質譜分子網(wǎng)絡在天然產(chǎn)物結構研究中的應用

覃舒然，劉海翠，李大山，王文靜

云南中醫(yī)藥大學中藥學院,昆明 650500

化合物的結構分析對于天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)至關重要，特別是對于珍稀或名貴中藥材的物質基礎揭示。然而，高度多樣化的化合物結構解析需要耗費大量的時間和人力，這是對天然產(chǎn)物進行表征的最大挑戰(zhàn)之一，因此將質譜分子網(wǎng)絡技術應用于天然產(chǎn)物的結構研究中[1]。

液相色譜串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)是代謝組學中最常用的分析方法之一，然而，解釋這些復雜數(shù)據(jù)是天然產(chǎn)物研究的一大困難。近年來，分子網(wǎng)絡等新型生物信息學方法的出現(xiàn)，為復雜基質中已知化合物的識別提供了新的思路和角度。其中全球天然產(chǎn)物分子網(wǎng)絡集群數(shù)據(jù)庫(Global Natural Products Social Molecular Networking，GNPS)是一個開放的串聯(lián)質譜數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫，是目前唯一能夠實現(xiàn)分子網(wǎng)絡的公共基礎平臺[2]，能對LC-MS/MS生成的數(shù)據(jù)集進行分析[3,4]。GNPS中分子網(wǎng)絡的可視化是將每個光譜表示為一個節(jié)點，而光譜到光譜的排列則表示節(jié)點之間的聯(lián)系，可以于GNPS在線將相關分子圖譜可視化為分子網(wǎng)絡[5]。GNPS總共包括235850個譜圖和22644個化合物。GNPS不僅能夠做到鑒定已知化合物、類似物及自動分析分子網(wǎng)絡中化合物，同時還具備對多來源的二級質譜數(shù)據(jù)進行復制鏈接及存儲管理的功能[6]。

質譜分子網(wǎng)絡(molecular networking，MN)是一個MS/MS數(shù)據(jù)組織和可視化平臺。每個質譜被認為是一個向量，并使用余弦相似度與其他所有質譜進行比較，當兩個質譜之間的相似度高于閾值時，它們就會在分子網(wǎng)絡中連接在一起[7,8]。2012年Pieter教授首次提出分子網(wǎng)絡技術[9]，質譜分子網(wǎng)絡是一種基于串聯(lián)質譜分析(MS/MS)的方法，適用于各種類天然產(chǎn)物的分析，其目的是快速識別已知化合物和確定各種各樣未知的天然產(chǎn)物。簡言之，該方法就是收集串聯(lián)質譜數(shù)據(jù)，并基于片段相似性來構建網(wǎng)絡[10]。該技術已廣泛應用于天然產(chǎn)物、代謝組學和藥物發(fā)現(xiàn)等領域[11,12]。

目前，Trivella等[13]和Fox Ramos等[14]報道MN已被證明是一種非常有效的工具，可以快速識別復雜混合物中的天然產(chǎn)物并且有助于發(fā)現(xiàn)新的天然產(chǎn)物[15]；而Nothias-Esposito等[16]報道MN作為一種有效的工具用于以質譜為基礎的代謝組學中來表征植物中特殊代謝物的生成；Kang等[17]運用MN能將次級代謝物分類為類似的簇，該技術在天然產(chǎn)物研究中被用于篩選分離目標；Lei等[18]采用MN觀察到未加工附子及加工后附子的含量差異；除此之外，Tian等[6]報道了MN還可以清晰明了地觀測到不同品種不同產(chǎn)地茶葉的化學成分的差別，從而對茶葉進行定性定量評價；通過分析碎片離子的類型和碎片離子的相對含量變化來分析天然產(chǎn)物分子結構的變化及其官能團的轉化情況，來推斷天然產(chǎn)物是否生成或轉化。

1 質譜分子網(wǎng)絡技術

MN是基于串聯(lián)質譜數(shù)據(jù)的組織和可視化，通過光譜相似圖，揭示同源質譜片段的存在。由于結構類似的化合物具有相似的碎片光譜，它們的節(jié)點往往聚集在一起，形成類似物簇[19]。在相同的質譜分離條件下，若天然產(chǎn)物分子有類似的結構就會產(chǎn)生相似的質譜碎片離子，計算機可以根據(jù)系統(tǒng)的算法對進入高分辨質譜后形成的二級質譜碎片進行相似度計算，根據(jù)碎片相似度的高低，然后依照類似度將質譜碎片圖整合為一種能夠可視化的網(wǎng)絡圖譜。在MN中，密切相關的天然產(chǎn)物均具有相似的二級質譜片段，并根據(jù)相同的生物合成來源對這些天然產(chǎn)物進行分組，由此產(chǎn)生的簇允許對相同和類似分子進行可視化搜索，通過與天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫的比較，快速對已知代謝物進行檢測，并基于系統(tǒng)碎片化對類似物進行識別[3,20]。MN可以提供一種快速、靈敏的方法來同時處理分析某植物提取物的化學成分，有效節(jié)約人力時間和精力。

MN在過去5年已經(jīng)發(fā)展起來，成功地應用于天然產(chǎn)物化學結構研究，比如化合物鑒定、代謝物分離、生物研究、基因組測序和探索微生物菌株的優(yōu)先排序。這種技術與GNPS結合，能開放地獲取數(shù)據(jù)庫，用于對MS/MS譜數(shù)據(jù)共享，處理，加強特定化學類別和化合物的識別，并有助于對樣品進行進一步研究[13]。

GNPS平臺利用串聯(lián)質譜(MS/MS)數(shù)據(jù)對化合物進行注釋，允許具有高度相似的質譜的節(jié)點組成簇，有助于使代謝組學中化學結構可視化[21]。分子網(wǎng)絡與特征檢測方法相結合形成了基于特征的分子網(wǎng)絡(feature-based molecular networking，F(xiàn)BMN)。Phelan[22]提供了使用GNPS和FBMN生成分子網(wǎng)絡以注釋微生物天然產(chǎn)物的方法。但FBMN對骨架差異顯著的新化合物的有效鑒定仍然是困難的。He等[23]提出了一個基于生源砌塊的分子網(wǎng)絡(blocks-based molecular network，BBMN)策略，以進一步探索一葉萩型生物堿的未知化學空間，這一策略的應用能高效發(fā)現(xiàn)和鑒定Flueggeasuffruticosa中的三種新型一葉萩型生物堿，即suffranidines A～C。與經(jīng)典MN和FBMN相比，BBMN策略具有以下優(yōu)點：1)高選擇性：選擇性地識別有特定生物遺傳特征片段的相關化合物；2)更快速：將龐大的MS2數(shù)據(jù)優(yōu)化為更簡潔、更有針對性的數(shù)據(jù)，使后續(xù)的數(shù)據(jù)分析更加快速。這一策略不僅可以有效地發(fā)現(xiàn)植物中新的天然產(chǎn)物，而且可以廣泛地應用于探索動物、微生物和海洋生物等。

2 建立質譜分子網(wǎng)絡的步驟及其軟件

建立MN主要有以下幾個步驟：對樣品進樣分析，將進樣后所得到的質譜數(shù)據(jù)用Proteo Wizard軟件轉化為mzML、mzXML和mgf等通用格式文件，但因處理后依然會有一些干擾離子影響分子網(wǎng)絡的質量，所以需采用Mzmine2軟件再次處理，上傳至GNPS數(shù)據(jù)分析平臺，通過計算機計算比較樣品中所有化合物、標準化合物和GNPS收錄的化合物二級質譜圖之間的相似度，通常以余弦值表示(相似度越大，則余弦值越大)，然后根據(jù)相似度大小將所有分子離子數(shù)據(jù)整合成一張可視化的網(wǎng)絡圖譜(見圖1)。分子網(wǎng)絡圖中可直接看到樣品中所有未知化合物與標準化合物之間的結構相似度，使用Cytoscape軟件可視化分子網(wǎng)絡，可以將這些網(wǎng)絡具有的功能注釋和數(shù)據(jù)庫鏈接在一起研究，網(wǎng)絡圖中的節(jié)點代表分子，其中各節(jié)點之間由不同粗細的線段相連接，而這些線段代表這些分子之間相互作用的強弱[24,25]。

圖1 建立MN的步驟Fig.1 Steps of establishing MN

2.1 Proteo Wizard軟件簡介

Proteo Wizard是一款模塊化用于質譜數(shù)據(jù)讀取與格式轉化的開放源代碼軟件，Proteo Wizard可將質譜數(shù)據(jù)轉換為mzML、mzXML和mgf等基于文本的通用格式，用于表示描述掃描數(shù)、前體和二級質譜離子和產(chǎn)生分子所需強度的質譜數(shù)據(jù)[10]。

2.2 Mzmine2軟件簡介

Mzmine2是一個主要針對LC-MS數(shù)據(jù)，用于質譜數(shù)據(jù)處理的開源軟件。Mzmine2用于對批量或元mzXML文件來進行數(shù)據(jù)處理，把處理后的數(shù)據(jù)生成csv和mgf文件，并導出用于分子網(wǎng)絡[10]，且使用Mzmine2可以識別出同分異構體[26]。Perruchon等[27]證明Mzmine2與分子網(wǎng)絡的結合可以加速生物樣品的去復制，進而關注潛在的未知化合物。

2.3 Cytoscape軟件簡介

Cytoscape是一個開放源代碼軟件平臺，用于可視化分子相互作用網(wǎng)絡和生物途徑，并將這些網(wǎng)絡與注釋、基因表達譜和其他狀態(tài)數(shù)據(jù)集成在一起，根據(jù)片段相似度對波譜進行聚集后，將數(shù)據(jù)導入到Cytoscape中，顯示為節(jié)點和邊緣組成的網(wǎng)絡[3]。Cytoscape最初是為生物學研究設計的，現(xiàn)在已發(fā)展為一個復雜網(wǎng)絡分析和可視化的通用平臺。Cytoscape核心分布為數(shù)據(jù)集成、分析和可視化提供了一組基本特征。

3 質譜分子網(wǎng)絡技術的應用

3.1 鑒定復雜體系中天然產(chǎn)物的結構和發(fā)現(xiàn)新穎結構

由于生物信息學和分析化學的快速發(fā)展，特別是質譜的發(fā)展促進了天然產(chǎn)物的研究，串聯(lián)質譜(MS/MS)和MN的結合已被證明是一種非常有效的工具，可以快速識別復雜混合物中的天然產(chǎn)物，并且有助于新穎天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)[13,14,23]。

Yuan等[28]將UPLC-LTQ-Orbitrap MS與MN相結合對鐵線蓮屬植物中三萜皂苷類成分進行鑒別，可快速、可視化地區(qū)分6種植物中三萜皂苷的差異，其中長花鐵線蓮、美花鐵線蓮、準噶爾鐵線蓮和甘川鐵線蓮這4種鐵線蓮相似度較高，可在民族用藥中替代入藥；銀葉鐵線蓮三萜皂苷類成分較少，需謹慎替代入藥；鈍萼鐵線蓮中無三萜皂苷類成分，不可替代入藥。Huang等[29]在MN中識別出7個生物堿類型的粒子簇，藉此在夏天無中共鑒定和推測出52個化合物，其中有21個潛在的新化合物，6個化合物為首次在該植物中發(fā)現(xiàn)。Shen[30]建立酸棗仁已知成分的本地數(shù)據(jù)庫，對其成分進行分類總結，建立MN，通過UHPLC-Q-Orbitrap MS分析技術，構建了酸棗仁中化學成分快速識別的分析策略，鑒定了其提取物中的90個化合物，分別為64個黃酮類成分、21個生物堿類成分以及5個皂苷類成分。Nothias-Esposito等[16]采用MN比較了Euphorbiapithyusa和E.cupanii親緣關系較近的兩種大戟屬植物中二萜類化合物分布情況，發(fā)現(xiàn)10個曼西醇型化合物，6個premyrsinol衍生物和4個佛波醇酯。Pan等[31]以中藥金銀花為例，應用MN對其復雜多類型成分進行綜合鑒定，從中共鑒定出537個化合物，其中包括類黃酮和咖啡?？鼘幩岬男滦投垠w等潛在的新結構。Hu等[32]應用MN成功地鑒定了烘焙咖啡豆中7個II型二萜類化合物，并且發(fā)現(xiàn)了一系列新穎的含氮的對映貝殼杉烷型二萜。Lyu等[33]應用MN，對荔枝果肉提取物中的9種原花青素和11種黃酮苷進行了定性分析。Areas等[34]利用UHPLC-HRMS和分子網(wǎng)絡對Lessingianthusbrevifolius(Less.) H.Rob.(Asteraceae)進行了去重復研究，鑒定出其中的15個已知化合物，包括兩種倍半萜內酯和13種黃酮類化合物。Ruan等[35]根據(jù)MS/MS碎片模式的相似性創(chuàng)建GNPS分子網(wǎng)絡，運用Cytoscape 3.6.1軟件篩選結構相似的分子簇，在五味子中共鑒定出31個聯(lián)苯環(huán)辛二烯型木脂素類化學成分，其中的13個為首次鑒定。Jiang等[36]基于HPLC-Q-TOF-MS/MS數(shù)據(jù)的分子網(wǎng)絡分析來研究草烏中的二萜生物堿，九個標準品用于總結陽離子模式下的碎片特征，進一步用于確定兩組未知化合物的結構。Brel等[37]應用MN，允許通過串聯(lián)質譜數(shù)據(jù)集組織把特定化學成分作為目標，對57株昆蟲病原微生物進行了篩選，結果表明，粉棒束孢BSNB-1250乙酸乙酯(EtOAc)提取物表現(xiàn)出抗菌活性和潛在的新化學成分：paecilosetin及5個新的類似物。McManus等[38]利用MN對Trichodesmiumthiebautii提取物進行分析，發(fā)現(xiàn)其中充滿了鹵化化合物。隨后通過質譜分離得到了異毛霉素C和毛霉素G～I。這些新的物質與之前描述的毛霉素具有結構的變化，通過比較研究能夠發(fā)現(xiàn)與小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞毒性相關的結構特征。Rivera-Mondragón等[4]采用基于UPLC-MS/MS的MN與常規(guī)分離和核磁共振相結合的非靶向代謝組學方法對Crescentiacujete果肉進行植物化學分析，分離并鑒定出66個化學成分。de Oliveira等[3]基于非靶向串聯(lián)質譜的MN快速鑒定Adenocalymmaimperatoris-maximilianii萃取物中63個已知的黃酮類化合物(含同分異構體)，還利用MN首次從該植物中推導得到含異戊二烯基的黃酮衍生物。Reginaldo等[39]通過HR-LC-ESI-MS/MS分析脫水(旱季在其自然棲息地收獲)和水合(植物通過水合作用后在實驗室培育)的Selaginellaspp.標本，首次運用MN對Selaginellaspp.中39個化學成分進行結構推定，主要為卷柏素和黃酮類化合物。Purves等[40]利用基于HR-MS/MS的MN對發(fā)酵提取物進行比較，結果顯示，40%和42%的母離子分別是由南極和蘇格蘭的細菌分離物產(chǎn)生的，只有8%的物質在這些地點中是共有的，表明生物地理高度影響其化學成分；研究所得到的MN中包含超過3500個母離子，質荷比范圍為m/z149～2 558，說明產(chǎn)生了豐富的次生代謝產(chǎn)物。Song等[41]采用MN對異喹啉類生物堿進行聚類，尋找可能的化學成分。Wang等[42]基于MS/MS的分子網(wǎng)絡來研究Aspergilluscaelatus的化學成分，從而發(fā)現(xiàn)了新的二酮哌嗪二聚體和曲霉素。Freire等[43]通過基于特征的分子網(wǎng)絡、去復制和分離，對海綿Agelasdispar的甲醇部分進行研究，發(fā)現(xiàn)了新的溴吡咯衍生物。Zhao等[44]基于UPLC-Q-TOF-MS、多元統(tǒng)計分析和MN的非目標代謝組學方法在Morchellasp.與對照組之間鑒定出的50個差異化學成分，此外，基于分子網(wǎng)絡分析，鑒定了三種desferri-ferricrocin及其鐵螯合物的同源化合物，包括desferri-ferrichrome、desferri-ferrichrome C和一個新注釋的同系物。Caldas等[45]考慮到Gymnopilusimperialis可能含有大量化學成分，GNPS具有尋找化學成分、節(jié)省時間以及對天然產(chǎn)物的分離和表征方面的功能，從G.imperialis的甲醇、二氯甲烷和乙酸乙酯提取物中注釋了24個低聚異戊二烯，其中4個來自GNPS光譜庫匹配，20個來自基于分子網(wǎng)絡的預測。Luo等[46]基于MS/MS的分子網(wǎng)絡被用于開發(fā)Xylariasp.的肽天然產(chǎn)物，從而發(fā)現(xiàn)了一種新的環(huán)七肽。Hu[47]通過UPLC-Q-TOF-MS技術結合診斷離子與分子網(wǎng)絡分析策略，從當歸與酒當歸中鑒定出126個化合物，包括28個苯酞類，32個有機酸類，8個香豆素類，8個黃酮類，16個氨基酸類，31個其它化合物。

Wu等[48]采用基于GNPS特征網(wǎng)絡的方法對黃金芽綠茶中9個黃酮苷、6個兒茶素和3個黃酮醇進行了跟蹤并利用UPLC-MS2數(shù)據(jù)和GNPS分子網(wǎng)絡技術從黃金芽綠茶中發(fā)現(xiàn)具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的新木質素苷類化合物。Zhang等[49]采用基于GNPS的MN分析中根據(jù)碎片結構的相似性，將燈盞細辛注射液中的化合物分為2大類別，分別是咖啡酰酯衍生物和黃酮類。Xu[50]利用基于GNPS平臺MN分析MyrotheciumroridumIFB-E091發(fā)酵產(chǎn)物組分的化學成分，以新環(huán)十肽MR-1和MR-2作為種子節(jié)點進行分子網(wǎng)絡分析，結果發(fā)現(xiàn)，組分Fr.5-3中存在環(huán)十肽化合物，除已分離得到的4個新環(huán)十肽MR-1～MR-4外，還存在3個環(huán)十肽MR-5～MR-7。

此外，MN還可以與空間分辨特征、雙電離模式MS/MS等相結合對天然產(chǎn)物進行結構分析，Kuo等[1]在空間分辨特征的指導下，將MN應用于沉香的結構分析中，對3大類的2-(2-苯乙基)色酮及其類似物進行了表征。Li等[51]將基于特征的分子網(wǎng)絡(FBMN)和雙電離模式MS/MS相結合從銀杏葉提取物和銀杏葉中成功鑒定出95個化合物，其中包括黃酮苷、銀杏內酯、木脂素苷、萜類和酚類化合物。

研究者們常采用LC-MS分析天然產(chǎn)物中的化學成分，采集各類樣品中化合物的質譜數(shù)據(jù)，再通過PCA、PLS-DA等得到的載荷圖和散點圖等對樣品進行分類總結，而采用了MN就能對其進行可視化處理，快速鑒定，得出結論。

3.2 鑒定天然產(chǎn)物在生物體內的代謝產(chǎn)物

質譜與代謝物的化學結構相聯(lián)系，MN能夠根據(jù)生物體內的代謝物的結構相似性進行分組，通過檢測代謝物之間相似性的關鍵信息，鑒定生物樣品的代謝物[16,52]。

采用MN可以快速地對生物體內的代謝產(chǎn)物進行鑒定。Gao等[53]將串聯(lián)質譜與MN結合，通過GNPS觀察蛹蟲草提取物處理的白血病細胞和對照組的代謝情況，對藥用真菌提取物和癌細胞的代謝產(chǎn)物結構進行解析，并半定量地識別其變化。Said等[10]基于LC-MS/MS的MN方法鑒定人類尿液中的可可酚代謝物，目的是提出一種有生物活性的酚類代謝物鑒定的方法。Xiong等[54]建立了UPLC-HRMS結合質譜分子網(wǎng)絡分析血漿中代謝物的方法，共定性檢測到187個代謝物。Farag等[55]通過GNPS平臺的分子網(wǎng)絡，利用LC串聯(lián)質譜技術，在體外培養(yǎng)人腸道微生物群后，共鑒定出生咖啡豆中的36個代謝產(chǎn)物，包括4個未報道的烷基肉桂酸酯和6個新的生物轉化產(chǎn)物。

此外，MN還能跟藥代動力學相結合進行相關研究，Wang等[56]將質譜數(shù)據(jù)整合到分子網(wǎng)絡中，以發(fā)現(xiàn)天然藥物Ardisiajaponica(Thunb.) Blume的活性成分，在大鼠血漿中共識別出8個吸收的原型成分。Seo等[57]基于MS/MS的分子網(wǎng)絡系統(tǒng)研究了柘樹葉的提取物中生物活性成分的藥代動力學特征，使用LC-QTOF/MS獲得血漿樣品的產(chǎn)物離子質量數(shù)據(jù)，并進行分子網(wǎng)絡分析，由此產(chǎn)生的分子網(wǎng)絡圖表明，槲皮素和山奈酚的葡萄糖醛酸代謝物是主要的循環(huán)物種。

3.3 對天然產(chǎn)物化學成分的定量分析

基于TOrTE(tandem-MS origin tracing engine)的MN可以快速分析不同來源樣品粗提物中的目標化合物，并對其進行定量表征[6]。先把每個節(jié)點的原始數(shù)據(jù)用TOrTE轉化成為“cluster_info.txt”格式的文件，再將這些文件轉化成“mzXML”格式的文件，而每個節(jié)點的色譜峰用Proteo Wizard軟件進行提取，計算每個峰的峰面積，最后合并峰面積，并用Cytoscape軟件可視化為餅狀圖。每個節(jié)點代表一種化學成分，節(jié)點中不同顏色表示某一化學成分的不同來源，顏色在每個節(jié)點中占面積的大小表示某一化學成分在不同來源樣品中量的多少，即面積越大，其含量越大；而面積越小，其含量越小[24](見圖2)。可有效避免使用大量標準品進行定量的限制，提升實驗結果的準確度。

圖2 MN的定量過程Fig.2 Quantitative process of MN

Lei等[18]以高通量、高靈敏度的UPLC-Q-TOF/MS為基礎，采用MN對未加工附子及加工后附子的整體化學成分進行了綜合檢測和鑒定，鑒定出145個化合物，分析其含量差異。Winnikoff等[58]將培養(yǎng)的20種海洋藍藻粗提物的MS/MS數(shù)據(jù)集導入GNPS，生成分子網(wǎng)絡，對幾種具有生物活性和生物合成吸引力的脂肽malyngamide C進行定性和定量，其中產(chǎn)量最高的是巴拿馬的Okeaniahirsuta(PAB10FEB10-01)，其含量達2.4%。Calabrese等[59]基于特征的分子網(wǎng)絡(FBMN)研究Zhanthoxylumheitzii中代謝物在植物器官中的分布，并發(fā)現(xiàn)潛在的新成分，總共檢測到143個代謝物，分別為生物堿、木脂素、多酚、脂肪酸和氨基酸類的代謝物，并對不同器官進行了半定量分析。Ma等[60]運用液相色譜-串聯(lián)質譜法以及基于質譜的分子網(wǎng)絡進一步分析次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和多樣性，在糙米培養(yǎng)基中分別加入金合歡醇(1 μmol/L)、法尼焦磷酸銨鹽(5 μmol/L)、亞硫酸氫鈉甲萘醌(10 μmol/L)、3-氨基-L-酪氨酸(1 mmol/L)等4種誘導條件均可調控菌株C23-3次級代謝產(chǎn)物發(fā)生較明顯變化，其丁內酯、土震素和洛伐他汀類化合物的多樣性和產(chǎn)量較為突出。Li等[61]基于分子網(wǎng)絡，明顯觀察到炮制前后女貞子的化學成分在種類和含量上發(fā)生了很大變化。

3.4 天然產(chǎn)物中活性成分的篩選、分離與制備

MN將不同的天然產(chǎn)物分類為類似的支架簇，該技術在天然產(chǎn)物研究中被用于篩選分離目標[17]。

可將MN與生物活性結合對天然產(chǎn)物進行篩選分離：Nothias等[62]開發(fā)了以生物活性為基礎的MN，用于發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物生物測定引導的分離中的藥物先導物，提出了生物活性分子網(wǎng)絡的概念。Olivon等[19]利用多信息分子網(wǎng)絡分離具有生物活性的天然產(chǎn)物，使用大量的分子網(wǎng)絡嵌入不同的信息層(生物活性和分類數(shù)據(jù))，以突出粗提物的化學多樣性中潛在的生物活性支架，通過從兩個植物來源(Bocquillonianervosa和Neoguillauminiacleopatra)分離活性次生代謝產(chǎn)物瑞香烷型二萜原酸酯和4種12-deoxyphorbols，它們抑制Wnt信號通路，并顯示出對CHIKV病毒的抗病毒活性。Raheem等[63]采用代謝組學和生物活性指導的分離方法，并結合MN，從英國風信子(Hyacinthoidesnon-scripta)中尋找到具有抗錐蟲體活性為98.9%(20 μmol/L)的norlanostane型皂苷。Olivon等[64]通過多信息分子網(wǎng)絡的方法，從Codiaeumpeltatum中獲得抗病毒化合物。Cabral等[65]基于MN靶向分離Conchocarpusfontanesianus中6個新的吲哚吡多喹唑啉類生物堿。Naman等[66]結合MN和生物活性測定指導下的分離，可以從American Samoan采集的cf.Symplocasp.樣本中靶向分離出一種新的具有生物活性的環(huán)八肽——samoamide A，將生物活性篩選與MN的化學信息學策略相結合作為發(fā)現(xiàn)工具，加速了具有新的化學結構和預期生物活性的天然產(chǎn)物的靶向分離。Han等[67]基于LC-MS/MS分子網(wǎng)絡的指導下，從Penicilliumcellarum中分離出具有葡萄糖攝取刺激活性的七種新的被疣青霉素衍生物penicicellarusins A～G，以及三種已知的類似物。

MN與結構相結合對天然產(chǎn)物進行篩選分離：Wu等[68]提出了結構導向分離的概念，建立了一個抗病毒倍半萜分子網(wǎng)絡，對Saussurealappa(Decne.) C.B Clarke進行了研究，分離了七種新倍半萜，即lappaterpenes A～G。Mi等[69]基于MS/MS質譜導向策略，將芫花花蕾的乙醇提取物通過硅膠粗分得到的餾分進行LC-MS/MS測試，將所獲得的數(shù)據(jù)上傳到GNPS質譜分析平臺進行進一步分析，分子網(wǎng)絡分析顯示有明顯與已知對照品化合物yuanhuacine節(jié)點連接的簇，這些節(jié)點則被視為瑞香烷型二萜類的衍生物，以此確定了富含二萜類成分的餾分，最終分離得到了4個未被描述以及8個已知的瑞香烷型二萜。

MN還能夠與核磁共振波譜法(nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)、層次聚類分析(hierarchical clustering analysis，HCA)和超臨界流體色譜(supercritical fluid chromatography，SFC)等其他技術、方法相結合靶向分離目標化合物，尤其是與NMR結合(見表1)。

表1 MN與NMR、HCA和SFC結合分離目標化合物Table 1 MN was combined with NMR,HCA and SFC to separate the target compound

采用MN與一些傳統(tǒng)技術和方法相結合可以快速完成對復雜化學成分進行鑒定，對樣品間的成分差異可視化，不僅能大大縮減了質譜、核磁等數(shù)據(jù)分析化合物結構的工作量，有效減少盲目性，而且能直觀快速分析出化合物在不同樣品中的分布。

3.5 天然產(chǎn)物的生物合成途徑研究

Tian等[6]在Cytoscape軟件上分析在綠茶和黑茶中茶氨酸和表沒食子兒茶素沒食子酸酯的相對含量變化，將非發(fā)酵茶的綠茶與發(fā)酵茶黑茶做對比發(fā)現(xiàn)，二者茶氨酸的相對含量均減小，而表沒食子兒茶素沒食子酸酯的相對含量卻在增加。Kalinski等[75]基于MN分析，然后進行制備純化，以繪制七個樣本提取物中新的和已知的吡咯烷醌和相關化合物的多樣性，分析了Tsitsikammafavus海綿的次級代謝產(chǎn)物庫，其中兩個樣本表現(xiàn)出不同的形態(tài)和化學特征：不含discorhabdins，只有微量的tsitsikammamines，相反，有大量未分支和鹵化的makaluvamines，這項研究為推測latrunculid海綿中pyrroloiminoquinone的生物合成途徑提供了新的線索。

上述研究通過運用MN分析不同基團的相對含量變化，推測各基團的取代和合成順序，大大減少了生物合成途徑的工作量，為研究天然產(chǎn)物的生物合成途徑提供了參考。通過MN篩選出不同碎片離子，查找天然產(chǎn)物特征官能團的特征碎片離子，通過對比驗證，建立相關性，并以此為方法通過分析碎片離子的種類變化和相對含量變化追蹤天然產(chǎn)物分子結構變化及官能團的相互轉化，從而推斷天然產(chǎn)物的生成及轉化。

4 結語與展望

在過去的幾年中，MN作為一種新興工具[43]被提出來用于簡化天然產(chǎn)物的結構研究，已經(jīng)成功應用于天然產(chǎn)物中化學成分及活性成分的發(fā)現(xiàn)、分離與制備、結構鑒定、定量分析。MN適用于對天然產(chǎn)物進行體內成分及其代謝產(chǎn)物的研究，可更好地闡釋其藥效物質基礎和代謝過程[24]。

運用MN比對特征碎片離子，分析其種類和相對含量變化，得知天然產(chǎn)物分子結構變化及官能團的相互轉化，可用于推斷天然產(chǎn)物的生源合成途徑，但在文獻調研中發(fā)現(xiàn)國內外相關報道尚不多見，這也許將會是MN用于天然產(chǎn)物研究的一個新方向。

綜上所述，到目前為止，MN主要應用于天然產(chǎn)物的結構鑒定，其與其他技術相結合，是天然產(chǎn)物的結構研究特別是新穎結構和活性成分發(fā)現(xiàn)的一種高效快捷方法。體內代謝、定量分析以及生物合成途徑方面的研究較少，是今后研究人員可以關注的方向。