細胞自噬在食管癌中的研究進展

李婉瑩 單探幽 閆錦陽 高社干

食管癌是侵襲性較強的惡性腫瘤之一[1]。流行病學研究[2-3]結果表明，食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)約占食管癌的90%，食管腺癌(esophageal adeno carcinoma，EAC)僅占10%，盡管兩者具有地域分布和人種差異，但5年生存率均低于20%，且都與早期診斷困難、頻繁的癌細胞轉移和治療敏感性降低有關。因此，亟待開發(fā)用于食管癌治療的新標靶和新方法。

自噬是介導細胞降解和再循環(huán)的分解代謝過程，對于維持體內穩(wěn)態(tài)和細胞發(fā)育至關重要。自噬可分為巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侶介導的自噬(chaperone-mediated autophagy, CMA)3種，目前得到最廣泛研究的是巨自噬。巨自噬利用自噬泡將細胞質中多余和受損的細胞器，以及入侵的微生物包裹起來形成自噬體，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，水解囊泡中的內容物以重新合成營養(yǎng)物質和能量[4]。目前對于自噬泡脂質的來源仍存爭議，其可能來自內質網、線粒體、高爾基體或質膜。本文將對巨自噬(以下稱為自噬)在食管癌中的作用進行綜述。

1 細胞自噬在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的雙重作用

正常情況下，大多數細胞的自噬水平較低，用于清除受損和多余的細胞器、錯誤折疊的蛋白質和入侵的病原體。自噬過程被認為是一種內源性防御機制，細胞在惡劣條件下(如缺氧、高溫、饑餓和氧化應激)可通過提高自噬水平獲取能量，維持生存[5-6]。此外，自噬還可參與細胞Ⅱ型程序性死亡，調節(jié)與腫瘤相關的炎癥和免疫反應[7-8]，維持機體的正常代謝和基因組的完整性，從而抑制腫瘤的發(fā)生。在腫瘤進展階段，自噬水平的提高可為腫瘤細胞提供能量，抑制其凋亡、促進侵襲，清理被化學治療(簡稱化療)與電離輻射損傷的大分子或細胞器，保護被攻擊的腫瘤細胞，提高腫瘤細胞對放射治療(簡稱放療)和化療(簡稱放化療)的耐受性[9]。

1.1 自噬對食管癌的抑制作用 自噬對于維持正常機體基因組穩(wěn)定、維持體內代謝平衡至關重要。Beclin-1是酵母自噬相關基因ATG6在哺乳動物中的同源基因，可被自噬相關激酶ULK1磷酸化，并作為磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)復合物的整體支架促進自噬相關蛋白定位到自噬泡[10]。臨床研究[11]顯示，33%的ESCC患者中Beclin-1蛋白表達缺失，且Beclin-1陽性組的生存率高于Beclin-1陰性組。動物實驗發(fā)現，Beclin-1-/-突變型小鼠在胚胎早期死亡，而Beclin-1+/-突變小鼠腫瘤發(fā)生率增高，這與Beclin-1基因的表達量減少、自噬受損有關，表明Beclin-1是劑量依賴性的抑癌基因[12]。

為了證明自噬在Barrett食管(Barrett esophagus，BE)向EAC轉化過程中的作用，有研究[13]檢測了正常鱗狀上皮細胞、非發(fā)育異常BE細胞、發(fā)育異常BE細胞和EAC細胞中的自噬水平，發(fā)現非發(fā)育異常BE細胞自噬小泡數量最多，而EAC細胞中幾乎沒有自噬小泡；將4種細胞暴露于以脈沖形式釋放的酸性環(huán)境(pH值3.5)中孵育，非發(fā)育異常BE細胞和正常鱗狀上皮細胞在與自噬抑制劑氯喹聯合孵育時的氧化應激水平較單獨暴露于酸性環(huán)境孵育時顯著升高，并且4種細胞的死亡率顯著增高；表明自噬可以減輕酸暴露造成的細胞損傷，促進細胞在氧化應激條件下存活，在BE進展中發(fā)揮重要作用。有學者用重組慢病毒載體轉染Beclin-1基因構建了Beclin-1過表達的食管癌Eca109細胞系，結果顯示Beclin-1過表達Eca109細胞中LC3-Ⅱ蛋白的表達水平較空載體組明顯升高，而細胞增殖能力及侵襲性下降；進一步構建裸鼠皮下移植腫瘤模型，結果顯示Beclin-1過表達組裸鼠的腫瘤生長速度明顯低于空載體組[14]。上述結果提示，高水平自噬可抑制食管癌細胞的生長。

1.2 自噬促進食管癌的進展 微管相關蛋白1輕鏈3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)是自噬相關基因ATG8在哺乳動物中的同源物，可被自噬相關半胱氨酸肽酶ATG4B水解，形成細胞質定位的LC3-Ⅰ，在自噬過程中LC3-Ⅰ在ATG7、ATG3蛋白作用下與磷脂酰乙醇胺共價結合形成LC3-Ⅱ并轉至自噬體膜。通常 LC3和LC3-Ⅱ都可作為細胞自噬的分子標志物，其表達水平與自噬的程度成正比[15]。

在食管癌進展階段，自噬可清除受損細胞器為癌細胞提供能量，抑制癌細胞凋亡，降低治療敏感性，促進癌細胞增殖。利用 Eca9706 和 KYSE150食管癌細胞系進行的體外研究[16]結果顯示，腸癌轉移相關基因1(metastasis-associated in colon cancer-1，MACC1)以自噬依賴性方式促進ESCC細胞增殖、遷移和侵襲。Chen等[17]的前瞻性研究納入了43例ESCC患者，結果顯示，caspase-3表達水平較低與LC3B水平較高、惡性轉化程度較高的免疫組織化學結果和預后較差有關，且caspase-3與LC3B的表達水平呈負相關，表明自噬可能通過抑制細胞凋亡來促進ESCC的進展。一項納入了253例ESCC患者的研究[18]也顯示，LC3呈低表達的患者較高表達者治療后的生存時間更長(71.1個月比55.5個月，P=0.022)，且較高的LC3表達水平是ESCC發(fā)生的危險因素(RR=1.407)。一項納入了104例術前未接受放化療和48例術前接受了放化療的EAC患者的研究[19]結果顯示，LC3B陽性與預后較差有關，但亞組分析則顯示LC3B陽性與術前未接受放化療的患者預后較好有關，但亦與術前接受了放化療的EAC患者預后較差相關，一定程度上解釋了放化療對腫瘤基礎自噬的影響[19]。一項meta分析納入78篇文獻共12 876例患者，其中有1 822例(14.2%)接受過放化療，結果顯示LC3B陽性與患者預后較差有關(HR=1.56)[20]。上述研究結果表明，食管癌在腫瘤進展階段的自噬水平較高，且較高的自噬水平與患者預后不良有關。

總之，自噬在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中具有雙重作用。在正常生理狀態(tài)下，自噬可以維持正常細胞的穩(wěn)態(tài)，抑制食管癌發(fā)生；一旦正常細胞轉化為癌細胞，由于自噬與細胞壓力的動態(tài)平衡關系被打破，需要自噬為細胞提供ATP并維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)定，自噬就能促進癌細胞的生長和存活。

2 細胞自噬與微生態(tài)

自噬作為先天免疫的重要組成部分，是抵御病原菌入侵的重要屏障[21]，與此同時許多微生物已經進化出逃避或破壞宿主自噬得以生存并建立持續(xù)感染的策略[22]。Yang等[23]研究發(fā)現并定義了存在于食管中的兩類微生物群，分別稱為Ⅰ型和Ⅱ型微生物群：Ⅰ型微生物群主要由革蘭陽性菌和鏈球菌屬組成，與組織學正常的食管相關；Ⅱ型微生物群則主要由革蘭陰性菌組成，與食管炎和BE的組織學證據存在相關性。一項針對ESCC患者的研究[24]發(fā)現，食管鱗狀上皮異型增生(ESCC的癌前病變)和ESCC患者較健康人群食管及口腔微生物多樣性低，且ESCC組織與非腫瘤組織梭狀芽孢桿菌(Fusobacterium)豐度較高、鏈球菌(Streptococcus)豐度較低，表明ESCC患者存在食管和口腔微生態(tài)的異常。

有研究[25]在61%的ESCC患者組織中檢測出牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis)，但在健康對照組中未檢出。P.gingivalis隸屬擬桿菌門，研究[26]發(fā)現其能增加ESCC的發(fā)生風險，并且血清中抗P.gingivalis的IgG和IgA可作為生物標志物用于ESCC的早期篩查[27]。Guo等[28]研究結果表明， ESCC細胞中Beclin-1的表達水平隨著P.gingivalis感染時間的延長而降低，而P.gingivalis感染或Beclin-1下調可增強ESCC細胞的增殖能力和遷移能力，降低ESCC細胞對紫杉醇的敏感性。上述結果表明，P.gingivalis感染可能通過影響細胞自噬，促進ESCC細胞增殖和遷移。

3 細胞自噬與食管癌的治療

食管癌常見的治療方案是進行手術切除后配合化療和放療，但患者較易出現抗性，影響了治療效果。自噬促進了癌細胞耐藥性的建立[9]。目前，臨床上常用的自噬抑制劑為氯喹及其衍生物羥氯喹，為抗瘧疾藥物，可防止溶酶體酸化，阻止自噬泡被清除[29]。臨床研究[30-32]已證實，氯喹及其衍生物羥氯喹能單獨或與其他藥物聯合應用，通過抑制自噬提高黑素瘤、大腸癌、骨髓瘤和腎細胞癌患者的放化療療效，具有治療潛力。但目前尚無利用上述自噬抑制劑在ESCC患者中進行試驗的研究。

常用的化療藥物順鉑和5-氟尿嘧啶(5-fluouracil，5-FU)可調節(jié)細胞自噬。ESCC細胞系OE21和EAC細胞系OE33對5-FU和順鉑均表現出敏感性，這與促進細胞凋亡和抑制自噬相關[33]。與之相反，ESCC細胞系KYSE450和EAC細胞系OE19中則顯示出對5-FU和順鉑的抗性，KYSE450細胞系中Beclin-1蛋白和ATG7蛋白的表達上調，降低了5-FU對自噬泡合成的抑制作用，表明自噬增強了癌細胞對化療的抗性；常用的自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)、氯喹和巴佛洛霉素A1(bafilomycin A1，Baf-A1)均不影響KYSE450細胞對5-FU的敏感性，表明靶向干預自噬的途徑不是由遺傳損傷介導的[34]。在ESCC細胞系Ec109中，利用順鉑進行干預后，細胞自噬水平上調，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mTORC1)激活水平降低；在異種移植腫瘤動物模型中，順鉑與氯喹聯用時癌細胞的增殖受到抑制，而兩種藥物單獨使用時均未對癌細胞產生明顯的抑制作用，表明自噬降低了順鉑療效的發(fā)揮[35]。

細胞自噬也與癌癥靶向藥物的治療效果有關。人工合成的靶向bcl2蛋白質家族成員(細胞凋亡調節(jié)劑)對自噬有明顯的調節(jié)作用。 GX15-070是一種化學合成的bcl2同源物3模擬藥物，作用于ESCC細胞系EC9706后可誘導自噬，GX15-070單獨或與5FU/卡鉑聯合使用可促進EC9706細胞死亡，聯用自噬抑制劑3-MA可增強GX15-70誘導細胞死亡的作用[36]。人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，Her2)抑制劑與自噬抑制劑聯合使用可增強對EAC細胞活性的抑制作用，可能有助于EAC的治療[37]。甲磺酸酯(Obatoclax)是bcl2家族成員的泛抑制劑，介導bcl2家族成員的下調，在順鉑敏感和耐藥ESCC細胞系中均表現出自噬抑制活性，導致細胞死亡；在這一過程中，甲磺酸酯可通過下調溶酶體蛋白酶的水平抑制癌細胞自噬，考慮到自噬和蛋白酶是蛋白質降解的主要細胞途徑，因此推測甲磺酸酯與蛋白酶體抑制劑MG132結合可引起聚泛素化蛋白積聚，引起癌細胞死亡[38]。

目前已有多種天然化合物被用于食管癌的治療。白藜蘆醇是在紅酒和食品中發(fā)現的一種植物抗毒素，具有抗腫瘤作用。在ESCC細胞系EC109、EC9706和K562中，白藜蘆醇誘導了細胞G1期阻滯，促進細胞凋亡，聯用自噬抑制劑可增強白藜蘆醇介導的細胞死亡作用[39]。體外研究[40]顯示，人參皂苷Rk3可限制ESCC細胞系Eca109和KYSE150的增殖和侵襲能力，與引起細胞周期G1期阻滯、促進細胞凋亡有關，降低PI3K/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路激活的水平；有趣的是，聯用自噬抑制劑3-MA卻抑制了Rk3的抗癌作用，表明自噬在這種情況下會促進癌細胞的凋亡。

4 前景展望

自噬在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要且復雜的調控作用，并且能夠影響其治療效果。盡管已有研究證明自噬在BE向EAC轉化的過程中起保護作用，但仍需要進一步開發(fā)體內研究模型探究自噬的調節(jié)機制。在考慮如何利用自噬抑制劑治療食管癌時，關鍵在于了解細胞主體及基礎自噬水平是否被打破。要準確判斷患者的自噬是處于激活還是停滯狀態(tài)，并結合是否接受放化療等因素綜合判斷。此外，由于自噬調節(jié)腫瘤的復雜性，如何判斷基礎自噬水平，評估自噬發(fā)揮的作用，仍需要進一步開發(fā)新的檢測系統，以實現特異性的調節(jié)自噬水平，更好地指導臨床治療。