柑橘果實(shí)中酚酸類化合物研究進(jìn)展

徐程楠 王天玉 姚周麟 張偉清 馮先橘 林 媚

（浙江省柑橘研究所 臺州 318026）

柑橘是世界上種植最多的水果之一，廣泛地分布于熱帶、亞熱帶和溫帶區(qū)域，主要包括甜橙類、寬皮柑橘類、葡萄柚和柚類、檸檬類、雜柑類和金柑類等[1]。我國是世界柑橘生產(chǎn)大國，2019年柑橘種植面積為2.61×106hm2，產(chǎn)量高達(dá)4.58×107t[2]。我國柑橘類水果消費(fèi)以鮮食為主，部分以罐頭、果汁形式進(jìn)行加工。柑橘果實(shí)中富含對人體健康有益的活性成分和抗氧化物質(zhì)如維生素、礦物質(zhì)、酚類、萜類等[3]。酚酸類化合物是其中普遍存在的次生代謝產(chǎn)物，是酚類物質(zhì)其中一類，其在植物體內(nèi)主要由糖酵解及磷酸戊糖途徑生成的中間體經(jīng)莽草酸途徑和苯丙烷類代謝途徑合成[4,5]。大量研究表明酚酸類化合物對人體具有抗氧化、抗癌、抗菌等功效。因此，明確柑橘果實(shí)中酚酸類化合物的組成、分布、生物活性以及提取檢測方法，以期實(shí)現(xiàn)柑橘果實(shí)的針對性開發(fā)利用，提高其附加值，同時，為合理利用柑橘資源、豐富柑橘營養(yǎng)與保健研究提供參考依據(jù)。

1 柑橘果實(shí)中酚酸類化合物組成與分布

酚酸類化合物[6]是指同一苯環(huán)上含有若干酚羥基的一類化合物，其在柑橘組織中主要以有機(jī)酸、糖類以及各種酯類形式存在，極少部分為游離態(tài)。按其碳骨架結(jié)構(gòu)主要可分為苯甲酸型（C6-C1型）和肉桂酸型（或苯乙烯型，C6-C3），但也有如綠原酸和香草醛等少部分酚酸結(jié)構(gòu)不屬于上述兩類衍生物[7]。據(jù)徐貴華等[8]對不同成熟期蜜橘中酚酸的組成研究表明柑橘果實(shí)中酚酸類化合物結(jié)構(gòu)以肉桂酸型為主，苯甲酸型含量較少。目前可檢出的酚酸類化合物[9,10]主要為：（1）肉桂酸型：咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸、苯乙烯酸；（2）苯甲酸型：原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸、沒食子酸、丁香酸、水楊酸、龍膽酸；（3）其他：綠原酸等。

柑橘果實(shí)中酚酸類物質(zhì)的組成及含量隨成熟度變化而不同，董昕穎[11]分析了不同采收期尤力克檸檬果實(shí)的營養(yǎng)品質(zhì)，結(jié)果表明酚酸總體含量隨成熟度增加而下降，且果肉與果皮中酚酸含量達(dá)到最高的時期，分別為4月和6月。徐桂華等[8,12]對不同成熟期溫州蜜橘、椪柑和胡柚的酚酸組成與分布進(jìn)行了研究也得到類似結(jié)論，酚酸含量在果肉中隨成熟度提高而減少，而果皮在半成熟期達(dá)到最高；此外，隨著成熟度提高，果實(shí)中自由酚酸含量則持續(xù)下降，其中綠原酸和阿魏酸在檢出的酚酸中含量最高。

同時，酚酸類化合物在柑橘果實(shí)各部位間分布也存在較大差異，一般而言果皮中酚酸含量高于果肉和種子，其在柑橘果皮中主要以可溶性酚酸形式存在，且肉桂酸型含量高于苯甲酸型，以阿魏酸和芥子酸為主[13]。Xi等[14]發(fā)現(xiàn)5個檸檬品種果實(shí)中咖啡酸在不同部位含量趨勢大致為果皮＞全果＞果肉＞果汁＞種子，綠原酸含量則為果皮＞全果＞種子＞果肉＞果汁，果皮中沒食子酸含量最高，阿魏酸僅在果皮、全果和種子中有檢出。柚果實(shí)中酚酸總體含量果皮高于果肉，且黃皮層中以對香豆酸、阿魏酸和芥子酸為主，白皮層中酚酸組成相似但含量相較更低，而果肉中則以芥子酸、阿魏酸和香草酸為主[15]。然而對9個中國主栽葡萄柚品種果實(shí)不同部位酚酸組成的研究結(jié)果則與上述結(jié)論有所差別，主要酚酸為沒食子酸，果實(shí)各組織間亦存在顯著差異，依次為果肉＞黃皮層＞白皮層＞嚢衣＞種子[16]。

由此可見，不同柑橘品種果實(shí)所含酚酸物質(zhì)的種類和含量亦不相同，Chen等[17]通過對52個柑橘品種比較發(fā)現(xiàn)其果皮中主要酚酸為苯甲酸和原兒茶酸，不同種類柑橘總酚酸含量差異明顯，寬皮柑橘類相較橙類、柚類、檸檬類和金柑類含量最低。鄭潔等[18]報道了柑橘果皮果肉中酚酸含量以砂糖橘最多，椪柑、檸檬、雞尾葡萄柚和紐荷爾臍橙次之，金柑最少，果皮中酚酸含量是果肉中的3～5倍，綠原酸和阿魏酸為主要酚酸。張靜等[19]利用超高效液相色譜分析了9種晚熟柑橘中7種主要酚酸，其含量和種類也存在明顯差異，果汁中為春見的咖啡酸含量最高，果肉中為沃柑的阿魏酸、咖啡酸、芥子酸和塔羅科血橙的對香豆酸含量最高，果皮中則為默科特的阿魏酸含量最高，就大類而言雜柑類果皮中咖啡酸、阿魏酸含量高于橙類。

2 酚酸類化合物的生物活性

2.1 抗氧化活性

柑橘酚酸結(jié)構(gòu)中含有若干酚羥基故具有較強(qiáng)的供氫能力，其能清除因機(jī)體衰老、損傷而產(chǎn)生的過氧自由基、羥自由基等，是一類天然的抗氧化劑[20]。眾多研究表明柑橘酚酸的抗氧化能力主要受其結(jié)構(gòu)和所在溶液的極性影響[21-23]，苯環(huán)上取代的羥基數(shù)量越多其抗氧化能力則越強(qiáng)。羥基數(shù)量相同時，其抗氧化能力則取決于羥基取代位置引起的空間位阻大?。划?dāng)以上兩者都相同時，肉桂酸型抗氧化能力強(qiáng)于苯甲酸型。另外，酚酸的自由基清除機(jī)理因溶液極性變化也有所不同，在極性溶液中為質(zhì)子伴隨的電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，在非極性溶液中則為抽氫反應(yīng)，故其抗氧化能力也存在差異。Paulo等[24]報道了10～40 μg/mL濃度范圍內(nèi)的阿魏酸可保護(hù)真皮層纖維細(xì)胞免受紫外線輻射導(dǎo)致的DNA氧化損傷[25]；p -香豆酸可通過提高糖尿病大鼠肝臟內(nèi)源性抗氧化能力(谷胱甘肽-谷胱甘肽水平)抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生[26]；此外，Kikuzaki等[27]評估了不同肉桂酸型酚酸在體外的自由基清除能力，其抗氧化活性以咖啡酸、芥子酸、阿魏酸、p -香豆酸順序依次減弱。

2.2 抗癌活性

柑橘果實(shí)中的酚酸類物質(zhì)對腫瘤細(xì)胞生長抑制作用明顯，極具抗癌潛力，其主要抗癌機(jī)制如下：抑制基因毒性分子的形成，阻斷誘變轉(zhuǎn)化酶的活性；調(diào)節(jié)含血紅素I相酶，抗癌解毒II相酶，并阻止DNA加合物形成[28]。學(xué)者們報道了咖啡酸、阿魏酸、香草酸等酚酸可抑制如乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等多種癌細(xì)胞的增殖[29]。Russo等[30]研究表明日常膳食中羥基苯甲酸和咖啡酸的攝入量越多越能降低前列腺癌轉(zhuǎn)變?yōu)橥砥诘娘L(fēng)險，增大咖啡酸和阿魏酸的攝入量可能與降低患前列腺癌風(fēng)險有關(guān)。酚酸類物質(zhì)除可抑制腫瘤細(xì)胞生長外還能減少其轉(zhuǎn)移，如在大鼠飼料中添加咖啡酸，可減少肝癌細(xì)胞在肝臟的轉(zhuǎn)移[31]。另有研究指出沒食子酸及其衍生物對機(jī)體內(nèi)非腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較低，而對包括白血病、黑素瘤、肺癌和乳腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞系表現(xiàn)出更強(qiáng)的選擇性細(xì)胞毒性，且其抗癌活性因細(xì)胞類型而異，可能受其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制不同所致[32]。

2.3 抗菌活性

酚酸類化合物還具有較強(qiáng)抑菌活性，其抑菌能力與結(jié)構(gòu)中取代基長度、不飽和程度以及濃度等有關(guān)。此外，酚酸類物質(zhì)與芳香族等其他物質(zhì)同時存在時具有協(xié)同作用，可顯著增強(qiáng)酚酸的抑菌活性[20]。阿魏酸、沒食子酸可有效抑制大腸桿菌、銅綠假單胞菌和單核增生李斯特菌[33]。朱金帥等[34]比較了沒食子酸、原兒茶酸和綠原酸對水產(chǎn)品中腐敗希瓦氏菌的抑制活性，結(jié)果表明3種酚酸中沒食子酸對腐敗希瓦氏菌的抑制能力最強(qiáng)，經(jīng)1.25 mg/mL的沒食子酸處理，腐敗菌形態(tài)明顯改變，細(xì)胞膜遭破壞，膜內(nèi)物質(zhì)大量外泄，細(xì)胞凋亡率增高。酚酸間抑菌能力也具有協(xié)同作用，以阿魏酸和香豆酸為例，相較單獨(dú)使用，其最小抑菌濃度可降低1.5～3倍；酚酸類化合物在致病菌細(xì)胞內(nèi)會通過觸發(fā)亞鐵離子反應(yīng)途徑等造成胞內(nèi)氧化還原失衡，促進(jìn)過氧化物產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)菌過氧化損傷而死亡，該過程與抗生素滅菌機(jī)理類似，例如香豆酸殺滅金黃葡萄球菌[35]。除致病菌外，在一定程度上酚酸對益生菌、共生菌都有抑制作用，Cueva等[36]評估了13種酚酸對大腸桿菌、乳酸菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌的抑菌活性，致病性大腸桿菌O157∶H7最為敏感可被其中10種酚酸抑制，除銅綠假單胞菌最不敏感外，其他菌的生長也受到不同程度的抑制。

2.4 其他生物活性

炎癥是機(jī)體應(yīng)對刺激、損傷等產(chǎn)生的保護(hù)反應(yīng)，綠原酸可通過抑制一氧化氮、前列腺素、促炎細(xì)胞因子和黏附分子等各種炎癥介質(zhì)的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)抗炎目的[37]；沒食子酸則是通過抑制NF-κB通路激活在潰瘍性結(jié)腸炎中發(fā)揮抗炎作用[38]；香草酸具有鎮(zhèn)痛和抗炎作用，該作用依賴于對中性粒細(xì)胞、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞因子以及NF-κB通道的抑制[39]。另有醫(yī)學(xué)研究指出咖啡酸及其衍生物對乙酰膽堿酯酶有明顯的抑制作用，而乙酰膽堿酯酶是一種與阿爾茨海默癥發(fā)病有關(guān)的酶[40]。p-香豆酸則可作為酪氨酸酶的競爭性抑制劑，抑制人表皮黑素細(xì)胞中黑色素合成，作為一種美白活性成分在美白護(hù)膚行業(yè)中有很好的應(yīng)用前景[41]。此外，不少研究表明阿魏酸、沒食子酸等酚酸具有神經(jīng)保護(hù)功能[42]；柑橘酚酸還可舒緩血管，預(yù)防高血壓，F(xiàn)raga等[43]發(fā)現(xiàn)長期攝入橙汁可降血壓和降體脂，該功效部分原因歸功于其中的酚酸組分。

3 柑橘果實(shí)中酚酸的提取及檢測

3.1 柑橘酚酸提取方法

目前相關(guān)文獻(xiàn)報道的柑橘果實(shí)中酚酸類物質(zhì)的提取方法[44]主要有：傳統(tǒng)溶劑萃取法、超臨界二氧化碳萃取法、流體萃取法、超聲波輔助萃取法、微波輔助萃取法以及酶輔助萃取法等。其中傳統(tǒng)溶劑萃取法是最常用的方法，主要通過改變有機(jī)溶劑種類、濃度、溫度、提取時間以及提取次數(shù)。Chen等[45]，發(fā)現(xiàn)較高的溫度(100℃)下進(jìn)行干燥獲得酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性更高。相較傳統(tǒng)溶劑法，其他萃取方法更環(huán)保，所需能源和溶劑更少，同時有更高的產(chǎn)量。Hayat等[46]比較了用微波輔助提取，超聲波輔助和加熱回流提取法的效果，結(jié)果表明微波輔助萃取法對游離、酯化、糖苷化和不溶性四種形態(tài)的酚酸提取效率高、提取時間短、抗氧化活性強(qiáng)。柑橘果實(shí)中酚酸多以結(jié)合態(tài)形式存在，必要的外源酶可將其從組織中釋放，提高萃取產(chǎn)量，Nishad等[47]比較了酶輔助萃取法與超聲輔助萃取法對馬耳他甜橙果皮廢棄物中酚類物質(zhì)的提取效果，采用酶輔助萃取法的酚類物質(zhì)含量增加2倍，且更綠色環(huán)保。

3.2 柑橘酚酸類物質(zhì)的檢測技術(shù)

現(xiàn)階段柑橘果實(shí)中酚酸類物質(zhì)的主要檢測技術(shù)有光譜分析、毛細(xì)管電泳、色譜分析、電化學(xué)分析、核磁共振等[20,48]。其中光譜分析法和色譜分析法是最為常用的方法，光譜分析法是根據(jù)酚酸類物質(zhì)對光的選擇性吸收而進(jìn)行定性定量分析的，利用傅里葉變換紅外光譜可測定冷凍干燥檸檬汁中總酚含量，該方法可替代傳統(tǒng)福林酚法，更經(jīng)濟(jì)、省時[49]。Chen等[50]首次建立了一種高效液相色譜結(jié)合二極管陣列檢測器方法用于同時檢測柑橘和葡萄中綠原酸、咖啡酸等16種酚類物質(zhì)，檢測準(zhǔn)確、快速，回收率高，精密度好，檢測限為 0.03～1.83 μg/mL，定量限為0.09～5.55 μg/mL。超高效液相色譜聯(lián)用三重四極桿質(zhì)譜可同時檢測柑橘果實(shí)中11種酚酸和類黃酮，檢測快速、靈敏，僅需11min[51]。此外，學(xué)者們還致力開發(fā)更靈敏、便捷的酚酸檢測方法，Ghaani等[52]報道了利用納米銀/飛燕草素修飾玻碳電極用于高靈敏檢測沒食子酸的電化學(xué)方法，檢測限低至0.28 μ M，并在0.60～8.68 μM和8.68～625.8 μM兩個濃度范圍內(nèi)可實(shí)現(xiàn)對沒食子酸的定量檢測；核磁共振技術(shù)也被報道用于中國甜橙中水楊酸等成分的快速定量與產(chǎn)地溯源[53]。

4 總結(jié)與展望

目前國內(nèi)外學(xué)者對柑橘中酚酸化合物的研究主要集中在生物活性、檢測技術(shù)及提取方法的開發(fā)，但對多種酚酸類物質(zhì)間的協(xié)同或拮抗作用尚處探索階段，且亟待開發(fā)除色譜分析方法外的檢測技術(shù)，對其中酚酸類物質(zhì)的組成、活性等特性研究不夠充分。柑橘果實(shí)中酚酸化合物含量和種類豐富，約占總酚含量的1/3，主要分布于果皮中，是重要的酚酸來源，然而除陳皮等少部分可用于入藥外對其利用研究較少，建議探索其活性用途，提高其生物利用率，不斷優(yōu)化提取制備工藝以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。