間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體在心肌梗死治療中的研究進(jìn)展

俞佳麗 景雨 張劍 陳楚 陸齊 顧周山 陳子微 周大勝 景宏美 潘麗華

(1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，江蘇 南通 226001；2.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南通 226001)

心肌梗死是一種嚴(yán)重的冠狀動(dòng)脈相關(guān)性疾病，是常見的心血管疾病和主要死亡原因，對(duì)全球人類健康造成了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)[1]，盡管心肌梗死的預(yù)防和聯(lián)合治療策略(藥物治療、介入治療和移植手術(shù)等)有效地改善了心肌缺血的癥狀和疾病的進(jìn)展，但心肌梗死的發(fā)病率和死亡率仍居高不下。目前心肌梗死的治療主要集中于抗血小板聚集、溶栓以及對(duì)冠狀動(dòng)脈解剖結(jié)構(gòu)的侵入性評(píng)估，評(píng)判是否需要重新建立血運(yùn)，恢復(fù)血供。藥物治療方面如β受體阻滯劑、他汀類藥物和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)抑制劑等可改善心肌缺血和心臟重構(gòu)。近年來(lái)，最常見的血管重建術(shù)——冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療在全世界廣泛開展[2]，但是心肌梗死的治療仍面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。近年來(lái)，干細(xì)胞衍生的外泌體有望成為一種新興治療方法。

1 外泌體的基本生物特征

外泌體是由脂質(zhì)雙層界定的蝶形囊泡，可通過(guò)超速離心分離，是由多種細(xì)胞類型分泌，包括血小板、淋巴細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉、膠質(zhì)細(xì)胞和干細(xì)胞，其直徑為30～100 nm[3]，內(nèi)含豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA、微小RNA(miRNA)以及其他許多非編碼RNA[4]，通常來(lái)源于大部分細(xì)胞類型的內(nèi)吞起源的細(xì)胞外囊泡，是細(xì)胞信息交換的重要媒介。來(lái)自供體細(xì)胞的外泌體與特定受體結(jié)合，釋放包含的內(nèi)容物分子誘導(dǎo)受體細(xì)胞發(fā)生病理生理變化[5]。越來(lái)越多的證據(jù)表明外泌體可將生物學(xué)信息從親代細(xì)胞攜帶到靶細(xì)胞并調(diào)節(jié)靶細(xì)胞生物學(xué)[6]。近來(lái)，研究過(guò)的用于心臟修復(fù)的細(xì)胞類型包括胚胎干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)、內(nèi)皮祖細(xì)胞、原位心臟干細(xì)胞等。MSC來(lái)源的外泌體含有多種細(xì)胞因子(如白介素-6和白介素-10)、生長(zhǎng)因子(如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β和造血生長(zhǎng)因子)、信號(hào)脂質(zhì)和miRNA(如miRNA-21和miRNA-133b)等[7]，這些成分在生理過(guò)程中起廣泛的調(diào)節(jié)作用，包括生物體發(fā)育、表觀遺傳調(diào)控和免疫調(diào)節(jié)等[8]。大量臨床研究表明MSC來(lái)源的外泌體可抑制心肌細(xì)胞凋亡，減少組織的損傷[9]，改善心肌梗死后心臟功能。

2 MSC來(lái)源的外泌體影響心肌梗死的機(jī)制

2.1 促進(jìn)心肌梗死血管生成

在心肌梗死的缺血心肌疾病中，需要再生血管以彌補(bǔ)缺血帶來(lái)的一系列影響，新血管生成可通過(guò)激活內(nèi)源性祖細(xì)胞，提供外源干細(xì)胞和/或治療性分子，如血管生成mRNA或miRNA。MSC來(lái)源的外泌體可通過(guò)miRNA來(lái)傳達(dá)其促血管生成信號(hào)。有研究[10]表明，miRNA是內(nèi)皮細(xì)胞功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，尤其是血管生成的重要調(diào)節(jié)劑。來(lái)自MSC的外泌體介導(dǎo)了miRNA從MSC向人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，其中miRNA-132的過(guò)表達(dá)使人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中RASA1的表達(dá)水平降低，在功能上促進(jìn)了心肌梗死中的新血管生成[11]，而RASA1是血管發(fā)芽和血管分支的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)劑，通過(guò)使絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路失活來(lái)調(diào)節(jié)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子用于維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和刺激血管生成級(jí)聯(lián)，miRNA-126可抑制Spred1，從而增強(qiáng)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路，當(dāng)miRNA-126下調(diào)時(shí)，Spred1的過(guò)度表達(dá)抑制MAPK/ERK信號(hào)通路，從而影響血管生成因子信號(hào)并導(dǎo)致血管生成中斷[12]。MSC來(lái)源的外泌體使缺氧誘導(dǎo)因子-1α過(guò)表達(dá)，缺氧誘導(dǎo)因子-1α mRNA表達(dá)也增高，上調(diào)了促血管生成因子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血管生成素-1和血小板衍生生長(zhǎng)因子的mRNA表達(dá)水平[13]，血管生成細(xì)胞因子可直接與受體結(jié)合，也可間接啟動(dòng)內(nèi)皮細(xì)胞的激活，激活下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑以形成新的毛細(xì)血管，從而促進(jìn)血管的生成。缺氧預(yù)處理后缺氧誘導(dǎo)因子-1α可因穩(wěn)定和核易位，引起下游靶基因nSMase2的激活，缺氧增加的miRNA-210依賴于nSMase2存在于外泌體中，外泌體將miRNA-210傳遞到梗死的心臟中，也會(huì)促進(jìn)血管生成[14]。

MSC來(lái)源的外泌體誘導(dǎo)的血管生成也依賴于細(xì)胞間其他介質(zhì)的傳遞，這是由MSC來(lái)源的外泌體介導(dǎo)的生物活性因子分泌所促進(jìn)的，諸如鈣黏蛋白調(diào)節(jié)血管生成和血管的完整性；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)血管和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞促有絲分裂，是一種有效的血管生成誘導(dǎo)劑；表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)血管生成等[15]。MSC通過(guò)外泌體分泌相關(guān)介質(zhì)創(chuàng)造促血管生成的環(huán)境，外泌體通過(guò)其固有的分子(如核苷酸、蛋白質(zhì)和生物活性脂質(zhì))介導(dǎo)細(xì)胞間的微通信。

2.2 抑制炎癥反應(yīng)

心肌梗死后會(huì)觸發(fā)炎癥反應(yīng)，長(zhǎng)時(shí)間的炎癥反應(yīng)會(huì)延長(zhǎng)心肌損傷，導(dǎo)致不良的心室重塑和心力衰竭。有證據(jù)表明，MSC來(lái)源的外泌體保持有效的抗炎作用。MSC來(lái)源的外泌體中高表達(dá)的miRNA，可直接靶向作用于炎癥蛋白抑制炎癥，如miRNA-25-3p直接作用于炎癥蛋白(EZH2和H3K27me3)，減少EZH2和H3K27me3被募集至內(nèi)皮型一氧化氮合酶和SOCS3的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制SOCS3的表達(dá)，抑制炎癥[16]。來(lái)自MSC的exo-miRNA-542-3p通過(guò)調(diào)節(jié)Toll樣受體4水平減輕炎癥反應(yīng)的激活，Toll樣受體4是先天免疫的關(guān)鍵受體，在多個(gè)器官中介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[17]。

巨噬細(xì)胞也在梗死后炎癥和心臟修復(fù)中起重要作用。巨噬細(xì)胞可分為M1型巨噬細(xì)胞(經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞)和M2型巨噬細(xì)胞(活化巨噬細(xì)胞)。在梗死早期，M1型巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出很強(qiáng)的吞噬活性，在梗死后期M2型巨噬細(xì)胞占主導(dǎo)地位，并負(fù)責(zé)炎癥消退和心臟愈合。心肌梗死后巨噬細(xì)胞向M1型分化，M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物白介素-1β、白介素-6、腫瘤壞死因子-α和γ干擾素表達(dá)水平上調(diào)，同時(shí)下調(diào)了1-磷酸鞘氨醇、鞘氨醇激酶1和鞘氨醇-1-磷酸受體1，這些因子在免疫功能、血管生成及炎癥反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[18]。脂肪MSC來(lái)源的外泌體呈經(jīng)典的杯狀形態(tài)，可上調(diào)1-磷酸鞘氨醇、鞘氨醇激酶1和鞘氨醇-1-磷酸受體1的水平，逆轉(zhuǎn)心肌梗死后M1型巨噬細(xì)胞的分化，使白介素-1β、白介素-6、腫瘤壞死因子-α和γ干擾素表達(dá)水平下降，同時(shí)上調(diào)了M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化，逆轉(zhuǎn)心肌梗死核因子кB p65的激活，減少了缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和纖維化，抑制了炎癥反應(yīng)，保護(hù)了心臟功能[19]。調(diào)節(jié)Akt1/Akt2信號(hào)通路可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，若用脂多糖刺激MSC衍生的外泌體，可顯著激活A(yù)kt1的磷酸化，同時(shí)抑制Akt2的磷酸化活化，而Akt1主要介導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化，Akt2主要調(diào)節(jié)M1型巨噬細(xì)胞極化，使M1型巨噬細(xì)胞極化向M2型巨噬細(xì)胞極化轉(zhuǎn)變[20]。

2.3 減少心肌細(xì)胞凋亡與平衡自噬

研究表明，心肌細(xì)胞凋亡是心肌梗死早期心肌細(xì)胞死亡的一種形式，在心肌梗死后期可能會(huì)發(fā)生壞死，因而抑制細(xì)胞凋亡可能是一種有效的治療措施[21]。

MSC來(lái)源的外泌體在缺氧條件下可抑制心肌細(xì)胞凋亡，賦予心肌細(xì)胞心臟保護(hù)作用，這種抗凋亡反應(yīng)會(huì)阻礙心肌損傷，保留左心室形狀，改善心功能。低氧預(yù)處理后的骨髓MSC外泌體，顯著上調(diào)了miRNA-24的表達(dá)，抑制了心肌梗死后的心肌細(xì)胞凋亡，其主要抗凋亡作用表現(xiàn)為下調(diào)caspase-3和切割caspase-3蛋白表達(dá)[22]。miRNA-125b是一種已知的抗凋亡miRNA，缺氧的MSC來(lái)源的外泌體中富含miRNA-125b-5p，其通過(guò)抑制p53和BAK1基因?qū)π募〖?xì)胞產(chǎn)生深遠(yuǎn)的抗凋亡作用。

PI3K/Akt途徑是參與細(xì)胞凋亡和存活調(diào)節(jié)的關(guān)鍵細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，miRNA-210可靶向凋亡誘導(dǎo)因子3調(diào)節(jié)Akt、PI3K和p53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，由此降低了凋亡誘導(dǎo)因子3、p-Akt、PI3K和p53的表達(dá)水平，使得抗凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因增加，半胱氨酸蛋白酶、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因相關(guān)啟動(dòng)子、兔抗人單克隆抗體等凋亡蛋白減少，改善了心肌細(xì)胞的存活率[23]；來(lái)自MSC的外泌體的miRNA-486-5p通過(guò)抑制人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因途徑并隨后激活PI3K/Akt途徑來(lái)減少心肌梗死誘導(dǎo)的凋亡[24]。這些結(jié)果表明MSC來(lái)源的外泌體可調(diào)節(jié)PI3K/Akt途徑減少心肌細(xì)胞凋亡。

自噬是通過(guò)細(xì)胞質(zhì)組分在溶酶體降解的一種細(xì)胞內(nèi)降解系統(tǒng)。大鼠心肌梗死后，MSC來(lái)源的外泌體的注射有效地抑制了心肌梗死引起的心肌損傷，研究表明，缺氧復(fù)氧期間凋亡蛋白酶激活因子1(apoptosis protease-activating factor-1，Apaf1)表達(dá)增加，Apaf1是凋亡小體的核心組成部分，Apaf1寡聚化是細(xì)胞凋亡開始的動(dòng)態(tài)和關(guān)鍵事件[25]，引起凋亡性細(xì)胞死亡，而自噬相關(guān)基因(ATG13)的表達(dá)被抑制，但外泌體的處理使Apaf1表達(dá)減少，ATG13表達(dá)增加，這表明MSC分離的外泌體促進(jìn)自噬減少細(xì)胞凋亡[26]。也有研究結(jié)果與其恰恰相反，正常的自噬保護(hù)細(xì)胞免受周圍環(huán)境的刺激，而過(guò)度的自噬會(huì)導(dǎo)致多種疾病。在嚴(yán)重缺血條件下，它可促進(jìn)細(xì)胞死亡并惡化心臟功能。MSC來(lái)源的外泌體攜帶高表達(dá)的miRNA-301，顯著降低了梗死心肌中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值[27](LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ和P62是自噬相關(guān)的標(biāo)志物，較高的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率和較低的P62表達(dá)水平代表自噬程度的增強(qiáng))，減少了自噬體的通量，抑制了自噬，卻減少了心肌細(xì)胞的凋亡，改善了心肌梗死大鼠的心功能。

3 小結(jié)與展望

MSC來(lái)源的外泌體是心肌細(xì)胞存活和功能特性的強(qiáng)大調(diào)節(jié)因子，通過(guò)增強(qiáng)心臟損傷后的血管新生，抑制炎癥、減少細(xì)胞凋亡、平衡自噬以改善纖維化，表現(xiàn)出了在心肌梗死治療方面的巨大潛能。至今為止已開展了眾多有關(guān)外泌體的臨床試驗(yàn)研究，盡管MSC來(lái)源的外泌體在心血管疾病中的再生和免疫調(diào)節(jié)活性已被大量證實(shí)，但由于外泌體在生理和病理過(guò)程中都普遍存在，其具體的各項(xiàng)作用靶點(diǎn)，以及在不同環(huán)境和不同誘因的心肌梗死中的安全性和有效性還有待驗(yàn)證，開發(fā)可擴(kuò)展和可復(fù)制的外泌體以及改進(jìn)質(zhì)量分析的技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)也是一大挑戰(zhàn)；其次，外泌體的有益作用也因供體的年齡或組織的不同而不同；另外，外泌體的分離、檢測(cè)及純化也應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化和簡(jiǎn)便化，以便將來(lái)更好地在臨床實(shí)踐中應(yīng)用，這些都將是未來(lái)一段時(shí)間需要解決的問題。