疫苗產(chǎn)品全生命周期外源因子安全性風(fēng)險(xiǎn)評估及質(zhì)量控制探討

凌 媛

（國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，北京 100022）

2020年版《中國藥典（三部）》中提及的外源因子，是指經(jīng)無意間引入于接種物、細(xì)胞基質(zhì)和（或）生產(chǎn)制品所用的原材料及制品中的、可復(fù)制或增殖的污染物，包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等。目前關(guān)于生物制品外源因子安全性質(zhì)控相關(guān)的指導(dǎo)原則，國際上有國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會（ICH）相關(guān)技術(shù)要求（Q5A，《生物技術(shù)產(chǎn)品的病毒安全性評價(jià)》，以下簡稱ICH Q5A要求），世界衛(wèi)生組織（WHO）相關(guān)指導(dǎo)原則（《動物細(xì)胞作為生物制品生產(chǎn)基質(zhì)的建議及細(xì)胞庫的鑒定》）。我國已發(fā)布的相關(guān)指導(dǎo)原則有國家藥品監(jiān)督管理局《疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)的技術(shù)審評一般原則》《生物組織提取制品和真核細(xì)胞表達(dá)制品的病毒安全性評價(jià)技術(shù)審評一般原則》《血液制品病毒去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原則》，分別對細(xì)胞基質(zhì)、重組生物制品和血液制品中外源因子的控制及檢測方法給予了明確規(guī)定。2020年版《中國藥典（三部）》也對生物制品病毒安全性控制提出了基本要求。2010年，WHO生物制品標(biāo)準(zhǔn)化專家委員會（ECBS）和國際藥品監(jiān)管當(dāng)局會議（ICDRA）曾建議WHO協(xié)助各國建立外源因子風(fēng)險(xiǎn)評估的指導(dǎo)原則，此后各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)為有效控制生物制品的病毒安全性風(fēng)險(xiǎn)均發(fā)布了相關(guān)指導(dǎo)原則。2015年，WHO還針對上市疫苗產(chǎn)品的病毒安全性評價(jià)頒布了《在上市疫苗中發(fā)現(xiàn)外源因子污染后的風(fēng)險(xiǎn)評估指導(dǎo)原則》，提出監(jiān)管部門在健康人用疫苗中如發(fā)現(xiàn)外源因子污染，應(yīng)根據(jù)科學(xué)研究，重新對上市產(chǎn)品進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)、獲益評估（安全性評估）。以上關(guān)于生物制品病毒安全性相關(guān)法規(guī)及指導(dǎo)原則，對生物制品（包括疫苗）的生產(chǎn)過程質(zhì)控及產(chǎn)品全生命周期管理中外源因子安全性風(fēng)險(xiǎn)評估均提出了具體要求，疫苗產(chǎn)品可根據(jù)具體情況參照執(zhí)行。

1 疫苗產(chǎn)品外源因子安全性風(fēng)險(xiǎn)評估及質(zhì)控原則

1.1 安全性風(fēng)險(xiǎn)評估

在疫苗生產(chǎn)過程中，外源因子風(fēng)險(xiǎn)評估是針對細(xì)胞基質(zhì)、菌毒種及其他原材料、生產(chǎn)各環(huán)節(jié)及最終產(chǎn)品進(jìn)行全面的外源因子安全性風(fēng)險(xiǎn)分析，并根據(jù)制品外源因子污染的途徑制訂防控措施，以減少不確定因素導(dǎo)致的污染風(fēng)險(xiǎn)［1］。對于生物制品病毒安全性控制，2020年版《中國藥典（三部）》提出，需對生物制品生產(chǎn)全過程進(jìn)行質(zhì)控。為確保生物制品病毒安全性，需對細(xì)胞基質(zhì)及其他原材料的來源加強(qiáng)控制，在生產(chǎn)過程中的適當(dāng)環(huán)節(jié)進(jìn)行外源因子檢測及評估生產(chǎn)工藝對病毒的清除能力，必要時(shí)應(yīng)對上市產(chǎn)品進(jìn)行病毒安全性追溯。ICH Q5A要求也提出，病毒檢測方案應(yīng)覆蓋細(xì)胞庫、毒種庫、生產(chǎn)各階段直至產(chǎn)品上市的全過程。

1.2 質(zhì)控原則

1.2.1 原材料引入的外源因子

疫苗產(chǎn)品的病毒安全性控制應(yīng)以起始原材料、生產(chǎn)原輔料的病毒污染來源控制為始，包括對原材料病毒污染的檢測和篩查。具體如疫苗菌毒種制備及生產(chǎn)過程中可能需添加的動物源性材料（如培養(yǎng)基、蛋白胨、血清、胰蛋白酶等），以及操作者、操作環(huán)境等因素。首先應(yīng)對原材料來源加強(qiáng)控制，建議參照《中國藥典（三部）》“（生物制品生產(chǎn)用原材料及輔料質(zhì)量控制規(guī)程）”的相關(guān)要求，建立完整的生產(chǎn)用原材料和輔料內(nèi)部質(zhì)控原則，盡可能選擇低或無病毒安全性風(fēng)險(xiǎn)的原材料和輔料用于生物制品的生產(chǎn)，如采用重組技術(shù)生產(chǎn)的非動物來源生物材料替代動物源性生物材料等。但動物源性原材料可能用于非動物源性原材料的生產(chǎn)過程中，如采用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化為多肽、氨基酸等。此外，有些細(xì)胞基質(zhì)可能不適應(yīng)無血清培養(yǎng)，潛在的動物源性外源因子污染風(fēng)險(xiǎn)不可能完全消除。在生物制品生產(chǎn)過程中曾發(fā)生過小鼠微小病毒（MVM）污染事件［2］。故建議采用多種檢測方法加強(qiáng)對原材料來源的質(zhì)控，在不同生產(chǎn)階段檢測、分析生產(chǎn)過程中使用原材料中可能引入的外源因子。

1.2.2 細(xì)胞庫和毒種庫相關(guān)外源因子

目前，除Vero細(xì)胞外，已有多種其他細(xì)胞系用于疫苗生產(chǎn)并獲批上市，如采用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的重組人乳頭瘤病毒疫苗、重組流感病毒疫苗，采用中國倉鼠卵巢細(xì)胞系（CHO細(xì)胞）表達(dá)系統(tǒng)的重組帶狀皰疹病毒疫苗、重組乙型肝炎疫苗，采用酵母表達(dá)系統(tǒng)的重組乙型肝炎疫苗、重組人乳頭瘤病毒疫苗等。針對以上不同來源的細(xì)胞基質(zhì)做好外源因子安全質(zhì)控，對于保障疫苗產(chǎn)品安全性至關(guān)重要。動物來源細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)制品病毒污染的最大風(fēng)險(xiǎn)來源于起始原材料，細(xì)胞庫、毒種庫的制備過程有可能需要添加的動物源性材料及制備，以及操作環(huán)境中有可能引入潛在的外源因子。國內(nèi)外法規(guī)及指導(dǎo)原則對細(xì)胞庫、菌毒種庫檢定提出具體要求，對細(xì)胞庫及生產(chǎn)終末代細(xì)胞應(yīng)進(jìn)行外源因子檢測，應(yīng)確保不存在對人類可能具有傳染性和/或致病性的病毒等外源因子。WHO指南建議，從生產(chǎn)起始階段即細(xì)胞庫及菌毒種庫階段即開始實(shí)施《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（GMP）。

不同種類細(xì)胞在人體內(nèi)傳播致病性病毒的風(fēng)險(xiǎn)不同，故需評估生產(chǎn)疫苗用細(xì)胞是否具有外源因子安全性風(fēng)險(xiǎn)。ICH Q5A要求指出，含有內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒以外的病毒細(xì)胞系能否用于生產(chǎn)，應(yīng)由監(jiān)管部門根據(jù)產(chǎn)品的獲益、臨床用途，污染病毒的性質(zhì)、感染或致病的潛在可能性，以及工藝對病毒清除能力的評估，到對最終產(chǎn)品的檢測，經(jīng)利弊分析后綜合考慮。對疫苗生產(chǎn)中最常用到的Vero細(xì)胞的相關(guān)外源因子檢測及生產(chǎn)質(zhì)控，可參照國內(nèi)外法規(guī)及指導(dǎo)原則對細(xì)胞庫、菌毒種庫的檢定要求進(jìn)行質(zhì)控。以下重點(diǎn)討論疫苗生產(chǎn)使用的其他細(xì)胞系的外源因子風(fēng)險(xiǎn)及質(zhì)控。

1）采用CHO細(xì)胞生產(chǎn)疫苗的外源因子安全性質(zhì)控

CHO細(xì)胞是治療用生物制品生產(chǎn)常用細(xì)胞系，適應(yīng)能力強(qiáng)、生長快速，可實(shí)現(xiàn)目的蛋白高表達(dá)，且目的蛋白可在CHO細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)充分的蛋白折疊和翻譯后修飾，可形成天然的蛋白結(jié)構(gòu)。但由于CHO細(xì)胞本身具有成瘤性及逆轉(zhuǎn)錄酶活性陽性，且發(fā)現(xiàn)其中有內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒（RVLP）的存在，這與感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒序列相似，而感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒具有致瘤性，理論上存在重組風(fēng)險(xiǎn)。雖然WHO曾報(bào)告，來自CHO細(xì)胞培養(yǎng)的治療類生物制品的細(xì)胞收獲物中有嚙齒類病毒的感染［3-5］，但無證據(jù)表明最終產(chǎn)品污染了嚙齒類病毒，且在采用CHO細(xì)胞表達(dá)的治療類生物制品上市后尚無病毒污染的報(bào)道。

采用CHO細(xì)胞生產(chǎn)的國內(nèi)已上市預(yù)防用疫苗僅有蘭素史克（GSK）帶狀皰疹疫苗（50歲以上人群用）及早期乙型肝炎疫苗；基于糖基化考慮，也有企業(yè)采用CHO細(xì)胞進(jìn)行重組新型冠狀病毒疫苗的研發(fā)。但在選擇預(yù)防性兒童用疫苗的生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)時(shí)，建議慎重選用CHO細(xì)胞。若采用CHO細(xì)胞進(jìn)行疫苗生產(chǎn)，細(xì)胞的來源及傳代馴化歷史應(yīng)清晰。對于使用逆轉(zhuǎn)錄酶陽性的CHO細(xì)胞用于重組蛋白的生產(chǎn)，ICH Q5A要求和WHO指南均要求對CHO細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒感染性試驗(yàn)，以確定病毒顆粒的感染性，感染性呈陽性的CHO細(xì)胞不能用于生產(chǎn)。采用透射電鏡檢查污染物質(zhì)，應(yīng)無細(xì)胞漿A型和R型逆轉(zhuǎn)錄病毒以外的污染物檢出；生產(chǎn)工藝需設(shè)置針對逆轉(zhuǎn)錄病毒的去除工藝，可考慮納濾、低pH孵育或陰離子層析等去除外源病毒，并應(yīng)進(jìn)行病毒去除驗(yàn)證，獲得純化各工藝對病毒的去除能力；同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)對生產(chǎn)過程中的病毒檢測，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的定量檢測，對未加工的發(fā)酵收獲液進(jìn)行除常規(guī)外源因子外的逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測，再根據(jù)純化工藝對病毒的去除能力計(jì)算終產(chǎn)品中內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒的含量。通常建議每100萬劑量中的病毒顆粒應(yīng)少于1個(gè)，即應(yīng)低于1個(gè)RVLP/100萬個(gè)劑量。

2）采用昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)疫苗的外源因子安全性質(zhì)控

SF-9和Hi-5細(xì)胞是桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中常用的昆蟲細(xì)胞。采用SF-9細(xì)胞生產(chǎn)的重組流感病毒疫苗已在國外獲批上市，采用Hi-5細(xì)胞生產(chǎn)的二價(jià)HPV疫苗已在我國獲得進(jìn)口注冊。由于有些昆蟲細(xì)胞攜帶內(nèi)源性和特異性病毒等外源因子，當(dāng)采用其進(jìn)行疫苗生產(chǎn)時(shí)，需重點(diǎn)關(guān)注昆蟲細(xì)胞外源因子的質(zhì)控。

美國食品和藥物管理局（FDA）在2014年發(fā)文指出，在SF-9細(xì)胞中檢測到彈狀病毒的5個(gè)主要基因（N，P，M，G，L蛋白基因）的片段，幾乎含有所有主要基因組及結(jié)構(gòu)蛋白，且轉(zhuǎn)錄水平能檢測到基因轉(zhuǎn)錄，電鏡能檢測到極少量的彈狀病毒顆粒。目前雖無證據(jù)表明彈狀病毒對人有感染性，但其作為生產(chǎn)中存在的外源病毒仍具有潛在風(fēng)險(xiǎn)。FDA建議在各生產(chǎn)環(huán)節(jié)應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測，并采用相關(guān)模型病毒進(jìn)行生產(chǎn)工藝對病毒去除能力的驗(yàn)證，監(jiān)測生產(chǎn)過程中的病毒安全性［6］。FDA的跟蹤報(bào)道說明，目前昆蟲細(xì)胞來源的疫苗產(chǎn)品均可通過良好的生產(chǎn)過程質(zhì)控，保證產(chǎn)品不含有外源因子的污染，確保產(chǎn)品的病毒安全性。

采用SF-9細(xì)胞株生產(chǎn)疫苗，應(yīng)加強(qiáng)對細(xì)胞庫、毒種庫及生產(chǎn)過程中間品的外源因子監(jiān)測，確認(rèn)SF-9細(xì)胞是否含有逆轉(zhuǎn)錄病毒，并建議在原液中進(jìn)一步闡明是否有逆轉(zhuǎn)錄病毒序列，開展昆蟲細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄酶活性相關(guān)的轉(zhuǎn)座子風(fēng)險(xiǎn)研究。具體通過基因組、轉(zhuǎn)錄組測序，質(zhì)譜分析、電鏡檢測等，闡明病毒外源因子的存在形式，確認(rèn)其不是以病毒形式，而是以核酸片段形式存在，且該核酸轉(zhuǎn)錄元件不能組裝成病毒顆粒，確保產(chǎn)品無外源病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)。建議用于Ⅲ期臨床生產(chǎn)所使用的SF-9細(xì)胞，應(yīng)使用經(jīng)克隆篩選后無彈狀病毒污染的細(xì)胞株，并用該細(xì)胞株重新構(gòu)建的毒種庫用于疫苗制備。應(yīng)對昆蟲細(xì)胞內(nèi)源性和特異病毒（如彈狀病毒、蟲媒病毒）等外源因子加強(qiáng)檢測，通過生產(chǎn)工藝對病毒去除能力的驗(yàn)證，最終保證產(chǎn)品外源因子安全性風(fēng)險(xiǎn)整體可控。

Hi-5細(xì)胞系是從BTI中粉紋夜蛾卵中分離得到，在Hi-5細(xì)胞系開發(fā)過程中曾發(fā)現(xiàn)羅達(dá)病毒的污染，之后經(jīng)細(xì)胞系克隆篩選出新的Hi-5細(xì)胞系（Hi-5 RIX 4446細(xì)胞系）用于疫苗研究。采用Hi-5細(xì)胞生產(chǎn)的某產(chǎn)品，在研發(fā)早期的種子庫中檢測到FHVvar病毒的RNA，電鏡檢測在細(xì)胞質(zhì)中觀察到病毒顆粒樣結(jié)構(gòu)，企業(yè)后續(xù)采用終點(diǎn)稀釋法對細(xì)胞系進(jìn)行克隆篩選，最終獲得不含F(xiàn)HVvar病毒RNA的Hi-5細(xì)胞系，并重新用于疫苗的生產(chǎn)。

3）其他疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)

目前疫苗生產(chǎn)用其他細(xì)胞基質(zhì)，如人腎上皮細(xì)胞系HEK293細(xì)胞，建議根據(jù)細(xì)胞系的來源及特點(diǎn)，相應(yīng)增加種屬特異性病毒的檢測，如HEK293細(xì)胞來源于人，需增加對人的免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-Ⅰ）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、巨細(xì)胞病毒（HCMV）、EB病毒（EBV）、細(xì)小病毒（B19）、乳頭瘤病毒（HPV）等病毒的檢測。

1.2.3 生產(chǎn)工藝去除病毒能力的驗(yàn)證和評估

自我國生物制品生產(chǎn)實(shí)施GMP以來，企業(yè)加強(qiáng)了生產(chǎn)過程檢測及生產(chǎn)環(huán)境監(jiān)控，通過這一途徑污染外源因子的概率已大幅減少。但由于檢測方法存在局限性，要確保最終產(chǎn)品不存在外源因子污染，除直接檢測生產(chǎn)中間品和最終產(chǎn)品是否存在病毒外，還需驗(yàn)證生產(chǎn)工藝能清除和/或滅活病毒的能力。事實(shí)證明，曾發(fā)生的多起污染事例就是由使用了未被認(rèn)為或未被懷疑污染過的原材料而引發(fā)的。因此，有效評估生產(chǎn)工藝清除病毒的能力對于疫苗產(chǎn)品的安全性至關(guān)重要，病毒去除能力驗(yàn)證可確保有效去除一些未知、無法預(yù)料或有害的病毒。

針對采用動物細(xì)胞系生產(chǎn)的重組制品，考慮像昆蟲細(xì)胞系本身有可能存在未知病毒的感染風(fēng)險(xiǎn)，以及在生產(chǎn)傳代過程中外源病毒因子有可能會擴(kuò)增，生產(chǎn)過程需進(jìn)行病毒去除工藝驗(yàn)證來評估工藝對病毒的清除能力，降低外源因子污染的風(fēng)險(xiǎn)。對于重組病毒載體類疫苗及減毒活疫苗，因生產(chǎn)工藝不能采取特定的病毒去除工藝，外源因子質(zhì)控尤其需要重視從源頭細(xì)胞庫、毒種庫起始至工藝全過程的質(zhì)控，做到盡量不引入外源污染物，以及在生產(chǎn)各環(huán)節(jié)加強(qiáng)外源因子檢測，以確保產(chǎn)品整體外源因子風(fēng)險(xiǎn)可控。

2020年版《中國藥典（三部）》對生物制品病毒安全性控制有具體要求，對于采用非重組技術(shù)生產(chǎn)的滅活疫苗，生產(chǎn)工藝針對目標(biāo)病毒的滅活處理和驗(yàn)證需按具體品種的相關(guān)要求執(zhí)行。對于重組病毒載體類疫苗，應(yīng)建立與病毒載體特性及生產(chǎn)工藝特點(diǎn)相適應(yīng)的病毒風(fēng)險(xiǎn)評估和控制要求，如對于非復(fù)制型病毒載體生產(chǎn)過程，應(yīng)關(guān)注生產(chǎn)中產(chǎn)生復(fù)制型病毒的風(fēng)險(xiǎn)，復(fù)制型病毒載體生產(chǎn)應(yīng)關(guān)注產(chǎn)生野生型病毒的風(fēng)險(xiǎn)，如可行，應(yīng)評估病毒載體類疫苗純化工藝對相應(yīng)病毒的清除能力。

生物制品制備過程中包含的理化工藝步驟可能具有一定的病毒清除作用，通過工藝驗(yàn)證生產(chǎn)工藝對潛在病毒污染的整體清除作用。但當(dāng)產(chǎn)品制備工藝不足以達(dá)到有效清除病毒、控制產(chǎn)品病毒安全性的目的時(shí)，應(yīng)在生產(chǎn)過程增加特定的病毒清除工藝去除潛在的病毒。根據(jù)產(chǎn)品的特點(diǎn)設(shè)計(jì)工藝步驟和具體參數(shù)，建議設(shè)計(jì)采用不同原理、不同機(jī)制的病毒去除步驟，疫苗常用的病毒去除工藝有膜過濾法、低pH孵育法和色譜法等。某些特定病毒去除工藝可能對生物制品活性成分產(chǎn)生影響，導(dǎo)致活性成分的降解、聚合或結(jié)構(gòu)改變等，應(yīng)評估病毒去除工藝的參數(shù)條件對產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性的影響。

根據(jù)去除工藝的特點(diǎn)，選擇合適的模型病毒用于病毒清除研究。常用的模型病毒有異嗜性小鼠白血病病毒（XMuLV）、鼠細(xì)小病毒（PPV）等，XMuLV屬逆轉(zhuǎn)錄病毒，單鏈RNA有包膜病毒，直徑80～110 nm，理化耐受性較低。PPV屬細(xì)小病毒，單鏈DNA無包膜病毒，直徑18～24 nm，理化耐受性較高。另外還有偽狂犬病病毒（PRV）和呼腸弧病毒3型（Reo-3），分屬皰疹病毒和呼腸弧病毒，以及雙鏈DNA的有包膜病毒和無包膜病毒，理化耐受性均為中度。如采用低pH病毒滅活工藝，建議選擇有包膜的、對理化條件耐受能力強(qiáng)/范圍廣的病毒種類，如PRV、水皰性口炎病毒（VSV）；對于納濾步驟，建議選擇PPV這類粒徑小的模型病毒。

病毒去除/滅活工藝驗(yàn)證研究通常是在模擬實(shí)際生產(chǎn)工藝的縮小規(guī)模條件下開展，考慮的因素應(yīng)盡可能反映實(shí)際生產(chǎn)過程，說明其合理性和代表性。具體應(yīng)考慮縮小規(guī)模與實(shí)際生產(chǎn)規(guī)模下各工藝參數(shù)的可比性或代表性，如緩沖液的選擇，柱層析的柱高、流速、pH、蛋白濃度、鹽濃度，納濾膜的材質(zhì)和孔徑大小等，以及目標(biāo)產(chǎn)品應(yīng)能代表實(shí)際的生產(chǎn)規(guī)模水平。具體如層析柱直徑和柱體積可按比例縮小，但流穿或洗脫曲線應(yīng)具有類似性，還可采用聚丙烯酰凝膠電泳（SDS-PAGE）和免疫印跡等方法檢測兩種規(guī)模下目的蛋白純度等關(guān)鍵質(zhì)量屬性是否可比。病毒過濾則要求過濾器保持同類型、同品牌，跨膜壓力/流量，以及在面積校正后的總上樣體積應(yīng)代表實(shí)際生產(chǎn)規(guī)模水平，濾膜面積可按比例縮小。驗(yàn)證工藝和實(shí)際生產(chǎn)情況的差異難以避免，但應(yīng)分析這種差異對驗(yàn)證結(jié)果的影響。

病毒去除能力驗(yàn)證是針對細(xì)胞及發(fā)酵收獲液檢測存在的病毒量，評估各工藝步驟去除病毒的能力，定量評估純化工藝的總體病毒清除水平。一般有效病毒清除步驟對病毒清除下降因子應(yīng)大于等于4 log；如下降因子＜4 log，應(yīng)盲傳3代，如無病毒檢出，可認(rèn)定為有效病毒清除工藝；但病毒清除下降因子≤1 log，則為無效病毒清除步驟。2020年版《中國藥典（三部）》對生物制品病毒安全性控制強(qiáng)調(diào)，下降因子對數(shù)減少值不應(yīng)作為病毒清除步驟有效性的絕對指標(biāo)，還應(yīng)考慮如指示病毒的適合性、病毒清除研究的設(shè)計(jì)、有效步驟或整體工藝病毒清除下降因子、滅活速率、清除工藝的影響因素、病毒檢測方法的靈敏度等。當(dāng)生產(chǎn)工藝發(fā)生變更時(shí)，需要重新評估工藝對病毒清除的影響，根據(jù)影響程度，對病毒清除步驟進(jìn)行必要的再驗(yàn)證。即當(dāng)病毒清除步驟的關(guān)鍵工藝參數(shù)如層析步驟的樹脂類型及品牌、柱床高度、流速發(fā)生變更時(shí)，病毒過濾步驟的過濾器類型及品牌、跨膜壓力/流量發(fā)生變更時(shí)，應(yīng)重新開展病毒清除研究。

1.2.4 生產(chǎn)中間品及產(chǎn)品的外源因子檢測及安全性風(fēng)險(xiǎn)

外源因子檢測必須基于風(fēng)險(xiǎn)評估，除盡量確保生產(chǎn)過程中不引入外源病毒，如人員、設(shè)備、廠房設(shè)計(jì)及環(huán)境條件應(yīng)符合GMP相關(guān)要求外，病毒檢測方案應(yīng)覆蓋毒種庫、藥品生產(chǎn)的各個(gè)階段到終產(chǎn)品的整個(gè)過程。《中國藥典》、ICH Q5A要求、生物制品評價(jià)與研究中心（CBER）監(jiān)管指南均建議，在生產(chǎn)中的適當(dāng)步驟，生產(chǎn)中間品（如收獲液、純化液、原液等）和最終產(chǎn)品中進(jìn)行外源因子檢測［7］，尤其在最有可能檢測到污染物的生產(chǎn)環(huán)節(jié)進(jìn)行相關(guān)檢測。

外源因子檢測方法應(yīng)根據(jù)外源因子、不同細(xì)胞基質(zhì)的來源和歷史來確定［7］。病毒污染檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性與污染來源、污染病毒的特性、生產(chǎn)工藝等密切相關(guān)，應(yīng)綜合上述因素對生產(chǎn)過程中最適階段的中間產(chǎn)物或成品進(jìn)行取樣和檢測，并考慮檢測病毒的種類、頻率和方法。對于檢出外源病毒污染的情況，應(yīng)查找并確認(rèn)污染來源，采取適當(dāng)防控措施。ICH Q5A要求建議在最適合檢測出病毒污染的未加工的發(fā)酵收獲液階段進(jìn)行外源因子檢測，一般使用一種或幾種細(xì)胞系進(jìn)行體外篩查試驗(yàn)或適用的PCR法等，要求已測出外源病毒的未加工品不得用于生產(chǎn)，并應(yīng)分析污染原因及防控措施。

對于逆轉(zhuǎn)錄病毒和其他內(nèi)源性病毒，現(xiàn)有法規(guī)要求的外源因子檢測可采用感染性試驗(yàn)、電鏡檢測、逆轉(zhuǎn)錄酶和其他病毒特異性試驗(yàn)。針對外源性病毒檢測，除可采用體內(nèi)法、體外法、血吸附法、種屬特異性病毒檢測外，還可開展抗體產(chǎn)生試驗(yàn)等。

基因測序、PCR技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)等分子生物學(xué)技術(shù)在檢測和發(fā)現(xiàn)新的外源因子方面的應(yīng)用已取得顯著效果，如采用新一代大規(guī)模平行測序（MPS）技術(shù)在血清和組織中發(fā)現(xiàn)新病毒［8］，在已上市疫苗中檢測到豬圓環(huán)病毒（PCV）污染。目前深度測序（NGS）技術(shù)已廣泛應(yīng)用于疫苗、細(xì)胞系、血清及收獲物的外源因子檢測，尤其針對細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)、外源病毒因子檢測并分析其對人類的致病性。此外，NGS技術(shù)不僅可檢測DNA或RNA樣本，還可檢測非細(xì)胞病變的外源因子，且檢測的靈敏度可通過測序深度進(jìn)行推測和控制［9］。除NGS技術(shù)外，其他新技術(shù)的出現(xiàn)，如通過PCR-電噴霧電離（ESI）質(zhì)譜技術(shù)（PCR-ESI/MS，Plex-ID）在Vero細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)藍(lán)舌病毒，以及微陣列等技術(shù)的運(yùn)用，均可提高外源因子檢測的靈敏度［10］，利于外源因子風(fēng)險(xiǎn)的質(zhì)控?！癐CH Q5A要求”歡迎生產(chǎn)商與監(jiān)管部門討論采用先進(jìn)檢測方法如第2代、第3代NGS技術(shù)檢測內(nèi)、外源病毒。但如果NGS測序結(jié)果為陽性，則還需采用法規(guī)要求的外源因子檢測方法進(jìn)行確認(rèn)。

為提高病毒檢出率，建議盡量采用先進(jìn)檢測方法，但需對新方法的特異性、靈敏度、精密度等進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。病毒檢測陰性也不能完全證明無病毒污染，應(yīng)排除因取樣量不足、病毒含量低于檢測方法的靈敏度、檢測方法不適用等導(dǎo)致病毒檢測結(jié)果陰性的情況。

2 疫苗產(chǎn)品全生命周期外源因子安全性風(fēng)險(xiǎn)評估及質(zhì)控

2.1 上市后的安全性質(zhì)控

隨著先進(jìn)檢測技術(shù)的應(yīng)用及上市產(chǎn)品使用范圍的進(jìn)一步擴(kuò)大，如監(jiān)測到新病毒，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行分析和評估，制定疫苗產(chǎn)品外源因子安全性風(fēng)險(xiǎn)評估及控制策略。2020年版《中國藥典（三部）》提出，對生物制品病毒安全性控制除應(yīng)體現(xiàn)在生物制品質(zhì)量控制的全過程以外，還應(yīng)體現(xiàn)在產(chǎn)品的全生命周期管理中，即必要時(shí)應(yīng)通過上市后監(jiān)測追溯產(chǎn)品的病毒安全性，保證生物制品全生命周期的病毒安全性質(zhì)控。

隨著科技的進(jìn)步，先進(jìn)檢測技術(shù)檢測到了未曾發(fā)現(xiàn)的外源因子，如20世紀(jì)60年代在脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗中發(fā)現(xiàn)SV40和在黃熱病疫苗中發(fā)現(xiàn)禽白血病病毒，PCV的污染事件等。如2010年在已上市的輪狀病毒疫苗（RV）中檢測到PCV-1型的DNA片段［11］，F(xiàn)DA隨即要求暫停該疫苗的生產(chǎn)，并對疫苗病毒安全性問題進(jìn)行研究，分析PCV核酸片段的存在對疫苗使用造成的風(fēng)險(xiǎn)，經(jīng)研究，該外源病毒污染主要發(fā)生在疫苗生產(chǎn)的初始階段，PCV DNA存在非常廣泛［12-13］，將該病毒DNA接種于豬黏膜，可得到可復(fù)制的病毒顆粒［14］，但尚無證據(jù)證明PCV對人類具有致病性。FDA通過科學(xué)研究并綜合評估風(fēng)險(xiǎn)，討論P(yáng)CV的存在對疫苗使用造成的風(fēng)險(xiǎn)，以及應(yīng)對風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)采取的措施，重點(diǎn)分析了PCV DNA的來源、PCV對人類是否致病、疫苗中是否存在完整的PCV DNA序列和病毒樣顆粒、疫苗中如果含有活性PCV是否造成人類感染等安全性問題。同時(shí)，F(xiàn)DA與廠商繼續(xù)深入調(diào)查、評價(jià)檢測結(jié)果，RV疫苗中PCV DNA的確切來源不明，推測可能來自細(xì)胞傳代過程中使用的豬源性胰酶，這對疫苗原材料的安全性提出了更高要求［15］。目前，GSK公司已按國外監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求成功開發(fā)出PCV DNA陰性的輪狀病毒疫苗，并于2020年8月經(jīng)FDA批準(zhǔn)在說明書中明確其已去除PCV DNA。

2.2 法規(guī)及監(jiān)管的要求

WHO 2015年頒布的《上市疫苗中發(fā)現(xiàn)外源因子的風(fēng)險(xiǎn)評估指導(dǎo)原則》提出，監(jiān)管當(dāng)局需考慮，健康人用疫苗中如發(fā)現(xiàn)潛在外源因子污染，可能會帶來嚴(yán)重不良事件，但另一方面，由于擔(dān)心外源因子污染導(dǎo)致不良反應(yīng)而過早撤回疫苗，又可能會影響疫苗的可及性，帶來未免疫人群的疾病暴發(fā)。因此，監(jiān)管當(dāng)局應(yīng)就新發(fā)現(xiàn)的病毒外源因子進(jìn)行以下科學(xué)研究及風(fēng)險(xiǎn)評估。1）外源因子是如何檢測的：檢測識別潛在病原體方法的敏感性、特異性和有效性。2）對產(chǎn)品有何認(rèn)知：是否是未知的外源病毒因子，臨床和非臨床是否有上市后和藥物警戒數(shù)據(jù)等相關(guān)安全性數(shù)據(jù)。評估疫苗是否存在相關(guān)潛在風(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要，流行病學(xué)也可為風(fēng)險(xiǎn)評估提供相關(guān)信息。3）是在哪個(gè)階段檢測到的外源因子：如是在上游細(xì)胞庫、毒種庫，生產(chǎn)過程的中間品，還是在終產(chǎn)品中檢測到，生產(chǎn)過程中的純化或病毒去除步驟是否對最終產(chǎn)品帶來風(fēng)險(xiǎn)。4）檢測到外源因子的存在形式：風(fēng)險(xiǎn)主要取決于其存在形式（如是核酸形式還是完整的病毒顆粒），是否對人類具有感染性和致病性。基于以上研究，結(jié)合流行病學(xué)、疫苗可及性、監(jiān)管法規(guī)等綜合考慮，重新作出風(fēng)險(xiǎn)、獲益評估。

我國監(jiān)管法規(guī)同樣要求，疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)及菌毒種不應(yīng)有外源因子的污染，既往帶有外源因子污染風(fēng)險(xiǎn)的品種均未獲得批準(zhǔn)。2020年版《中國藥典（三部）》要求若細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測為陽性，則需進(jìn)行電鏡檢查或PCR法及感染性試驗(yàn)，以確證是否存在感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，產(chǎn)生感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，且下游工藝不能證明病毒被清除的細(xì)胞基質(zhì)不得用于生產(chǎn)。針對產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)的外源因子安全性風(fēng)險(xiǎn)問題，建議企業(yè)應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)外源因子污染的時(shí)間、污染發(fā)生的原因，并關(guān)注細(xì)胞庫、毒種庫中外源病毒的存在形式，建議企業(yè)跟蹤生產(chǎn)過程中外源因子的去除情況，加強(qiáng)對細(xì)胞庫、毒種庫及生產(chǎn)過程中間品的外源因子檢測，監(jiān)測基因轉(zhuǎn)錄元件是否會組裝成完整的病毒顆粒，以及該病毒顆粒對人類的感染性及致病性等，最終確保疫苗產(chǎn)品外源因子安全性風(fēng)險(xiǎn)整體可控。

3 結(jié)語

研究者和監(jiān)管部門應(yīng)根據(jù)有關(guān)法規(guī)及指導(dǎo)原則的要求，對疫苗生產(chǎn)用不同來源細(xì)胞基質(zhì)及生產(chǎn)過程進(jìn)行外源因子安全性評價(jià)，科學(xué)分析和深入探討近年來監(jiān)測到的外源因子對疫苗產(chǎn)品帶來的安全性風(fēng)險(xiǎn)，制訂風(fēng)險(xiǎn)防控措施，對疫苗生產(chǎn)全過程及產(chǎn)品全生命周期管理做好外源因子風(fēng)險(xiǎn)評估及質(zhì)控，并進(jìn)一步探索先進(jìn)技術(shù)的應(yīng)用。本研究可望為研究者、生產(chǎn)企業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)提供一定借鑒。