滸苔發(fā)酵工藝優(yōu)化及青蛤喂養(yǎng)效果評(píng)價(jià)

夏 青, 孫澤鵬, 柳梅梅, 廖曉婷, 董志國(guó), 3

滸苔發(fā)酵工藝優(yōu)化及青蛤喂養(yǎng)效果評(píng)價(jià)

夏 青1, 2, 孫澤鵬1, 2, 柳梅梅1, 2, 廖曉婷1, 2, 董志國(guó)1, 2, 3

(1. 江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn), 江蘇 連云港 222006; 2. 江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 連云港 222006; 3. 江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 連云港 222006)

本試驗(yàn)以自然海區(qū)打撈上岸的滸苔()為原料, 以植物乳酸桿菌為發(fā)酵菌種, 發(fā)酵滸苔喂養(yǎng)青蛤()的特定生長(zhǎng)率為響應(yīng)值, 確定滸苔發(fā)酵的最佳工藝。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上, 以發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、料液比為響應(yīng)因素, 以青蛤特定生長(zhǎng)率為響應(yīng)值, 利用Box-Behnken中心組合方法進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì), 進(jìn)行響應(yīng)面分析。結(jié)果表明: 影響滸苔發(fā)酵工藝的因素主次順序?yàn)榘l(fā)酵溫度、料液比和發(fā)酵時(shí)間, 最佳發(fā)酵工藝條件為: 發(fā)酵溫度35 ℃, 料液比(1∶1.5) g·mL–1, 發(fā)酵時(shí)間84 h。通過(guò)測(cè)定發(fā)酵前后滸苔的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分, 發(fā)現(xiàn)滸苔發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量顯著高于未發(fā)酵滸苔(<0.05); 使用工藝優(yōu)化后的滸苔發(fā)酵產(chǎn)物所喂養(yǎng)的青蛤與投喂小球藻的青蛤在特定生長(zhǎng)率與存活率方面無(wú)顯著差異。本試驗(yàn)證明優(yōu)化后的滸苔發(fā)酵工藝具有可靠性, 其發(fā)酵產(chǎn)物具備成為青蛤養(yǎng)殖飼料的條件, 為滸苔發(fā)酵飼料的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)的同時(shí), 也為貝類(lèi)配合飼料的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用提供極大參考價(jià)值。

滸苔; 青蛤; 發(fā)酵工藝; 響應(yīng)面法; 工藝優(yōu)化

滸苔()屬綠藻門(mén)石莼科滸苔屬植物, 是一種適應(yīng)能力強(qiáng)、繁殖快速的天然野生綠藻[1], 在我國(guó)沿海均有分布。近年來(lái), 全球變暖、海水溫度升高、污水排放入海給滸苔提供了有利生長(zhǎng)條件, 世界各海域均出現(xiàn)不同程度的滸苔爆發(fā)現(xiàn)象[2]。在我國(guó)黃海海域, 滸苔也連年呈暴發(fā)式生長(zhǎng), 對(duì)當(dāng)?shù)睾Ｑ笊鷳B(tài)環(huán)境造成極大威脅的同時(shí), 使得該地區(qū)遭受?chē)?yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì), 超過(guò)60%打撈上岸的滸苔被直接進(jìn)行掩埋處理, 其生物價(jià)值難以發(fā)揮, 因此造成滸苔這一有效資源得不到充分利用[4]。如何有效預(yù)防及應(yīng)對(duì)滸苔的爆發(fā), 以及災(zāi)情出現(xiàn)后應(yīng)該如何將打撈上岸的滸苔加以利用等問(wèn)題, 一直是眾人關(guān)注的焦點(diǎn)。

我國(guó)一直存在飼料蛋白原料短缺問(wèn)題, 而利用微生物發(fā)酵技術(shù)能夠開(kāi)發(fā)出高效且安全的新型飼料資源[5], 目前國(guó)內(nèi)投入研究的發(fā)酵飼料蛋白原料包括豆粕[6]、菜籽粕[7]、棉粕[8]、血粉[9]等。滸苔是一種高蛋白、低脂肪的天然海藻食品原料, 富含滸苔多糖、粗纖維、粗脂肪、多重氨基酸及多種微量元素, 具有成為優(yōu)質(zhì)原料的特質(zhì)。眼下, 國(guó)內(nèi)學(xué)者已對(duì)滸苔的發(fā)酵利用展開(kāi)諸多研究, 其中包括利用滸苔發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)肥[10-11], 開(kāi)發(fā)海藻飲料[12],通過(guò)發(fā)酵滸苔制備生物乙醇等[13]。發(fā)酵飼料主要是通過(guò)微生物的分解作用, 將飼料原料中的大分子植物蛋白或部分難以被利用的動(dòng)物蛋白轉(zhuǎn)換為小分子的微生物蛋白、短鏈多肽等[14]。在微生物發(fā)酵作用下, 能夠?qū)崿F(xiàn)滸苔的快速液態(tài)發(fā)酵, 促使?jié)G苔的大量蛋白質(zhì)被釋放到發(fā)酵液中, 并通過(guò)水解得到滸苔多糖。滸苔多糖具有提高動(dòng)物免疫能力、抗病毒等作用[15], 將滸苔作為添加劑加入水產(chǎn)動(dòng)物飼料中的相關(guān)研究結(jié)果表明, 飼料中添加滸苔對(duì)提升飼喂動(dòng)物的免疫能力作用顯著, 如珍珠龍膽石斑魚(yú)()[16]、凡納濱對(duì)蝦()[17]等。固態(tài)發(fā)酵是指在沒(méi)有或幾乎沒(méi)有自由水存在的條件下, 使用一種或多種微生物協(xié)同作用對(duì)底物進(jìn)行發(fā)酵[18]。相較于液態(tài)發(fā)酵, 固態(tài)發(fā)酵更具優(yōu)勢(shì), 包括用水量少、排污少、發(fā)酵條件容易控制等, 且微生物在固態(tài)基質(zhì)中易生長(zhǎng), 酶活力更高[19]。另有研究發(fā)現(xiàn)固態(tài)發(fā)酵受物料碳氮比、營(yíng)養(yǎng)成分、含水量、pH和發(fā)酵溫度等多種因素的影響, 因此, 發(fā)酵參數(shù)應(yīng)根據(jù)菌種、工藝及發(fā)酵目標(biāo)而確定[20]。

酸溶蛋白是低分子量蛋白質(zhì)的水解物, 其含量高低是評(píng)價(jià)飼料蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)之一, 飼料中酸溶蛋白比例較高可明顯提高畜禽對(duì)蛋白質(zhì)消化吸收的能力[21]。在滸苔發(fā)酵過(guò)程中, 酸溶蛋白的含量對(duì)滸苔發(fā)酵飼料品質(zhì)有著重要影響。因此, 本試驗(yàn)以酸溶蛋白為發(fā)酵檢測(cè)指標(biāo), 以期能夠較為準(zhǔn)確地反映出滸苔在不同發(fā)酵條件下經(jīng)微生物降解后的實(shí)際情況。

綜上所述, 本文擬通過(guò)對(duì)滸苔發(fā)酵工藝過(guò)程中的料液比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度進(jìn)行優(yōu)化, 測(cè)定不同工藝條件下發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)青蛤()的特定生長(zhǎng)率的影響, 并使用工藝優(yōu)化后滸苔發(fā)酵產(chǎn)物和活體小球藻()喂養(yǎng)青蛤, 并對(duì)喂養(yǎng)效果進(jìn)行評(píng)價(jià), 以此來(lái)評(píng)估發(fā)酵滸苔作為青蛤配合飼料的可能性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用滸苔打撈自連云港高公島近海海域, 低溫烘干后經(jīng)超微粉碎機(jī)研磨至300目備用。試驗(yàn)所用發(fā)酵菌株為植物乳桿菌(), 以及養(yǎng)殖試驗(yàn)中所用活體小球藻, 均由江蘇海洋大學(xué)海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以相同的培養(yǎng)方法為前提, 改變不同的發(fā)酵條件, 包括發(fā)酵溫度、料液比及發(fā)酵時(shí)間, 測(cè)定不同條件下滸苔發(fā)酵產(chǎn)物中酸溶蛋白含量和pH變化, 其中主要以酸溶蛋白含量為最終檢測(cè)指標(biāo), pH變化作為輔助參考。

發(fā)酵溫度的確定: 以料液比(1∶1.2) g·mL–1向滸苔干粉中加入純水, 按3%的接種量將滸苔干粉接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中, 混勻后放入密封發(fā)酵袋, 分別置于溫度為25、30、35、40、45 ℃的生化培養(yǎng)箱進(jìn)行發(fā)酵, 發(fā)酵時(shí)間為72 h。

料液比的確定: 向滸苔干粉中加入純水, 按3%的接種量將滸苔干粉接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中, 混勻后放入密封發(fā)酵袋, 在溫度為35 ℃的生化培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵, 發(fā)酵時(shí)間為72 h, 設(shè)置5個(gè)梯度的料液比, 分別為(1∶0.6)、(1∶0.9)、(1∶1.2)、(1∶1.5)、(1∶1.8) g·mL–1。

發(fā)酵時(shí)間的確定: 以料液比(1∶1.2) g·mL–1向滸苔干粉中加入純水, 按3%的接種量將滸苔干粉接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中, 混勻后放入密封發(fā)酵袋, 置于發(fā)酵溫度為35 ℃的生化培養(yǎng)箱中, 分別發(fā)酵48、60、72、84和96 h。

1.3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上, 利用正交試驗(yàn)得到滸苔發(fā)酵的最適條件, 使用Design-Expert 10.0.3軟件設(shè)定不同的發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間及料液比, 以青蛤特定生長(zhǎng)率(SG)為響應(yīng)值, 利用Box-Behnken中心組合方法進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn), 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.4 養(yǎng)殖試驗(yàn)

試驗(yàn)所用青蛤均購(gòu)自連云港市贛榆區(qū)海頭鎮(zhèn)蘇魯漁業(yè)批發(fā)市場(chǎng)。試驗(yàn)在國(guó)家貝類(lèi)體系連云港綜合試驗(yàn)站進(jìn)行, 養(yǎng)殖設(shè)施為容積300 L的圓柱形帆布養(yǎng)殖池。首先挑選規(guī)格相近、表面無(wú)損傷的1齡青蛤(初始體質(zhì)量(6.90±0.33) g, 初始?xì)らL(zhǎng)(2.74±0.07) cm, 在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)1周后, 選取健康個(gè)體進(jìn)行養(yǎng)殖試驗(yàn), 試驗(yàn)組與對(duì)照組分別設(shè)置3組重復(fù), 每組青蛤數(shù)量為200只。本試驗(yàn)養(yǎng)殖周期為90 d, 試驗(yàn)組投喂餌料選用工藝優(yōu)化后的滸苔發(fā)酵產(chǎn)物(具體發(fā)酵條件: 發(fā)酵溫度35 ℃, 料液比(1∶1.5) g·mL–1, 發(fā)酵時(shí)間84 h, 對(duì)照組投喂餌料選用活體小球藻, 試驗(yàn)組與對(duì)照組的每日投餌量為組內(nèi)喂養(yǎng)青蛤總質(zhì)量的2%, 于每日14時(shí)進(jìn)行投喂。試驗(yàn)期間, 水質(zhì)指標(biāo)維持在: 海水鹽度20～30; pH 7.0～9.0; 平均溶氧量>4 mg/L; 氨氮濃度<0.4 mg/L; 亞硝酸鹽<0.15 mg/L。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

酸溶蛋白含量的測(cè)定參照肖志明等[22], 稱(chēng)取1.0 g發(fā)酵樣品, 溶解到50 mL 15% 三氯乙酸溶液中, 磁力攪拌30 min, 取10 mL濾液進(jìn)行消化, 其余步驟參考國(guó)標(biāo)凱氏定氮法(GB/T 6432—2018); pH測(cè)定使用梅特勒S20K臺(tái)式pH計(jì), 將發(fā)酵海藻粉配置成3%的溶液, 振蕩5 min后讀數(shù)測(cè)定。灰分利用馬弗爐在550 ℃下灼燒至恒重進(jìn)行測(cè)定; 粗蛋白的測(cè)定參照GB/T 5009.5—2010, 酸消化后于FOSS KjeltecTM8400 凱氏定氮儀進(jìn)行測(cè)定; 粗脂肪的測(cè)定參照: GB/T 14772—2008, 采用石油醚萃取后,于FOSS soxtec 2050全自動(dòng)索氏抽提儀提取粗脂肪。

存活率=(存活個(gè)體數(shù)/總個(gè)體數(shù))×100%, (1)

青蛤特定生長(zhǎng)率(SG)=(lnW –ln0)/×100%, (2)

式中,W為青蛤終末體質(zhì)量(g);0為青蛤初始體質(zhì)量(g),為養(yǎng)殖天數(shù)(d)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析, 采用Duncan進(jìn)行多重比較分析, 使用ANOVA進(jìn)行方差分析, 使用LSD進(jìn)行差異性檢驗(yàn), 利用Design Expert 10.0.3進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析, 本試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵滸苔酸溶蛋白含量和pH的影響

本試驗(yàn)共設(shè)置5個(gè)發(fā)酵溫度梯度, 分別為25、30、35、40及45 ℃。根據(jù)圖1可知, 當(dāng)發(fā)酵溫度處于25～30 ℃、35～45 ℃區(qū)間時(shí), 發(fā)酵滸苔的酸溶蛋白含量呈下降趨勢(shì); 當(dāng)發(fā)酵溫度為35 ℃時(shí), 發(fā)酵滸苔的酸溶蛋白含量最高, 且與其他試驗(yàn)組存在顯著性差異(<0.05)。5個(gè)試驗(yàn)組pH測(cè)定結(jié)果在4.4～5.83之間, 其中35 ℃組pH為4.4, 屬于發(fā)酵飼料的正常范圍。因此, 認(rèn)為滸苔的植物乳桿菌最適發(fā)酵溫度為35 ℃。

圖1 不同發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵滸苔酸溶蛋白含量和pH的影響

注: 不同字母表示存在顯著性差異(<0.05), 其中, 以不同大寫(xiě)字母表示酸溶蛋白含量的差異, 以不同小寫(xiě)字母表示pH的差異, 下同

2.2 不同料液比對(duì)發(fā)酵滸苔酸溶蛋白含量和pH的影響

由圖2可知, 料液比從(1∶1.5) g·mL–1上升至(1∶0.6) g·mL–1, 發(fā)酵滸苔的酸溶蛋白含量顯著性提升(<0.05), 當(dāng)料液比小于(1∶1.5) g·mL–1時(shí), 發(fā)酵后滸苔的酸溶蛋白含量呈現(xiàn)較高水平且增長(zhǎng)不顯著(> 0.05); pH從料液比為(1∶0.6) g·mL–1至(1∶1.2) g·mL–1間呈顯著降低(<0.05), 當(dāng)料液比在(1∶1.2) g·mL–1至(1∶1.8) g·mL–1之間時(shí), 發(fā)酵后滸苔的pH隨著提取溶劑體積的提高未表現(xiàn)出顯著變化 (>0.05)?？紤]到物料成本, 選擇最適料液比(1∶1.5) g·mL–1。

2.3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵滸苔酸溶蛋白含量和pH的影響

不同的發(fā)酵時(shí)間對(duì)滸苔酸溶蛋白含量有著較大影響。由圖3可知, 當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在60～96 h區(qū)間時(shí), 各組間pH的差異不具有顯著性(>0.05)。發(fā)酵時(shí)間為84 h酸溶蛋白含量最高, 并顯著高于其他試驗(yàn)組(<0.05), 應(yīng)在pH降低不顯著的情況下, 選擇酸溶蛋白含量較高的發(fā)酵時(shí)間。因此, 認(rèn)為滸苔的植物乳桿菌優(yōu)化發(fā)酵時(shí)間為84 h。

圖2 不同料液比對(duì)發(fā)酵滸苔酸溶蛋白含量和pH的影響

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵滸苔酸溶蛋白含量和pH的影響

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上, 利用Design-Expert 10.0.3軟件, 選擇發(fā)酵溫度(A)30、35、40 ℃, 料液比(B)(1∶1.2)、(1∶1.5)、(1∶1.8) g·mL–1, 發(fā)酵時(shí)間(C)72、84、96 h, 以青蛤特定生長(zhǎng)率(SG)為響應(yīng)值, 用Design-Expert設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn), Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2, 回歸模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

將各因素使用Design-Expert 10.0.3軟件進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合后, 得到青蛤特定生長(zhǎng)率響應(yīng)面回歸模擬方程:

SG–1.820+0.038 21.123 30.009 7–

0.002 3–0.000 1–0.003 7–

0.000 42–0.213 120.000 022. (3)

通過(guò)表3可以看出, 該方程決定系數(shù)2=0.908 0,=0.000 4<0.01, 說(shuō)明該模型極顯著; 且失擬項(xiàng)= 0.265 9>0.05, 表明失擬不顯著, 該方程擬合度較好,可信度較大, 證明該模型具有穩(wěn)定性, 即發(fā)酵溫度、料液比和發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素對(duì)滸苔發(fā)酵工藝影響可使用該模型來(lái)描述。根據(jù)結(jié)果顯示, 最佳發(fā)酵工藝條件為: 發(fā)酵溫度35℃, 料液比(1∶1.5) g/mL, 發(fā)酵時(shí)間84 h。一次項(xiàng) A、B、C 均對(duì)結(jié)果影響極顯著(P<0.01), 交互項(xiàng)AB 對(duì)結(jié)果存在顯著影響(P<0.05), 其余各因素之間交互作用不明顯。3個(gè)因素對(duì)青蛤特定生長(zhǎng)率的影響主次順序?yàn)锳>B>C, 即: 發(fā)酵溫度>料液比>發(fā)酵時(shí)間。

2.5 響應(yīng)面交互分析

響應(yīng)面曲面坡度和等高線形狀能夠直觀反映出各試驗(yàn)因素及兩兩因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值青蛤特定生長(zhǎng)率的影響。發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、料液比的交互作用對(duì)青蛤特定生長(zhǎng)率影響的響應(yīng)面結(jié)果見(jiàn)圖4。料液比與發(fā)酵溫度的交互作用對(duì)青蛤特定生長(zhǎng)率的影響見(jiàn)圖4(a)。由圖可知, 當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為中心水平時(shí), 發(fā)酵溫度的等高線密度大于向料液比移動(dòng)的等高線密度, 說(shuō)明發(fā)酵溫度對(duì)青蛤特定生長(zhǎng)率的影響大于料液比。發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度的交互作用對(duì)青蛤特定生長(zhǎng)率的影響見(jiàn)圖4(b)。由圖可知, 當(dāng)取料液比為中心水平, 發(fā)酵溫度響應(yīng)曲面的陡度大于發(fā)酵時(shí)間的陡度, 說(shuō)明發(fā)酵溫度對(duì)青蛤特定生長(zhǎng)率的影響大于發(fā)酵時(shí)間。發(fā)酵時(shí)間與料液比的交互作用對(duì)青蛤特定生長(zhǎng)率的影響見(jiàn)圖4(c)。如圖所示, 當(dāng)取發(fā)酵溫度為中心水平, 料液比響應(yīng)曲面的陡度大于發(fā)酵時(shí)間的陡度, 且料液比等高線的密度大于向發(fā)酵時(shí)間移動(dòng)的等高線密度, 說(shuō)明料液比對(duì)青蛤特定生長(zhǎng)率的影響大于發(fā)酵時(shí)間。綜合以上三維響應(yīng)曲面分析可知, 三個(gè)因素對(duì)滸苔發(fā)酵工藝產(chǎn)生的影響由大及小為: 發(fā)酵溫度>料液比>發(fā)酵時(shí)間, 與方差分析的結(jié)果相一致。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析

注: **<0.01, 差異極顯著; *<0.05, 差異顯著。

圖4 發(fā)酵溫度、料液比及發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)青蛤特定生長(zhǎng)率影響的響應(yīng)面圖

2.6 滸苔發(fā)酵前后常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

發(fā)酵前后滸苔干粉中3種常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量如表4所示。由試驗(yàn)結(jié)果可知, 滸苔經(jīng)過(guò)優(yōu)化工藝發(fā)酵后, 蛋白質(zhì)含量由未發(fā)酵時(shí)的31.13% 提高到36.46%, 發(fā)酵滸苔和滸苔原料之間存在顯著差異(<0.05)。發(fā)酵前后滸苔的粗脂肪與粗灰分的含量并無(wú)顯著差異(>0.05)。

表4 滸苔發(fā)酵前后常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分(以干重計(jì))

2.7 不同餌料喂養(yǎng)青蛤效果對(duì)比

利用發(fā)酵滸苔與常規(guī)小球藻喂養(yǎng)青蛤的特定生長(zhǎng)率與存活率結(jié)果如表5所示。表中試驗(yàn)組青蛤所投喂餌料為工藝優(yōu)化后的發(fā)酵滸苔, 對(duì)照組青蛤餌料為活體小球藻。通過(guò)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)兩組之間的特定生長(zhǎng)率不存在顯著差異(>0.05); 通過(guò)卡方檢驗(yàn), 未發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組青蛤的存活率與對(duì)照組間存在顯著差異(>0.05), 該結(jié)果說(shuō)明使用工藝優(yōu)化后的發(fā)酵滸苔替代小球藻作為貝類(lèi)配合飼料這一做法具有可行性。

表5 發(fā)酵滸苔與小球藻喂養(yǎng)青蛤的特定生長(zhǎng)率與存活率

3 討論

本研究首先通過(guò)不同條件下發(fā)酵滸苔酸溶蛋白含量和pH的單因素試驗(yàn), 確定了3個(gè)影響因素的最佳條件, 以用于進(jìn)行響應(yīng)面分析, 采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析, 建立二次回歸模型, 通過(guò)對(duì)發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、料液比三因素進(jìn)行方差分析和交互作用分析, 觀察不同工藝下滸苔發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)青蛤特定生長(zhǎng)率的影響, 由此建立響應(yīng)面公式模型, 確定滸苔植物乳桿菌最優(yōu)發(fā)酵工藝。

通過(guò)發(fā)酵可提高發(fā)酵產(chǎn)物酸溶蛋白含量主要是因?yàn)橥ㄟ^(guò)微生物的作用, 能夠?qū)l(fā)酵原料中蛋白質(zhì)水解成小肽, 進(jìn)而提高蛋白質(zhì)的利用率。本文單因素試驗(yàn)結(jié)果證明了不同的發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵滸苔的酸溶蛋白含量存在顯著影響。其中, 當(dāng)發(fā)酵溫度為35 ℃時(shí), 其酸溶蛋白含量顯著高于30 ℃組與40 ℃組。這一結(jié)果與于哲[23]利用不同發(fā)酵溫度優(yōu)化酵母菌發(fā)酵大米蛋白結(jié)論相似。吳培鳳等[24]研究表明滸苔中半纖維素在提取溫度為85 ℃時(shí)達(dá)到最大值, 熊皓平等[25]發(fā)現(xiàn)硇洲馬尾藻多糖提取優(yōu)化后的發(fā)酵溫度為90.7 ℃, 超過(guò)該溫度后提取效果不再升高。

試驗(yàn)結(jié)果顯示在一定范圍內(nèi)物料中的含水量會(huì)影響發(fā)酵微生物的生長(zhǎng)代謝, 且會(huì)影響到發(fā)酵產(chǎn)物的pH。文中5個(gè)不同料液比試驗(yàn)組對(duì)發(fā)酵滸苔中酸溶蛋白含量影響結(jié)果表明, 發(fā)酵滸苔中酸溶蛋白的含量會(huì)隨著物料中含水量的增加呈上升趨勢(shì), 且當(dāng)料液比為(1∶0.6)～(1∶1.5) g·mL–1時(shí)各組間存在顯著差異(<0.05)。這是因?yàn)樵谝欢ū壤? 水作為溶劑可以使混合植物乳桿菌的滸苔干粉發(fā)酵得更為充分, 這一發(fā)現(xiàn)與姚蘭[26]利用不同料液比提取海帶中巖藻多糖的結(jié)果相似。

據(jù)呂文竹等[27]研究結(jié)果顯示, 不同的發(fā)酵時(shí)間會(huì)影響發(fā)酵飼料中酸溶蛋白含量。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵時(shí)間會(huì)影響滸苔發(fā)酵產(chǎn)物中酸溶蛋白含量, 且得出滸苔最適發(fā)酵時(shí)間為84 h, 利用該時(shí)間能夠?qū)崿F(xiàn)微生物對(duì)底物進(jìn)行最大限度的利用。隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng), 發(fā)酵滸苔的酸溶蛋白含量顯著降低, 這可能是因?yàn)槌龊线m的發(fā)酵時(shí)間會(huì)引起發(fā)酵產(chǎn)物中的微生物大量死亡, 并引發(fā)其他雜菌的滋生, 進(jìn)而消耗發(fā)酵產(chǎn)物中的優(yōu)質(zhì)蛋白, 從而導(dǎo)致發(fā)酵飼料品質(zhì)下降。遲永洲等[12]發(fā)現(xiàn), 在發(fā)酵溫度28 ℃, 發(fā)酵時(shí)間20 h環(huán)境下, 條滸苔的發(fā)酵效果最好。

為檢驗(yàn)利用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)的模型是否可靠, 本文對(duì)滸苔原料和工藝優(yōu)化過(guò)的發(fā)酵滸苔進(jìn)行常規(guī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)測(cè)定, 本次試驗(yàn)中測(cè)得滸苔原料的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量也與廖梅杰等[28]、王婷婷等[29]結(jié)果相近。研究結(jié)果表明工藝優(yōu)化后發(fā)酵滸苔的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較滸苔原料有所提升, 發(fā)酵滸苔的粗蛋白含量較滸苔原料有顯著提高。粗蛋白含量的提升是由于在發(fā)酵過(guò)程中, 微生物通過(guò)呼吸作用消耗掉部分有機(jī)物料, 將其轉(zhuǎn)換為CO2和H2O, 產(chǎn)生蛋白質(zhì)的濃縮效應(yīng)[30]。發(fā)酵后滸苔常規(guī)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的提升, 則說(shuō)明利用微生物發(fā)酵實(shí)現(xiàn)滸苔成為水產(chǎn)動(dòng)物飼料源具有可行性。

有研究顯示將滸苔作為飼料添加劑能有效提升水產(chǎn)動(dòng)物在生長(zhǎng)性能、抗應(yīng)激能力、抗病力等方面的表現(xiàn)[16-17]。通過(guò)對(duì)比使用工藝優(yōu)化后的滸苔發(fā)酵產(chǎn)物與使用活體小球藻所喂養(yǎng)青蛤的生長(zhǎng)性能后發(fā)現(xiàn), 前者在特定生長(zhǎng)率與存活率方面的表現(xiàn)并不理想, 推測(cè)造成這一現(xiàn)象的主要原因是發(fā)酵滸苔營(yíng)養(yǎng)較為豐富, 在實(shí)驗(yàn)室的單一海水養(yǎng)殖環(huán)境下投喂發(fā)酵滸苔易引起水體的富營(yíng)養(yǎng)化, 且更易造成養(yǎng)殖水體渾濁, 當(dāng)水體指標(biāo)超出正常范圍時(shí), 試驗(yàn)組會(huì)進(jìn)行少量換水, 但可能由此引起青蛤產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng), 從而導(dǎo)致試驗(yàn)組青蛤的特定生長(zhǎng)率與存活率略低于對(duì)照組。

4 結(jié)論

滸苔發(fā)酵工藝受料液比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間等條件影響, 本試驗(yàn)以滸苔發(fā)酵產(chǎn)物所喂養(yǎng)的青蛤的特定生長(zhǎng)率為響應(yīng)值, 利用響應(yīng)面法對(duì)滸苔發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化, 結(jié)果表明料液比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間對(duì)滸苔發(fā)酵工藝的影響順序?yàn)? 發(fā)酵溫度>料液比>發(fā)酵時(shí)間。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得出最優(yōu)選的滸苔發(fā)酵工藝為: 發(fā)酵溫度35 ℃, 料液比(1∶1.5) g·mL–1, 發(fā)酵時(shí)間84 h。在此工藝下進(jìn)行驗(yàn)證, 發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后滸苔的粗蛋白含量顯著高于滸苔原料, 且使用工藝優(yōu)化后的滸苔發(fā)酵產(chǎn)物所喂養(yǎng)的青蛤與投喂活體小球藻的青蛤在特定生長(zhǎng)率與存活率方面無(wú)顯著差異, 該結(jié)果也驗(yàn)證了優(yōu)化后的滸苔發(fā)酵工藝具備合理性及可靠性。通過(guò)該工藝能夠?qū)崿F(xiàn)將滸苔發(fā)酵產(chǎn)物作為貝的配合飼料, 進(jìn)一步說(shuō)明可以通過(guò)微生物發(fā)酵實(shí)現(xiàn)滸苔在飼料產(chǎn)業(yè)的再生利用, 為滸苔發(fā)酵飼料在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

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Optimization offermentation technology and evaluation offeeding effects

XIA Qing1, 2, SUN Ze-peng1, 2, LIU Mei-mei1, 2, LIAO Xiao-ting1, 2, DONG Zhi-guo1, 2,3

(1. Jiangsu Key Laboratory of Marine Bioresources and Eco-environment, Jiangsu Ocean University, Lianyungang 222006, China; 2. Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Jiangsu Ocean University, Lianyungang 222006, China; 3. Co-Innovation Center of Jiangsu Marine Bio-industry Technology, Jiangsu Ocean University, Lianyungang 222006, China)

In this study,was used as the fermentation strain, and the solid-state fermentation method was adopted for microbial fermentation of. According to the single-factor experiment, we explored the effects of three factors (fermentation time, fermentation temperature, and the material-liquid ratio) on the fermentation of. The optimal conditions forfermentation were obtained using orthogonal testing. Then, we used response surface methodology to optimize thefermentation process. In addition, this study carried out a clam,, culture experiment. We compared the growth performance ofand fermentedon feedingto verify the actual effect of the fermentation process. The results showed that the primary and secondary order of the three factors affecting thefermentation process was the fermentation temperature, the material-to-liquid ratio, and the fermentation time. Thefermentation conditions were a fermentation temperature of 35℃, material-to-liquid ratio of (1∶1.5) g·mL–1, and fermentation time of 84 h. The results showed that the crude protein content of the fermentedwas significantly higher than that of unfermented(< 0.05). No significant differences in specific growth or survival rates were detected inbetween feedingand fermented. These results provide a theoretical basis for applyingfeedstuff in actual production.

;; fermentation process; response surface methodology; process optimization

Sep. 29, 2021

S963.5

A

1000-3096(2022)10-0068-10

10.11759/hykx20210929008

2021-09-29;

2021-12-21

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助(CARS-49); 江蘇省自然資源發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)海洋科技創(chuàng)新項(xiàng)目(JSZRHYKJ202008); 江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新項(xiàng)目CX(20)3150; 江蘇省種業(yè)振興揭榜掛帥項(xiàng)目(JBGS [2021] 141); 江蘇省研究生科研與實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(SJCX20_1274)

[Project Supported by China Agriculture Research System of MOF and ARA (CARS-49); Marine Science and Technology Innovation Project of Jiangsu Province Natural Resources Development Special Fund, No. JSZRHYKJ202008; The independent Agricultural Innovation Project of Jiangsu Province, No. CX(20)3150; The Project for Seed Industry Vitalization of Jiangsu Province, No. JBGS [2021] 141; The Postgraduate Research & Practice Innovation Program of Jiangsu Province, No. SJCX20_1274]

夏青(1995—), 女, 江蘇省連云港人, 碩士研究生, 研究方向?yàn)樗a(chǎn)養(yǎng)殖, E-mail: summer_mu@126.com; 董志國(guó)(1977—),通信作者, 教授, 研究方向: 水產(chǎn)種質(zhì)資源與養(yǎng)殖生態(tài)學(xué), E-mail: dzg7712@163.com

(本文編輯: 趙衛(wèi)紅)