應(yīng)在AS斑塊形成以及斑塊不穩(wěn)定過程中起重要作用。由于NLRP3炎癥小體可誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18產(chǎn)生，從而成為AS等許多常見炎癥性疾病的有力驅(qū)動因素[19]。Tristetraprolin(TTP)是鋅指蛋白36同源物，具有抗炎、抗腫瘤的作用，其表達減少會加劇AS的進展[20]。2017年，Haneklaus等[21]發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)NLRP3表達的新的轉(zhuǎn)錄后機制，NLRP3基因轉(zhuǎn)錄后可通過APA生成兩種mRNA轉(zhuǎn)錄本(一種3′UTR約為600 bp，另一種約為300 bp)，并且短3′UTR的穩(wěn)定性優(yōu)于長3′UTR。接著，他們經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)了TTP通過結(jié)合于長3′UTR上富含AU的序列(AU-rich elements, ARE)，可以抑制NLRP3炎性小體的表達，提示APA機制在AS進程中具有重要的作用。

2.3 APA與CH CH的病理特征是心臟前后負(fù)荷的增加導(dǎo)致心肌細(xì)胞增大，隨著壓力負(fù)荷的持續(xù)，最初的適應(yīng)性肥大反應(yīng)是有益的，因為它可以維持心臟正常的功能，然而持續(xù)的心肌細(xì)胞功能障礙會導(dǎo)致心肌收縮力受損，引起不可逆的心臟結(jié)構(gòu)重塑[22]。有研究表明，編碼“促肥大”和“抗肥大”蛋白的各種基因可以通過改變其mRNA 的3′UTR來調(diào)控自身的蛋白表達水平。APA模式發(fā)生的變化會影響3′UTR區(qū)的長度，從而改變心臟肥大過程中幾種蛋白調(diào)節(jié)劑的表達[23-24]，如NAD(P)H: 醌氧化還原酶1[NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1, NQO1]，非規(guī)范性聚合酶(speckle targeted PIPKIαregulated poly(A)polymerase，Star-PAP]，RNA結(jié)合基序蛋白10(RNA binding motif protein 10，RBM10)等。

Kumar等[25]發(fā)現(xiàn)NQO1負(fù)責(zé)編碼NQO1蛋白，其作為一種抗氧化酶在心肌細(xì)胞的保護中起著重要的作用，并且NQO1表達的改變也參與了CH的病理進程。Star-PAP作為一種特異性poly(A)聚合酶，通過對poly(A)位置的選擇參與了APA調(diào)控，其敲除后會導(dǎo)致3′UTR的縮短或延長。Kandala等[26]發(fā)現(xiàn)Star-PAP可以與多聚腺苷酸化聚合酶α(PAPα)競爭結(jié)合CPSF-160，但Star-PAP的競爭性更強，更容易與CPSF-160形成復(fù)合物，并結(jié)合于CH相關(guān)基因NQO1的特殊poly(A)位點，進而介導(dǎo)APA調(diào)控其表達，從而參與CH的進程。Star-PAP的優(yōu)勢不僅僅在于和CPSF-160的結(jié)合，還在于：靶mRNA 3′UTR的PAS上游有一段-AUA-模體以及富含GC的序列，這樣的順式作用元件能夠被Star-PAP特異性識別，使其搶占poly(A)位點；靶mRNA 3′UTR的PAS下游的DSE段U含量低，能夠阻礙CstF-64的識別與結(jié)合，而Star-PAP發(fā)揮作用并不需要CstF-64?？偠灾琒tar-PAP通過識別靶基因的特定poly(A)結(jié)合位點，介導(dǎo)APA參與調(diào)控的CH。研究發(fā)現(xiàn)，RBM10作為一種RNA結(jié)合蛋白和RNA剪接因子，可在一定程度上協(xié)助Star-PAP的功能以調(diào)節(jié)CH涉及的關(guān)鍵基因。RBM10上的RRM2結(jié)構(gòu)域能夠與Star-PAP催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成復(fù)合物，并結(jié)合于mRNA的 3′UTR上，并通過APA事件調(diào)控“抗肥大”調(diào)節(jié)因子的表達。有研究證明，不能與Star-PAP結(jié)合的RBM10缺失突變體(RRM2結(jié)構(gòu)域缺失)不能挽救異丙腎上腺素治療引起的細(xì)胞肥大和相關(guān)分子事件，這說明RBM10作為一種重要的“抗肥大”調(diào)控因子能夠與Star-PAP協(xié)同抑制心臟肥大[27]。

2.4 APA與HF HF是心血管疾病的主要表現(xiàn)形式，也是很多心血管疾病的終末狀態(tài)。HF伴隨著心臟內(nèi)穩(wěn)態(tài)的丟失，這依賴于基因表達的嚴(yán)格調(diào)控。APA通過對HF靶基因mRNA 3′UTR的長度進行調(diào)控從而參與HF的病理進程，有研究發(fā)現(xiàn)衰竭的心臟中基因3′端mRNA的形成發(fā)生了變化，但其對于致病的重要性仍然未知。2016年Creemers等[28]使用3′端RNA測序(e3′-Seq)直接測量人類健康和衰竭的心臟標(biāo)本中APA的整體模式。通過監(jiān)測這些心臟中的多聚腺苷酸化譜，在眾多基因中鑒定了疾病的特異性APA信號，同時該研究還發(fā)現(xiàn)許多HF相關(guān)基因的3′UTR會相應(yīng)發(fā)生縮短，并且這些基因的作用大多與RNA結(jié)合相關(guān)，但是3′UTR延長的基因則與細(xì)胞骨架以及肌動蛋白結(jié)合相關(guān)。在更大范圍的人類心臟中進行的RNA測序表明，這些可能和APA機制相關(guān)的基因通常在衰竭的心臟中差異表達，并且3′UTR的長度與基因表達水平之間呈負(fù)相關(guān)。他們的研究還發(fā)現(xiàn)：在衰竭心臟中，APA調(diào)節(jié)蛋白PABPN1表達量顯著下調(diào)，提示PABPN1的下調(diào)可能與某些基因使用近端PAS有關(guān)。該研究還觀察到了CPSF-4表達下調(diào)和斷裂和聚腺苷酸化因子亞基(cleavage and polyadenylation factor subunit-11， PCF11)表達上調(diào)，提示這些APA調(diào)控因子在心臟衰竭的進程中起到了潛在作用。但是在衰竭心臟中3′UTR的延長機制還不清楚，有待于后續(xù)的實驗研究。

3 總結(jié)

半數(shù)以上的人類基因存在潛在的APA位點，APA的調(diào)控影響多種基因的生物學(xué)功能，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。近些年來APA在心血管系統(tǒng)中的重要作用逐漸被證實，發(fā)現(xiàn)APA在心臟發(fā)育、AS、CH和HF等中通過調(diào)節(jié)mRNA的3′UTR 長度調(diào)控相關(guān)基因的穩(wěn)定性和翻譯效率，進而調(diào)控相關(guān)蛋白的表達水平。因此深入研究APA在心血管系統(tǒng)中的調(diào)控機制可能有助于尋找心血管系統(tǒng)疾病的潛在治療靶點，為尋找更為有效的治療提供理論依據(jù)。