膀胱癌腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)方法的研究進(jìn)展△

田玉婷，任曉委，馮小燕，賈璐璐，鄒立娜，潘洪志，馬宏坤#，榮勝忠#

1牡丹江醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011

2牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院體檢科，黑龍江 牡丹江 157011

3上海健康醫(yī)學(xué)院協(xié)同科研中心，上海 201318

膀胱癌是泌尿系常見惡性腫瘤之一，全球范圍內(nèi)，每年新發(fā)病例數(shù)高達(dá)43萬例，占所有惡性腫瘤的第11位[1]，具有復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差等特點(diǎn)[2]。膀胱鏡檢查是診斷膀胱癌的金標(biāo)準(zhǔn)[3]，但成本較高、具有侵入性[4]，且在檢測(cè)原位癌時(shí)敏感性較低，具有一定的漏診率[5]。

腫瘤標(biāo)志物是由腫瘤細(xì)胞（或細(xì)胞膜表面）產(chǎn)生，或由機(jī)體對(duì)腫瘤產(chǎn)生免疫反應(yīng)而生成、分泌或脫落至人體體液或組織中的物質(zhì)[6]，如核酸、蛋白質(zhì)、酶及糖類。腫瘤標(biāo)志物在輔助腫瘤治療、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[7]。近年來，多種方法已經(jīng)應(yīng)用于膀胱癌腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，如傳感器[8]、微流控[9]、熒光原位雜交[10]、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)[11]、流式細(xì)胞術(shù)[12]及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）等[13]，已引起學(xué)者的廣泛關(guān)注。本文對(duì)近年來膀胱癌腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)方法及研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 傳感器

1.1 DNA電化學(xué)傳感器

典型的生物傳感器由生物受體和換能器組成。生物受體與目標(biāo)分析物相互作用，換能器將這種相互作用轉(zhuǎn)化為電信號(hào)[14]。

DNA電化學(xué)傳感器是通過目標(biāo)DNA與捕獲的寡核苷酸和識(shí)別探針相互作用，識(shí)別探針與適當(dāng)?shù)臉?biāo)志物相結(jié)合進(jìn)而實(shí)現(xiàn)物質(zhì)檢測(cè)的一種方法[15]。

成纖維細(xì)胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）屬于酪氨酸激酶家族，位于染色體4p163上[16]，是評(píng)估膀胱癌患者預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物之一，也是尿路上皮性膀胱癌的有效治療靶點(diǎn)[17]。

Chen等[18]將血紅素包裹在金屬有機(jī)框架材料（MOFs）和鉑納米粒子（PtNPs）中，制備了血紅素-MOFs/PtNPs復(fù)合材料，又利用血紅素-MOFs/PtNPs進(jìn)行信號(hào)放大，因?yàn)檫@種納米材料具有顯著的H2O2催化能力和優(yōu)良的導(dǎo)電性。為進(jìn)一步放大電化學(xué)信號(hào)，選擇還原氧化石墨烯-四乙基戊胺（rGOTEPA）、納米金、鏈霉親和素對(duì)電極進(jìn)行修飾。在最佳條件下，該生物傳感器對(duì)FGFR3在0.1 fM～1.0 nM范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢出限為0.033 fM。

1.2 電化學(xué)免疫傳感器

免疫傳感器是利用抗原和抗體特異性識(shí)別和結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的一種檢測(cè)設(shè)備?？乖涂贵w分子以某種形式固定在電極表面，并與相應(yīng)的抗體或待檢測(cè)抗原形成穩(wěn)定的復(fù)合物。這些復(fù)合物可以引起電化學(xué)信號(hào)的變化，如電極電位、電流和電容[19]。電化學(xué)免疫傳感器的靈敏度受到傳感表面比表面積和電導(dǎo)率的影響[20]。由于具有靈敏度高、檢測(cè)快速、小型化、成本低等優(yōu)點(diǎn)，近年來得到了廣泛的關(guān)注和迅速發(fā)展。

1.2.1 免標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器核基質(zhì)蛋白22（nuclear matrix protein 22，NMP22）可參與DNA重組和復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄和有絲分裂過程[21-22]，是美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)使用的膀胱癌腫瘤標(biāo)志物，可以輔助膀胱癌的診斷[23]。Li等[24]以鈷基金屬有機(jī)框架材料（Co-MOFs）為載體，在其表面包裹銅金納米線（CuAu NWs），合成了一種菊花狀納米復(fù)合材料（Co-MOFs/CuAu NWs），用于修飾玻碳電極。Co-MOFs/CuAu NWs作為信號(hào)材料具有優(yōu)異的催化性能，基于此構(gòu)建了檢測(cè)NMP22的免標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器，線性范圍為0.1 pg/ml～1.0 ng/ml，檢出限為33 fg/ml。榮勝忠等[25]和Rong等[26]采用rGOTEPA固定金摻雜的金屬有機(jī)框架材料ZIF8復(fù)合膜修飾絲網(wǎng)印刷電極，再將NMP22抗體固定在修飾電極表面，用牛血清白蛋白封閉，建立了免標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)NMP22。在最佳檢測(cè)條件下，傳感器的線性范圍為0.01～1000.00 ng/ml，檢出限為3.33 pg/ml。

1.2.2 三明治電化學(xué)免疫傳感器Wu等[27]以氨基功能化的硅鋁磷酸酯分子篩（NH2-SAPO-34）為載體的Pd/Co納米顆粒（NH2-SAPO-34-Pd/CoNPs）為標(biāo)記物，研制了一種新型的三明治電化學(xué)免疫傳感器用于檢測(cè)NMP22，線性范圍為0.001～20.000 ng/ml，檢出限為0.33 pg/ml。

1.3 電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）傳感器

ECL傳感器是電化學(xué)氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的一種發(fā)光傳感器，結(jié)合了化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)的優(yōu)點(diǎn)[28]，通過化學(xué)修飾電極來改變其表面的微觀結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)傳感器的靈敏度和選擇性。通過電極表面特殊的修飾材料來增強(qiáng)ECL體系，有望擴(kuò)大ECL的研究范圍[29]。

微小RNA（microRNA，miRNA）是由18～24個(gè)堿基對(duì)單鏈分子組成的小型非編碼RNA[30]，通過降低靶mRNA的穩(wěn)定性或抑制翻譯效率調(diào)控基因表達(dá)[31]，在調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和血管生成中發(fā)揮重要作用[32]。

Xu等[33]將Hemin/g四聯(lián)體DNAzyme組裝在氮化碳納米片和納米金修飾的電極上，在過量的H2O2存在下，較低的目標(biāo)濃度下Hemin/g四聯(lián)體DNAzyme對(duì)H2O2的催化還原使ECL強(qiáng)度恢復(fù)，較高的目標(biāo)濃度下電極表面生物催化沉淀（biocatalysis precipitation，BCP）誘導(dǎo)的電荷轉(zhuǎn)移阻力導(dǎo)致ECL降低，基于H2O2和BCP催化還原引起的ECL的強(qiáng)度變化實(shí)現(xiàn)了膀胱癌腫瘤標(biāo)志物miRNA-141的檢測(cè)，線性范圍為10-17～10-9M，檢出限為7.9 M。Zhang等[34]以Zn-Ag-In-S（ZAIS）納米晶為模型研究了多晶納米晶（NCs）的ECL傳感器，可溶性ZAIS NCs可以產(chǎn)生以三丙胺為共反應(yīng)物的高效還原氧化ECL傳感器，以ZAIS/ZnS NCs為標(biāo)記，制備了一種超靈敏的ECL傳感器，實(shí)現(xiàn)了膀胱癌腫瘤標(biāo)志物miRNA-141的檢測(cè)，線性范圍為0.1～20.0 pmol/L，檢測(cè)下限為50 amol/L。

2 微流控

微流控是一種精確控制和操控微尺度流體，以在微納米尺度空間對(duì)流體進(jìn)行操控的技術(shù)[35]，芯片是實(shí)現(xiàn)流體操控的載體[36]。微流控具有設(shè)備體積小、使用樣品和試劑量少、運(yùn)行成本低、檢測(cè)時(shí)間短等諸多優(yōu)點(diǎn)[37-38]。

Lin和Peng[39]建立了一種基于磁珠的免疫分析方法，在半導(dǎo)體傳感器中嵌入微流控芯片，使用二抗標(biāo)記帶負(fù)電荷的DNA片段進(jìn)行信號(hào)擴(kuò)增，外加的磁力將分析物緊密地附著在傳感器表面，從而有效解決了分析物到傳感器表面距離較長的問題，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)載脂蛋白A1的檢測(cè)，檢出限為12.5 ng/ml。膀胱腫瘤抗原（bladder tumor antigen，BTA）由膀胱癌細(xì)胞產(chǎn)生，當(dāng)腫瘤侵入間質(zhì)時(shí)釋放至尿液中，美國FDA已經(jīng)批準(zhǔn)其可以作為膀胱癌腫瘤標(biāo)志物。BTA測(cè)試是使用單克隆抗體檢測(cè)尿液中的補(bǔ)體因子相關(guān)蛋白，可以在數(shù)分鐘內(nèi)完成，無需對(duì)尿液樣本進(jìn)行任何預(yù)處理[40]。Jiang等[9]制備了紙基微流控分析裝置，檢測(cè)了尿液樣本中的NMP22和BTA，結(jié)果顯示該方法的檢出率可達(dá)90.91%。

3 熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）

FISH是依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，應(yīng)用熒光素直接或間接標(biāo)記核酸探針，在組織切片、細(xì)胞涂片、染色體鋪片上檢測(cè)間期細(xì)胞核染色質(zhì)數(shù)量及結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而定性和定量分析目標(biāo)物的檢測(cè)技術(shù)[41]。FISH作為一種分子水平檢測(cè)膀胱癌腫瘤標(biāo)志物的方法，具有無創(chuàng)、靈敏度高、易于采集等特點(diǎn)，臨床應(yīng)用前景廣闊。

Riesz等[42]使用FISH技術(shù)檢測(cè)尿液中尿路上皮細(xì)胞的基因突變情況，將熒光直接標(biāo)記的DNA探針結(jié)合到3、7、17號(hào)染色體和9p21位點(diǎn)的著絲點(diǎn)周圍，對(duì)43例膀胱癌患者和12例無或良性突變膀胱癌患者的尿液樣本進(jìn)行了研究，所得FISH結(jié)果與經(jīng)尿道手術(shù)切除標(biāo)本的組織學(xué)結(jié)果進(jìn)行比較，特異度和靈敏度分別為100%和87%。Karnwal等[43]以48例膀胱癌患者為研究對(duì)象，分別比較了FISH、細(xì)胞學(xué)檢查、膀胱鏡檢查3種方法預(yù)測(cè)膀胱癌復(fù)發(fā)的靈敏度和特異度，3種方法的靈敏度分別為63%、42%和98%，細(xì)胞學(xué)檢查預(yù)測(cè)膀胱癌復(fù)發(fā)的特異度為89%，明顯高于FISH檢查的65%及膀胱鏡檢查的41%。

4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA）

ELISA是將已知的抗原（抗體）吸附于固相載體表面，加入抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物，通過加入酶底物的顯色劑來確定抗原抗體結(jié)合量的方法[44]。survivin是細(xì)胞有絲分裂的重要調(diào)節(jié)因子，也是細(xì)胞凋亡的抑制因子，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)新生血管生成，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[45]，是一種新型膀胱癌腫瘤標(biāo)志物[46]。Li等[47]建立了一種用于檢測(cè)survivin的ELISA，檢出限為0.0625 ng/ml，以0.09 ng/m（l檢測(cè)波長450 nm）作為最佳截?cái)嘀担\斷膀胱癌的靈敏度和特異度分別為70.6%和89.2%。Arya和Estrela[48]建立了一種新型電化學(xué)ELISA檢測(cè)平臺(tái)用于NMP22和補(bǔ)體因子H相關(guān)蛋白1（complement factor H related 1，CFHR1）的檢測(cè)，NMP22和CFHR1抗體用于免疫分析，梳狀金電極用于傳感，線性范圍為1～100 ng/ml，NMP22和CFHR1的檢出限分別為260 ng/ml和310 ng/ml。

5 流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)是將熒光標(biāo)記抗體標(biāo)記的細(xì)胞通過光探測(cè)區(qū)時(shí)可以被高度聚焦的激光束檢測(cè)，通過分析細(xì)胞的熒光和（或）散射特性明確細(xì)胞性質(zhì)和狀態(tài)[49]。流式細(xì)胞術(shù)是評(píng)估多種腫瘤標(biāo)志物表達(dá)、區(qū)分細(xì)胞群及細(xì)胞亞群的有效方法[50]，廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、病毒學(xué)、分子生物學(xué)、腫瘤生物學(xué)及傳染病學(xué)等多個(gè)學(xué)科。

CK20在正常膀胱黏膜移行細(xì)胞中不表達(dá)，在膀胱移行細(xì)胞癌中高表達(dá)，因此可以作為膀胱癌的腫瘤標(biāo)志物。Barlandas-Rendón等[51]以115例膀胱癌患者為研究對(duì)象，采用流式細(xì)胞術(shù)分析尿液中CK20和CD45的表達(dá)，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)分析，陽性病例中組織學(xué)確診21例，流式細(xì)胞術(shù)確診18例，細(xì)胞學(xué)確診16例，兩種方法的檢測(cè)靈敏度分別為85.7%和76.1%。邱蓮女等[52]利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)良性血尿、膀胱良性腫瘤及膀胱癌患者尿脫落細(xì)胞進(jìn)行DNA倍體和S期組分（S phase fraction，SPF）分析發(fā)現(xiàn)，膀胱癌、膀胱良性腫瘤患者的SPF明顯高于良性血尿患者，提示尿脫落細(xì)胞DNA流式細(xì)胞術(shù)可以成為診斷及評(píng)估膀胱癌預(yù)后的輔助方法。

6 RT-PCR

RT-PCR通過mRNA生成互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）轉(zhuǎn)錄本定性檢測(cè)基因表達(dá)，并用熒光探針定量檢測(cè)cDNA的擴(kuò)增，RT-PCR的過程包括3個(gè)步驟：RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA、PCR擴(kuò)增cDNA、擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)[53]。Ribal等[54]采用RT-PCR法分析了57例浸潤性膀胱癌根治術(shù)患者和9例非浸潤性膀胱癌患者外周血、骨髓、淋巴結(jié)、腫瘤組織及正常膀胱組織中的膀胱癌腫瘤標(biāo)志物CK20的表達(dá)情況，57例患者中有24例淋巴結(jié)陽性，56例均有CK20的表達(dá)，組織學(xué)和RT-PCR的陽性結(jié)果在95.8%的研究患者中一致，因此RT-PCR法檢測(cè)CK20是一種檢測(cè)浸潤性膀胱癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞和淋巴結(jié)殘留病變的高靈敏度和特異度方法。

Kenney等[55]采用RT-PCR法檢測(cè)了118例膀胱癌患者、50例有膀胱癌病史的患者、68例未確診膀胱癌的患者和55例血尿患者尿液中膀胱癌腫瘤標(biāo)志物survivin的水平，發(fā)現(xiàn)RT-PCR法檢測(cè)膀胱癌患者尿中survivin表達(dá)的靈敏度和特異度分別為79%和93%，檢測(cè)初診膀胱癌患者尿中survivin表達(dá)的靈敏度和特異度分別為83%和95%，檢測(cè)復(fù)發(fā)性膀胱癌患者尿中survivin表達(dá)的靈敏度和特異度分別為82%和90%，對(duì)血尿膀胱癌的檢測(cè)靈敏度和特異度分別為80%和90%，因此RT-PCR是一種高靈敏度與高特異度、無創(chuàng)的survivin檢測(cè)方法。

7 小結(jié)與展望

上述檢測(cè)方法中，傳感器具有方便、快速、靈敏、選擇性高的優(yōu)點(diǎn)，已發(fā)展成為定性、定量檢測(cè)的重要手段，正向檢測(cè)自動(dòng)化、小型化、集成化的方向發(fā)展；微流控技術(shù)具有集成小型化、自動(dòng)化、高通量、檢測(cè)試劑消耗小、污染少等優(yōu)點(diǎn)，但存在成本高、核心技術(shù)不規(guī)范等不足；FISH技術(shù)是一種具有較高靈敏度、特異度、無創(chuàng)的臨床診斷方法，但較高的費(fèi)用可能限制其廣泛應(yīng)用；ELISA方法具有很高的靈敏度、特異度，并且操作簡單、易于標(biāo)準(zhǔn)化，但結(jié)果不穩(wěn)定；流式細(xì)胞術(shù)精度高，但所用儀器價(jià)格昂貴，限制了其普及應(yīng)用；RT-PCR具有靈敏、快速、特異度高等優(yōu)點(diǎn)，但具有可重復(fù)性低、易污染等缺點(diǎn)。

腫瘤標(biāo)志物作為腫瘤輔助診斷、治療效果評(píng)估和預(yù)后判斷的重要指標(biāo)，目前得到了廣泛應(yīng)用。雖然檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的方法很多，但各自存在一定的缺點(diǎn)，目前尚無一種方法診斷膀胱癌的靈敏度和特異度達(dá)到100%，因此，通過科學(xué)開展多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)和聯(lián)合應(yīng)用多種檢測(cè)方法可以在一定程度上提高膀胱癌的檢出率，提高防治的效果。

貢獻(xiàn)聲明田玉婷負(fù)責(zé)文章撰寫及修改，任曉委、馮小燕、賈璐璐、鄒立娜負(fù)責(zé)資料收集、整理及翻譯，潘洪志、馬宏坤、榮勝忠負(fù)責(zé)反復(fù)審校及潤色修改。