人乳頭瘤病毒E6/E7mRNA 在宮頸病變中的研究進展△

見永康，吳澤俊，何娟，莊雅麗

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院婦產(chǎn)科，合肥 230000

宮頸癌是一種婦科常見的惡性腫瘤，近年來，宮頸癌在中國女性中發(fā)病率顯著升高，引起了人們對宮頸癌早期篩查的重視。研究表明，高危型人乳頭瘤病毒（high risk-human papilloma virus，HR-HPV）持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌的最主要因素[1]，在感染過程中，E6/E7 mRNA在宿主細胞中的表達發(fā)揮了重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)的HPV有150多種，其中有40多種可導(dǎo)致宮頸病變。隨著宮頸癌篩查技術(shù)的不斷提高，大多數(shù)癌前病變能被及時發(fā)現(xiàn)并給予相應(yīng)的治療措施，在早期即可阻斷其發(fā)生惡性進展的可能。因此，學(xué)習并繼續(xù)推動宮頸癌篩查技術(shù)的發(fā)展有著重要意義。

1 宮頸癌主要早期篩查方法

宮頸癌病因明確，對已有性生活的女性來說，定期進行宮頸癌篩查具有較高的價值。

1.1 巴氏涂片法

巴氏涂片法最早應(yīng)用于診斷宮頸癌前病變和宮頸癌，自問世以來，許多潛在病變得以被發(fā)現(xiàn)，極大地降低了宮頸癌的發(fā)病率和病死率[2]。然而，巴氏涂片法存在著較多缺陷，如刮板取材不全、涂片不均勻、細胞堆疊等因素使結(jié)果存在誤差，最終導(dǎo)致其假陰性率高，存在著較高的漏診率[3]。

1.2 薄層液基細胞學(xué)檢查（thin-prep cytology test，TCT）

近年來，巴氏涂片法逐漸被TCT所取代。TCT使標本采集流程更完善，減少了干擾因素，診斷宮頸病變更加準確，其制片滿意率和陽性檢出率均明顯優(yōu)于巴氏涂片法[4]。但是，在宮頸病變早期，異常的宮頸鱗狀上皮細胞尚未表現(xiàn)出明顯的形態(tài)學(xué)變化，可能出現(xiàn)假陰性，這使此項技術(shù)存在著一定的誤診率或漏診率。

1.3 HPV檢測法

1.3.1 第二代雜交捕獲法（hybrid captureⅡ，HC2）DNA 檢測 HC2是現(xiàn)今應(yīng)用最廣泛的一種方法，它以核酸雜交技術(shù)為基礎(chǔ)，與傳統(tǒng)的HPV檢查相比具有更高的敏感性。對高級別鱗狀上皮內(nèi)病 變（high grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）的靈敏度（90%）與特異度（88%）均較高[5]。該方法可檢測出13種HR-HPV，但不能區(qū)分具體的基因型，僅能對HPV的陽性和陰性進行判定，因此適用于大量人群的篩查[6]。

1.3.2 Cervista HPV檢測 Cervista HPV檢測分為Cervista HR-HPV檢測和Cervista HPV 16/18型檢測，Cervista HR-HPV檢測可以檢出14種HRHPV，對HSIL的靈敏度較高[7]。Cervista HPV 16/18型檢測只能區(qū)分HPV 16/18亞型，在高危人群的篩查中有較高價值，可作為一種隨訪手段，在年齡大于30歲的女性患者中，對細胞學(xué)檢查正常但HR-HPV檢測結(jié)果為陽性的患者進行分流[8]。

1.3.3 Cobas4800系統(tǒng)法 該法以聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)為基礎(chǔ)，可檢測出12種HR-HPV和HPV 16/18亞型，可進行具體分型，對于HSIL的特異度和靈敏度均很高[9]。

1.3.4 Aptima HPV檢測法 Aptima HPV檢測法是一種mRNA檢測技術(shù)，能檢測出14種不同的HR-HPV，但不能夠具體分型。與HPV DNA檢測技術(shù)相比，Aptima HPV檢測法在保證靈敏度的基礎(chǔ)上，具備更高的特異度[10-11]。與TCT相比，16/18/45分型檢測對≥HSIL的風險預(yù)測能力更佳[12]。

目前，HR-HPV DNA+TCT在中國廣泛應(yīng)用于宮頸癌篩查，此項技術(shù)對宮頸早期病變的靈敏度較高，但特異度較低。

2 HPV 的生物學(xué)特性

HPV是一種由蛋白質(zhì)外殼所包裹的雙鏈環(huán)形DNA病毒。多數(shù)HPV感染機體后能被免疫系統(tǒng)清除，但也有少數(shù)HPV感染會轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)性。根據(jù)其對人體危害性分為高危型和低危型。其中，低危型HPV感染可無癥狀或引起尋常疣、尖銳濕疣等疾病，極少引起宮頸病變；而HR-HPV的持續(xù)感染則與宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的發(fā)生高度相關(guān)，若未及時發(fā)現(xiàn)病變并給予治療措施，甚至有進展為宮頸癌的可能[13]。

HPV的致癌特性來源于致癌蛋白E6和E7。這兩種病毒致癌蛋白的持續(xù)表達是宮頸上皮細胞表型轉(zhuǎn)化的必要條件[14]，它們促進細胞分化并誘發(fā)腫瘤[15]。因此，要預(yù)測宮頸早期病變的后續(xù)進展或監(jiān)測宮頸癌根治術(shù)后的復(fù)發(fā)，可監(jiān)測宮頸脫落細胞中E6/E7蛋白的表達水平。

3 HPVE6/E7mRNA致病機制

幾乎所有的宮頸癌或癌前病變患者都可檢測出HPV感染。HPV E6/E7蛋白可影響正常細胞基因的表達。當E6/E7 mRNA所編碼的蛋白質(zhì)在細胞中持續(xù)存在時，可造成正常細胞的病理改變，引發(fā)不典型增生，導(dǎo)致不良預(yù)后。

E6蛋白是一種由160個氨基酸所組成的小分子蛋白質(zhì)，主要通過泛素通路下調(diào)抑癌基因p53的表達。當機體存在持續(xù)性HR-HPV感染時，E6蛋白過表達，與細胞內(nèi)的E6相關(guān)蛋白（E6-associated protein，E6AP）結(jié)合形成復(fù)合物，隨之與p53基因結(jié)合并快速將其泛素化，使其過度降解。而p53基因在細胞凋亡與細胞老化的過程中發(fā)揮了重要作用，它的缺失使細胞在DNA受損后不能終止細胞周期，細胞基因組突變累積，最終導(dǎo)致惡性進展[16-18]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，僅HR-HPV E6蛋白能夠降解p53基因，低危型HPV E6蛋白對其親和力較低[19]。

E7是一種酸性磷蛋白，能作用于細胞pRb蛋白而使細胞周期失控。轉(zhuǎn)錄因子E2F可調(diào)節(jié)細胞周期和DNA合成，在正常機體中，若DNA發(fā)生損傷，pRb基因即與E2F因子結(jié)合，使細胞周期停滯。當E7蛋白過表達時，可通過抑制pRb與E2F轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，降低pRb活性，使細胞不受控制地進入細胞周期，最終發(fā)生癌變[20]。

4 HPVE6/E7mRNA 在宮頸病變中的預(yù)測作用

HPV感染宮頸細胞后，會分化為游離型和整合型。一般來說，低危型HPV感染機體后，所導(dǎo)致的良性病變組織中以游離型HPV居多；而在HSIL患者的病變組織中則可見大量整合型HPV。在患者的HPV DNA檢測陽性的情況下，若僅發(fā)現(xiàn)宮頸上皮細胞內(nèi)存在游離型HPV并不能說明宮頸存在病變，但E6/E7 mRNA檢測陽性表明HPV已將自身基因整合至宿主細胞中，開始了轉(zhuǎn)錄和翻譯，是宮頸發(fā)生早期病變的特異性標志物[21-22]。

當宮頸組織細胞開始發(fā)生不典型增生時，通過篩查即可發(fā)現(xiàn)早期的病變。單獨應(yīng)用TCT檢測宮頸病變的靈敏度較低[23]，而HPV-DNA檢測的特異度較低，單獨診斷的準確度都不高[24]。而編碼HPV E6/E7蛋白的mRNA提供了病毒的遺傳信息，其檢測有助于評估宮頸早期病變的嚴重程度。近年來，宮頸癌篩查的重點已由確定是否存在HRHPV感染轉(zhuǎn)變?yōu)榇_定宮頸上皮細胞是否存在HPV E6/E7 mRNA的轉(zhuǎn)錄或E6/E7蛋白的表達。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在低級別鱗狀上皮內(nèi)病變（low grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）階段即有 HPV E6/E7 mRNA表達，但其表達水平低于HSIL和宮頸癌[25]。

目前許多研究指出，HPV E6/E7 mRNA檢測可以綜合評估宮頸病變和浸潤性宮頸癌發(fā)生進展的危險性，可以達到早期預(yù)防宮頸癌的目的。Coquillard等[26]研究發(fā)現(xiàn)，檢測宮頸鱗狀上皮細胞內(nèi)是否存在HPV感染時，E6/E7 mRNA定量檢測的靈敏度與HPV-DNA檢測相近，但特異度更高。張莉[27]研究了148例疑似宮頸病變患者，發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA檢測單獨應(yīng)用時的靈敏度（83.78%）、特異度（82.43%）、準確度（83.11%）、陽性預(yù)測值（82.67%）與陰性預(yù)測值（83.56%）均較高。劉佳佳等[28]研究了74例宮頸病變患者，發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA檢測和HPV DNA檢測對HSIL的靈敏度相當，但前者的特異度更高。此外，HPV E6/E7 mRNA檢測對TCT結(jié)果為意義未明的不典型鱗狀細胞（atypicai squamous cell of unknown significance，ASC-US）患者具有較高的特異度（91.7%），可作為ASC-US患者分流管理的有效措施。朱遠航等[29]研究了112例ASC-US患者，同時行HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢測，發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA檢測在受檢患者中對發(fā)展為HSIL的靈敏度（94.44%）與HPV DNA檢測相比無明顯差異，而特異度（45.74%）明顯高于HPV DNA檢測（18.89%）。Johansson等[30]隨訪了211例年齡大于35歲的ASC-US患者，發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA檢測結(jié)果為陽性的患者，未來4～5年內(nèi)宮頸病變進展為HSIL的風險高于陰性患者。

HPV E6/E7 mRNA檢測與其他方法聯(lián)合應(yīng)用時，可有效預(yù)測癌前病變的轉(zhuǎn)歸。楊艷[31]發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA檢測結(jié)合TCT可以綜合評估HSIL和浸潤性宮頸癌發(fā)生進展的危險性。王俊飛等[32]研究了538例可疑宮頸病變的患者，同時行TCT和HPV E6/E7 mRNA檢測，發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合應(yīng)用靈敏度和特異度分別為99.68%和39.29%，大幅度提高了靈敏度，有效降低了漏診率。此外，HPV E6/E7 mRNA檢測在與HC2-HPV DNA聯(lián)合應(yīng)用時，診斷宮頸病變的靈敏度為99.3%，特異度為56.7%，且對HSIL的診斷價值高于LSIL[33]。

5 HPVE6/E7mRNA在HSIL和宮頸癌患者術(shù)后隨訪中的應(yīng)用

潛在的宮頸病變不斷發(fā)展將大大提高宮頸癌的發(fā)病率。過去預(yù)防宮頸癌發(fā)生的有效方法是防止宮頸進一步病變，對于LSIL可采用藥物保守治療并定期隨訪；LSIL保守治療無效、HSIL及宮頸癌患者以手術(shù)切除病變組織作為主要治療手段。然而，手術(shù)后患者仍有病變組織殘留或再次復(fù)發(fā)的可能，因此對術(shù)后患者進行隨訪非常重要。目前以TCT、HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA等為主要檢測方法。HPV E6/E7 mRNA檢測正越來越廣泛地被應(yīng)用于HSIL患者術(shù)后的隨訪。

桂定清等[34]發(fā)現(xiàn)在檢測宮頸錐切患者殘留病變或診斷其是否存在術(shù)后復(fù)發(fā)時，HPV E6/E7 mRNA檢測與HPV DNA檢測的靈敏度相當，但前者具有更高的特異度，可作為HSIL患者宮頸錐切術(shù)后評估其預(yù)后的有效方法。方戀等[35]研究了120例宮頸癌術(shù)后患者，發(fā)現(xiàn)在有病變組織殘留或術(shù)后復(fù)發(fā)的21例患者中，20例患者的HPV E6/E7 mRNA為陽性，其靈敏度為95.23%，特異度、陽性預(yù)測值均為100%。Persson等[36]研究了133例宮頸癌根治術(shù)后患者得出結(jié)論，HPV E6/E7 mRNA檢測對于預(yù)測宮頸癌根治術(shù)后殘留病灶/復(fù)發(fā)的特異度高（93.4%）而靈敏度低（57.1%）。Zappacosta等[37]指出，在錐切術(shù)后患者的隨訪中，HPV E6/E7 mRNA定量檢測較TCT與HPV DNA聯(lián)合檢查的特異度和陽性預(yù)測值高。

6 小結(jié)與展望

HPV E6/E7基因作為與宮頸癌相關(guān)的重要因素，已成為醫(yī)務(wù)人員研究的熱點方向。作為宮頸癌早期篩查的可靠手段，其診斷的準確度高，對于無HPV感染和宮頸病變的患者，避免了不必要的陰道鏡檢查，簡化了診療流程，減輕了患者的負擔，具有巨大的發(fā)展空間。盡管HPV E6/E7 mRNA檢測技術(shù)相較于其他檢測方法有著巨大的優(yōu)勢，但也不能否認其他檢測方法在診斷宮頸癌早期病變與發(fā)展中發(fā)揮的作用。無論是哪一種檢測方法，單獨檢測都無法達到最佳的篩查效果[38]。恰當選取多種方法聯(lián)合應(yīng)用，可提升其特異度與靈敏度，對宮頸癌的臨床防治和降低宮頸癌病死率具有重要意義。