麻風(fēng)免疫診斷標(biāo)記物研究進(jìn)展

彭嘉怡 王洪生 余美文

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院，南京，210042

麻風(fēng)是由麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacteriumleprae, ML)引起的慢性傳染性疾病，主要侵犯皮膚、黏膜及周圍神經(jīng)，若未及時(shí)診斷及治療，可導(dǎo)致畸殘。目前麻風(fēng)免疫診斷主要包括血清抗體、細(xì)胞因子水平檢測(cè)。microRNA參與麻風(fēng)分枝桿菌感染機(jī)體的免疫微環(huán)境，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌。其表達(dá)水平亦具有診斷價(jià)值。免疫標(biāo)記物的具體臨床應(yīng)用及何種抗原及檢測(cè)方法的敏感性和特異性更佳，一直是研究焦點(diǎn)。本文對(duì)血清學(xué)試驗(yàn)相關(guān)抗原、實(shí)驗(yàn)方法及臨床應(yīng)用、細(xì)胞因子及miRNA生物標(biāo)記物近年來的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為后續(xù)有助于早期診斷麻風(fēng)的研究提供參考。

1 血清學(xué)試驗(yàn)

1.1 血清學(xué)抗原

1.1.1 ML基因組詮釋前 1981年首次發(fā)現(xiàn)酚糖酯抗原(PGL-1)有助于區(qū)分麻風(fēng)分枝桿菌與其它分枝桿菌[1]。隨后，F(xiàn)ujiwara等[2]以PGL-1為底物，通過苯丙?；?Phenolic)或辛基(Octyl)將酚糖酯抗原的天然二糖(Natural Disaccharide)或三糖(Trisaccharide)結(jié)構(gòu)連接到小牛血清蛋白(BSA)或人血清蛋白(HSA)，形成如NDO-BSA、NT-O-BSA等半合成糖蛋白抗原，發(fā)現(xiàn)其具有更強(qiáng)的免疫原性。起初，臨床上主要使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)抗PGL-1抗體。蘸棒試驗(yàn)(dipstick assay)更為簡(jiǎn)便，其檢測(cè)結(jié)果與ELISA高度一致，為97.2%，兩者的血清陽性率亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[3]。2003年，一種新的橫向流測(cè)試驗(yàn)(Lateral Flow test)問世，與ELISA結(jié)果的一致性為91%，診斷多菌型麻風(fēng)的敏感性及特異性為97.4%及90.2%[4]。Van Hooij等[5]發(fā)現(xiàn)上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)側(cè)流免疫夾心法(UCP-LFA)的MB總體檢出率及敏感性較金側(cè)流免疫夾心法(GOLD-LFA)高。PGL-1仍是目前應(yīng)用最為廣泛的血清學(xué)抗原，血清學(xué)檢測(cè)相對(duì)無創(chuàng)，側(cè)流試驗(yàn)等檢測(cè)方法更是簡(jiǎn)便快捷，適用于現(xiàn)場(chǎng)開展，但尚不能有效取代皮膚活檢。

1.1.2 ML基因組詮釋后 2001年，Whitehead等[6]闡明了麻風(fēng)分枝桿菌的基因組序列特征，發(fā)現(xiàn)麻風(fēng)分枝桿菌基因組中僅有1604個(gè)(<50%)可編碼蛋白的功能性基因。隨著基因組時(shí)代的到來，在MB患者血清中發(fā)現(xiàn)越來越多重組蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體。

目前較為廣泛應(yīng)用的重組蛋白為Leprosy IDRI Diagnostic(LID-1)，由麻風(fēng)分枝桿菌抗原ML0405及ML2331融合形成，在癥狀尚未出現(xiàn)前6～8個(gè)月即可檢測(cè)到其抗體，因此其可早期診斷麻風(fēng)[7]。亦有研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合化療后血清抗LID-1抗體水平顯著下降，因此LID-1亦可用于療效評(píng)估[8]。Duthie等[9]研發(fā)了基于NDO-BSA及LID-1的融合蛋白NDO-LID的側(cè)流層析法。與PGL-1相比，NDO-LID的MB和PB患者檢出率及診斷特異性更高，檢出率分別為87%和81.7%，特異性為97.4%。Chen等[10]的研究發(fā)現(xiàn)NDO-LID快速試驗(yàn)敏感性高，而ELISA法特異性較高，治療前后NDO-LID抗體水平的差異表明其可輔助評(píng)估聯(lián)合化療效果。雖然NDO-LID已被證實(shí)在MB患者中有較高的血清學(xué)陽性率，Gomes等[11]發(fā)現(xiàn)女性、非棕色皮膚、生活在城鎮(zhèn)及和超過5個(gè)人同居均會(huì)影響抗NDO-LID抗體陽性率。但由于納入研究的樣本量小，仍需擴(kuò)大樣本及在不同地區(qū)及人群中驗(yàn)證上述因素與NDO-LID抗體陽性率的相關(guān)性。

1.2 血清學(xué)試驗(yàn)的臨床應(yīng)用 血清學(xué)檢測(cè)主要應(yīng)用于麻風(fēng)診斷、預(yù)測(cè)麻風(fēng)反應(yīng)、評(píng)估聯(lián)合化療效果、監(jiān)測(cè)普通人群及家庭內(nèi)接觸者。

1.2.1 用于麻風(fēng)診斷 目前血清學(xué)試驗(yàn)已廣泛應(yīng)用于診斷麻風(fēng)患者。Chen等[10]在我國云南麻風(fēng)高發(fā)區(qū)對(duì)83例麻風(fēng)患者及161名非麻風(fēng)對(duì)照組人群的研究中發(fā)現(xiàn)，NDO-LID快速試驗(yàn)及LID-1、NDO-LID及NDO-BSA的ELISA在MB患者中的陽性應(yīng)答率均高于PB患者。其中NDO-LID快速實(shí)驗(yàn)的MB患者陽性應(yīng)答率最高，為94.7%，敏感性較ELISA高而特異性較低。Mar?al等[12]亦發(fā)現(xiàn)MB患者中抗NDO-HSA的IgM抗體、抗LID-1的IgG抗體及抗NDO-LID的IgG/M抗體滴度顯著增加，其中LID-1和NDO-LID的IgG1亞型血清學(xué)試驗(yàn)的診斷性能較佳。Wang等[13]發(fā)現(xiàn)瘤型麻風(fēng)(LL)患者NDO-BSA、主要膜蛋白II(Major membrane protein II,MMP-II)及LID-1血清陽性率分別為78.7%、59.3%及71.7%。三種抗原兩兩組合的血清學(xué)試驗(yàn)中，NDO-BSA和LID-1的血清陽性率最高，為86.3%,表明多抗原聯(lián)合的血清學(xué)試驗(yàn)可應(yīng)用于麻風(fēng)早期診斷及監(jiān)測(cè)。重組抗原可提高血清學(xué)診斷的敏感性及特異性，尚需進(jìn)一步研發(fā)新的具有較高敏感性及特異性的重組蛋白。

1.2.2 預(yù)測(cè)麻風(fēng)反應(yīng) 麻風(fēng)反應(yīng)分為I型麻風(fēng)反應(yīng)，即逆向反應(yīng)(RR)和II型麻風(fēng)反應(yīng)，即麻風(fēng)性結(jié)節(jié)性紅斑(ENL)。Hungria等[14]對(duì)452例無麻風(fēng)反應(yīng)的麻風(fēng)患者進(jìn)行研究，并用ELISA檢測(cè)其抗PGL-1、抗LID-1及抗ND-O-LID的IgM和IgG抗體滴度。其中36%患者在隨訪期間發(fā)生麻風(fēng)反應(yīng)，26%的患者發(fā)生RR和10%的患有ENL。盡管其抗PGL-1抗體水平較無麻風(fēng)反應(yīng)的高，PGL-1血清學(xué)試驗(yàn)預(yù)測(cè)RR價(jià)值有限。而LID-1血清學(xué)試驗(yàn)可預(yù)測(cè)查菌陽性患者ENL的發(fā)生。Serrano-Coll等[15]研究納入麻風(fēng)反應(yīng)患者及非麻風(fēng)反應(yīng)患者各40例，檢測(cè)其血清中抗NDO-LID的IgG及IgM抗體，結(jié)果顯示有麻風(fēng)反應(yīng)的患者抗NDO-LID的IgM及IgG抗體陽性率分別為52.5%及60%,均高于無麻風(fēng)反應(yīng)患者。因此，抗NDO-LID抗體可輔助預(yù)測(cè)麻風(fēng)反應(yīng)的發(fā)生。Devides等[16]納入224例麻風(fēng)患者，其中61例患有RR及12例患有ENL，隨訪5年期間有29例患者發(fā)生麻風(fēng)反應(yīng)。檢測(cè)其抗PGL-1及抗NDO-LID-1抗體水平，發(fā)現(xiàn)非麻風(fēng)反應(yīng)患者抗PGL-1及抗NDO-LID抗體陽性率分別為19.2%及32.4%，RR患者的PGL-1及NDO-LID-1抗體陽性率分別為27.8%和50.8%，而ENL患者的PGL-1和NDO-LID-1抗體陽性率為66.6%和91.6%。本研究提示抗PGL-1及抗NDO-LID-1血清學(xué)試驗(yàn)有助診斷ENL，而NDO-LID-1的價(jià)值更佳。Duthie等[17]發(fā)現(xiàn)ENL患者抗NDO-LID抗體陽性率高于無麻風(fēng)反應(yīng)及RR患者。盡管較高的初始NDO-LID抗體水平是ENL發(fā)生的危險(xiǎn)因素，但NDO-LID的快速檢測(cè)方法及ELISA法均不能有效預(yù)測(cè)麻風(fēng)反應(yīng)發(fā)生的時(shí)間。

1.2.3 評(píng)估療效 Hungria等[18]納入263例MB患者，其中142例MB患者給予6個(gè)月聯(lián)合化療，另外121例給予12個(gè)月聯(lián)合化療，結(jié)果顯示兩組麻風(fēng)患者治療期間及治療后抗PGL-1及抗NDO-LID抗體水平均下降，表明麻風(fēng)特異性血清抗體滴度可反映聯(lián)合化療效果。

1.2.4 監(jiān)測(cè)家庭接觸者(HHCs) HHCs患麻風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)顯著高于普通人群[13]。Do Carmo Gon?alves等[19]納入64名家庭內(nèi)密切接觸者及1623名家庭周圍接觸者，發(fā)現(xiàn)家庭內(nèi)密切接觸者NDO-LID血清學(xué)陽性率為3.7%，高于家庭周圍接觸者。此外，家庭內(nèi)接觸者麻風(fēng)患病率亦顯著高于家庭周圍接觸者。血清學(xué)陽性提示密切接觸人群有較高患病風(fēng)險(xiǎn)。然而，Richardus等[20]檢測(cè)隨訪期間25例患麻風(fēng)及199名未患麻風(fēng)的接觸者的抗PGL-1抗體水平，結(jié)果提示兩組間抗體水平無顯著性差異。此外，麻風(fēng)患者接觸者患麻風(fēng)前后的抗PGL-1抗體水平無顯著性差異，因此，PGL-1血清學(xué)試驗(yàn)并不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)麻風(fēng)患者接觸者的發(fā)病。

2 細(xì)胞因子

2.1 Th細(xì)胞亞群相關(guān)細(xì)胞因子 麻風(fēng)感染相關(guān)細(xì)胞因子主要為白細(xì)胞介素(IL)、γ干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子(TNF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，參與麻風(fēng)免疫病理機(jī)制。麻風(fēng)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)由輔助性T細(xì)胞介導(dǎo)，包括Th1、Th2、Treg、Th17、Th9等。IFN-γ主要由Th1細(xì)胞表達(dá)，在結(jié)核型麻風(fēng)患者中占主導(dǎo)。一項(xiàng)納入了38例MB及23例PB麻風(fēng)患者的研究中，PB患者外周血中IFN-γ陽性應(yīng)答率高于MB患者，推斷IFN-γ可用于鑒別PB和MB[10]。Th2細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10及TGF-β等細(xì)胞因子，主要參與瘤型麻風(fēng)的發(fā)病機(jī)制。Mar?al等[21]納入19例患者誘導(dǎo)其外周血單核細(xì)胞(PBMC)分化并檢測(cè)分泌IFN-γ、IL-4及IL-10的細(xì)胞亞群數(shù)。在MB患者中，Th細(xì)胞主要為介導(dǎo)IL-10及IL-4產(chǎn)生的Th2細(xì)胞亞群，而IFN-γ表達(dá)微弱。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)分泌TGF-β及IL-10。Treg可通過介導(dǎo)TGF-β表達(dá)下調(diào)T細(xì)胞反應(yīng)導(dǎo)致瘤型麻風(fēng)的免疫應(yīng)答無能。與結(jié)核型麻風(fēng)(TT)患者相比，瘤型麻風(fēng)(LL)患者皮損及PBMC中TGF-β及IL-10表達(dá)水平升高。此外，瘤型麻風(fēng)患者中體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg細(xì)胞數(shù)較結(jié)核型麻風(fēng)患者高。此前研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞亦參與麻風(fēng)感染[22]。IL-17由Th17分泌，在瘤型麻風(fēng)患者皮損中高表達(dá)。Santos等[23]納入28例MB及PB患者檢測(cè)其皮損、血清中IL-17A表達(dá)水平，并用流式細(xì)胞術(shù)分析表達(dá)IL-17A的細(xì)胞表型，發(fā)現(xiàn)TT患者皮損中表達(dá)IL-17A的CD4+T細(xì)胞多于LL患者，PB患者血清中的IL-17A濃度較MB患者高。

2.2 細(xì)胞因子檢測(cè)的臨床應(yīng)用 與血清學(xué)試驗(yàn)相似，因其差異性表達(dá)，細(xì)胞因子檢測(cè)亦可應(yīng)用于麻風(fēng)分型、預(yù)測(cè)麻風(fēng)反應(yīng)、監(jiān)測(cè)療效及家庭內(nèi)接觸者。

2.2.1 麻風(fēng)分型及預(yù)測(cè)麻風(fēng)反應(yīng) 不同的Th細(xì)胞亞群共同參與麻風(fēng)的免疫病理機(jī)制，決定了麻風(fēng)感染的臨床表型。一項(xiàng)綜合分析多個(gè)細(xì)胞因子表達(dá)的研究中，Azevedo等[24]用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)檢測(cè)87例麻風(fēng)患者皮損Th1、Th2、Th17及Tregs譜相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)，ELISA檢測(cè)其在血清中表達(dá)水平。Th1相關(guān)靶標(biāo)(mRNA)在結(jié)核樣型和界限類偏結(jié)核型麻風(fēng)患者中占主導(dǎo)，而Th2和Tregs靶向物在瘤型和界限類偏瘤型麻風(fēng)患者中占主導(dǎo)。麻風(fēng)患者血清中IL-22、IL-6、IL-10表達(dá)較對(duì)照組高，LL中的IL-10較高。RR中，Treg相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平下降，而IL-15增加。ENL中，IL-17F及IL-8表達(dá)增加。亦有研究發(fā)現(xiàn)伴神經(jīng)痛的麻風(fēng)神經(jīng)病變患者中IL-1β、TNF、TGF-β和IL-17水平較高，IL-1β水平是與麻風(fēng)神經(jīng)病變患者合并神經(jīng)痛相關(guān)的獨(dú)立變量，可成為隨訪的重要生物標(biāo)記物[25]。

2.2.2 監(jiān)測(cè)療效 Cassirer-Costa等[26]用微量樣本多指標(biāo)流式蛋白定量技術(shù)(CBA)檢測(cè)10例結(jié)核型麻風(fēng)及14例瘤型麻風(fēng)患者聯(lián)合化療前后血液中IL-1β、IL-8、TNF、IL-12p70、IFN-γ、IL-17A、IL-13及IL-10水平。其中，瘤型麻風(fēng)患者治療前炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平較高，而結(jié)核樣型麻風(fēng)患者治療前炎癥細(xì)胞因子及調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子維持平衡。細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)證實(shí)，聯(lián)合化療改變了麻風(fēng)患者尤其是結(jié)核樣型麻風(fēng)患者血清細(xì)胞因子的分布特征，瘤型麻風(fēng)患者細(xì)胞因子體系特征為炎癥/調(diào)節(jié)分子的強(qiáng)連接軸。因此，細(xì)胞因子可作為評(píng)估聯(lián)合化療效果的生物標(biāo)記物。Negera等[27]納入30例ENL患者比較激素治療前后炎癥細(xì)胞因子及調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子的表達(dá)。治療前的ENL患者TNF、IFN-γ、IL-1β及IL-17A水平顯著增高。IL-10在治療前顯著降低，而在治療后顯著升高。ENL患者TNF、IFN-γ、IL-1β及IL-17A、IL-6的mRNA表達(dá)治療后顯著降低。而皮損及血清中的IL-10及TGF-β的mRNA表達(dá)水平在治療后均顯著降低。該研究表明，激素可通過直接或間接抑制炎癥細(xì)胞因子表達(dá)相關(guān)的免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

2.2.3 監(jiān)測(cè)HHCs Queiroz等[28]納入18例PB麻風(fēng)患者、58例MB麻風(fēng)患者及112名家庭接觸者，檢測(cè)其外周血中的細(xì)胞因子和趨化因子，發(fā)現(xiàn)隨訪期間趨化因子2(CCL-2)在HHCs及PB麻風(fēng)患者中表達(dá)較高。此外，CCL-2及IFN-γ呈負(fù)相關(guān)。因此，CCL-2及IFN-γ可能成為識(shí)別HHC亞臨床感染的潛在生物標(biāo)記物。

3 microRNA

3.1 microRNA參與麻風(fēng)發(fā)病機(jī)制 microRNAs(miRNAs)是非編碼RNA，部分miRNAs僅在麻風(fēng)中表達(dá)，從轉(zhuǎn)錄層面調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，在麻風(fēng)發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[29,30]。Salgado等[30]通過比較28例麻風(fēng)患者miRNAs在皮損及血液中的差異化表達(dá)發(fā)現(xiàn)miRNAs標(biāo)記物參與調(diào)節(jié)結(jié)核樣型麻風(fēng)患者中的防御性免疫反應(yīng)及瘤型麻風(fēng)患者中的免疫抑制性反應(yīng)。此外，miRNA在麻風(fēng)感染中免疫系統(tǒng)調(diào)控、細(xì)胞凋亡、施旺細(xì)胞脫髓鞘、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及神經(jīng)痛中發(fā)揮作用。Liu等[29]發(fā)現(xiàn)13種miRNAs在瘤型麻風(fēng)及結(jié)核樣型麻風(fēng)患者中表達(dá)存在差異。其中，瘤型麻風(fēng)患者皮損中差異最顯著的hsa-mir-21在麻風(fēng)菌刺激的單核巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。其通過直接下調(diào)Toll樣受體2/1(TLR2/1)介導(dǎo)的25-羥基維生素D-1α-羥化酶(CYP27B1)及IL-1B表達(dá)及間接下調(diào)IL-10抑制VitD依賴的抗菌肽CAMP及DEFB4AmRNA的表達(dá)。

3.2 microRNA臨床應(yīng)用 與血清學(xué)抗體、細(xì)胞因子不同，microRNA在麻風(fēng)臨床應(yīng)用較少，僅有少量研究表明部分microRNA可應(yīng)用于麻風(fēng)診斷及分型。Soares等[31]發(fā)現(xiàn)miRNA-21在麻風(fēng)及麻風(fēng)反應(yīng)患者中表達(dá)上調(diào)。與結(jié)核樣型麻風(fēng)和RR麻風(fēng)患者相比，瘤型麻風(fēng)和ENL麻風(fēng)患者中miRNA-21表達(dá)水平更高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測(cè)microRNA有可能用于區(qū)分瘤型及結(jié)核樣型麻風(fēng)，但尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。Jorge等[32]用TaqMan低密度陣列方法(TLDA)分析瘤型麻風(fēng)患者、結(jié)核型麻風(fēng)患者及健康對(duì)照組的377種microRNAs的表達(dá)水平，隨后用qRT-PCR驗(yàn)證16種差異表達(dá)的miRNAs，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合4種miRNAs檢測(cè)，包括miR-101、miR-196b、miR-27b及miR-29c可進(jìn)行麻風(fēng)診斷，其敏感性及特異性分別為80%、91%。此外，其亦可用于區(qū)分瘤型麻風(fēng)及結(jié)核樣型麻風(fēng)患者，敏感性及特異性為83%及80%。即使單個(gè)microRNA并不具有診斷價(jià)值，若聯(lián)合其它microRNA標(biāo)記物亦可用于麻風(fēng)診斷及分型，但目前關(guān)于驗(yàn)證microRNA診斷潛能的相關(guān)研究較少，其敏感性及特異性尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，目前尚未有研究探討microRNA在療效評(píng)估、HHC監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用，其它非編碼RNA如lncRNA、piRNA在麻風(fēng)中的表達(dá)水平、麻風(fēng)發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮的作用仍有待探究。因此，未來研究需聚焦于microRNA在麻風(fēng)中的臨床應(yīng)用，除microRNA外其它非編碼RNA在麻風(fēng)中的表達(dá)和作用。

4 結(jié)語

綜上所述，血清學(xué)檢測(cè)、細(xì)胞因子及microRNA標(biāo)記物均可應(yīng)用于輔助麻風(fēng)的早期診斷，同時(shí)有助于不同型別麻風(fēng)的區(qū)分、預(yù)測(cè)麻風(fēng)反應(yīng)、評(píng)估療效及監(jiān)測(cè)HHCs。但重組抗原如NDO-LID血清學(xué)試驗(yàn)敏感性及特異性有待提高，細(xì)胞因子相關(guān)診斷性方法的敏感性及特異性研究較少。因此，未來需挖掘更多麻風(fēng)特異性抗原、更多特異性細(xì)胞因子進(jìn)行麻風(fēng)診斷、某種或某些穩(wěn)定表達(dá)的miRNA，以及其他非編碼RNA在皮損組織乃至血液中的試驗(yàn)應(yīng)用，以期尋找操作性強(qiáng)、普及性廣、敏感性和特異性較高的麻風(fēng)免疫診斷標(biāo)志物。