核磁共振技術(shù)在藥物檢測中的應(yīng)用進(jìn)展

劉雅琴，余明新，何 玲

浙江大學(xué)化學(xué)系，杭州 310027

核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)波譜是一種基于特定原子核在外磁場中吸收與其裂分能級間能量差相對應(yīng)的射頻場能量而產(chǎn)生共振現(xiàn)象的分析方法。1946年由美國物理學(xué)家Purcell和Bloch等[1-3]闡明磁共振現(xiàn)象并共同獲得諾貝爾物理獎(jiǎng)。在早期的研究中，藥物結(jié)構(gòu)的確定主要通過各種化學(xué)反應(yīng)，如制備衍生物、化學(xué)降解、顏色反應(yīng)等方式來完成，主要獲得官能團(tuán)但無法確定全部結(jié)構(gòu)，一個(gè)復(fù)雜分子的結(jié)構(gòu)鑒定甚至花費(fèi)幾十年的努力。近些年，對于難以結(jié)晶的分子，晶體海綿法、冷凍電鏡等技術(shù)相繼被開發(fā)用于分子結(jié)構(gòu)測定，但是對于無定形及低晶格能的非結(jié)晶分子，上述方法仍然捉襟見肘，難于應(yīng)付。隨著波譜學(xué)技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，對藥物的研究取得顯著進(jìn)展，核磁共振成為最實(shí)用、最全面的分析方法，其精確構(gòu)象分析是單晶衍射與電鏡所無法比擬。與其它分析方法相比較，核磁共振的優(yōu)點(diǎn)有以下幾種：①提供豐富且精確的結(jié)構(gòu)信息，由拉莫爾頻率獲知原子核；化學(xué)位移推出官能團(tuán)；自旋-自旋-偶合得出原子的相關(guān)性；偶極偶合獲得空間位置關(guān)系；弛豫現(xiàn)象用于動(dòng)力學(xué)研究。②簡便性，藥物不需要進(jìn)行繁雜的前處理過程，可避免處理過程中的誤差，且分析時(shí)間短。③無損傷性，在樣品量非常有限的情況下，在對其進(jìn)行核磁分析后，沒有任何的損壞和浪費(fèi)，性質(zhì)不發(fā)生改變，還可以進(jìn)行再使用。特別是二維核磁共振的發(fā)展使其成為化學(xué)結(jié)構(gòu)研究的極為重要工具，同時(shí)也打開了通向藥學(xué)、生物醫(yī)學(xué)研究的新窗口，在細(xì)節(jié)上揭示了結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。對于一維譜信號重疊嚴(yán)重、無法準(zhǔn)確歸屬，難以解析的情況，需要借助二維核磁共振譜技術(shù)來解決。通過COSY或TOCSY譜確定分子中各個(gè)位置的質(zhì)子；在HSQC譜上通過質(zhì)子找到對應(yīng)的碳信號；用HMBC譜確認(rèn)信號的歸屬，并解析碳與質(zhì)子的連接位置及連接順序等。核磁共振波譜正響應(yīng)現(xiàn)代藥物開發(fā)需要，提供藥物相互作用的信息、特定的分子靶點(diǎn)和藥理作用位點(diǎn)。隨著核磁共振儀器硬件和脈沖方法的不斷發(fā)展，加之其多功能性，它成為結(jié)構(gòu)研究特別是藥物研究的重要工具。核磁共振可提供一套多功能的實(shí)驗(yàn)方法，為藥物發(fā)現(xiàn)提供了重要信息，從合成產(chǎn)物的表征、天然產(chǎn)物的開發(fā)到生物系統(tǒng)分子結(jié)構(gòu)的研究。本文主要綜述NMR技術(shù)應(yīng)用于藥物檢測及其相關(guān)研究進(jìn)展。

1 NMR波譜在藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用

核磁共振波譜廣泛用于藥物分析以識別藥物及其雜質(zhì)，該技術(shù)非常適用于活性藥物成分(API)的質(zhì)量評估[13-15]，定量核磁共振在藥物分析中可用于確定雜質(zhì)水平并闡明其結(jié)構(gòu)以及評估殘留溶劑的含量[16,17]。它可以通過手性添加劑測定異構(gòu)體組成，即非對映體和對映體過量的比率[18-21]。利用NMR可以提供許多重要的結(jié)構(gòu)信息，各種不同原子可產(chǎn)生不同的磁共振波譜，如1H、13C、7Li、19F、31P、77Se等。2020年Oriol等[22]為了在實(shí)驗(yàn)上評估鉍介導(dǎo)的含氟有機(jī)硼化物中間體的形成，通過1H、11B、19F和13C核磁共振證實(shí)了含氟有機(jī)硼的形成。Geeson等[23]報(bào)道了用于生產(chǎn)高純度硅的三氯氫硅，將三偏磷酸還原為一種新型的二(三氯氫硅基)磷化陰離子，通過29Si和31P核磁共振的特征對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。Binas[24]最新觀點(diǎn)認(rèn)為RNA也成為了藥物發(fā)現(xiàn)的潛在靶點(diǎn)，他報(bào)道用19F-NMR作為先導(dǎo)物鑒定的主要方法，對14種不同大小、不同結(jié)構(gòu)的RNA進(jìn)行102個(gè)片段文庫的篩選。Zhou等[25]為了推斷一種新型含硒柱芳烴具有可逆的氧化還原反應(yīng)性，使用77Se NMR波譜研究硒化物和硒氧化物之間的可逆轉(zhuǎn)化。柱芳烴含有硒氧化物部分，在77Se NMR中顯示化學(xué)位移δ為865.85，被維生素C還原后其化學(xué)位移δ變?yōu)?69.39，表明硒氧化物部分轉(zhuǎn)化為硒化物基團(tuán)；添加過氧化氫后化學(xué)位移變回865.85。Tan等[26]利用NMR中的擴(kuò)散序列譜(diffusion ordered spectroscopy，DOSY)對生物膜加入親水高分子后兩個(gè)反應(yīng)物進(jìn)行虛擬分離，測定擴(kuò)散速率差，如圖1所示，均勻分散的水-表面活性劑(AOT)-癸烷(decane)多相系統(tǒng)中各組分的擴(kuò)散系數(shù)通過核磁共振測量獲得,在該系統(tǒng)中水分子的運(yùn)動(dòng)被限定在納米水滴中。因此，測量所得的水的擴(kuò)散速率不是單個(gè)分子的自擴(kuò)散系數(shù)，而是納米水滴的擴(kuò)散系數(shù)。由于水分子的運(yùn)動(dòng)被限定在納米水滴中，其擴(kuò)散系數(shù)遠(yuǎn)小于自由狀態(tài)下單個(gè)水分子的擴(kuò)散系數(shù)。從二維的擴(kuò)散排序核磁共振譜(2D DOSY NMR)中可看出，作為分散相的納米水滴的擴(kuò)散系數(shù)在7×10-7m2/s之間，而連續(xù)相中癸烷分子的擴(kuò)散系數(shù)在4×10-5m2/s左右，驗(yàn)證了成功制備一種具有圖靈結(jié)構(gòu)的新型生物膜?？梢?，核磁共振中各種不同類型譜圖的發(fā)展推動(dòng)著NMR在藥物發(fā)現(xiàn)環(huán)節(jié)更加廣泛的應(yīng)用。

圖1 核磁共振DOSY譜表征生物膜的圖靈結(jié)構(gòu)Fig.1 Turing structure of biofilm by DOSY NMR

研究顯示NMR波譜技術(shù)在藥物高通量篩選(high throughput screening，HTS)[27-29]和基于結(jié)構(gòu)的藥物發(fā)現(xiàn)[30-32]方面已發(fā)展成為新療法發(fā)現(xiàn)過程背后的驅(qū)動(dòng)力[33]。核磁共振作為主要的分析工具用于確定合成和天然產(chǎn)品化學(xué)先導(dǎo)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成[34,35]。核磁共振高通量配體篩選通常成為驗(yàn)證和識別新化學(xué)線索[36,37]；采用基于片段的方法意味著通過核磁共振快速篩選小型化學(xué)庫可以實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)空間探索的指數(shù)增長，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過傳統(tǒng)的HTS方法[38]。

天然產(chǎn)物是藥物發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要來源，特別是隨著核磁共振方法的靈敏度和分辨率的提高，同時(shí)通過NMR與HPLC聯(lián)用使得快速獲得天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)信息成為現(xiàn)實(shí)。HPLC-NMR是高效液相色譜(HPLC)和核磁共振(NMR)聯(lián)用系統(tǒng)，是一種高效的技術(shù)，對于復(fù)雜樣品可以更好地進(jìn)行快速的分離鑒定，應(yīng)用于天然產(chǎn)物分析、代謝產(chǎn)物分析、藥物雜質(zhì)分析、結(jié)構(gòu)鑒定等領(lǐng)域[39]。HPLC-NMR的主要缺點(diǎn)是其低靈敏度，但可通過引入超低溫探頭和增加磁場強(qiáng)度加以克服。Li等[40]從植物內(nèi)生真菌Fusariumguttiforme次生代謝產(chǎn)物中分離純化得到7種化合物，并通過核磁共振等波譜學(xué)手段鑒定其結(jié)構(gòu)。Lever等[41]使用HPLC-NMR在海洋褐藻中的提取物中，找到4種未報(bào)道的化合物和8種已經(jīng)報(bào)道的化合物，其中5種化合物具有選擇抗菌活性。由于海洋生物活性物質(zhì)具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜且含量極微的特性，LC-NMR的聯(lián)用展現(xiàn)了無法比擬的在線檢測和結(jié)構(gòu)解析的鑒定能力，極大地簡化了分析過程，較好地實(shí)現(xiàn)了天然產(chǎn)物樣品的在線結(jié)構(gòu)分析。

2 NMR波譜在藥物相互作用中的應(yīng)用

在藥物研究中，NMR是研究配體及其靶點(diǎn)相互作用非常重要的一個(gè)工具。核磁共振確定化學(xué)結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)依賴于磁化信號通過共價(jià)鍵或空間(構(gòu)象)從一個(gè)原子核轉(zhuǎn)移到另一個(gè)原子核。此外，每個(gè)原子核固有的弛豫速率，可以通過調(diào)節(jié)分子的NMR譜來測量，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同，可能是構(gòu)象交換、化學(xué)交換、局部或全局動(dòng)力學(xué)，也可能是分子的整體旋轉(zhuǎn)和平移擴(kuò)散。核磁共振技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)之一是能夠獲得相對簡單的波譜，能夠直接識別潛在配體混合物中的弱結(jié)合成分，識別配體的結(jié)合表位以及識別目標(biāo)蛋白質(zhì)中的結(jié)合口袋，從而了解分子中單個(gè)核的環(huán)境；人們可以利用這些相同的優(yōu)勢來測量小分子與其靶點(diǎn)的結(jié)合。小分子在溶液中很快地重新定向和擴(kuò)散產(chǎn)生尖銳且分辨率良好的共振，而大分子在溶液中更緩慢地重新定向和擴(kuò)散產(chǎn)生廣泛且分辨率較低的信號。Garavis等[42]基于19F NMR片段的篩選，使用355個(gè)片段文庫對G-四鏈體RNA確定了幾個(gè)對其他核酸靶點(diǎn)具有選擇性的片段。NMR還被用于證明一些小分子與HIV反式激活反應(yīng)元件(transactivation response element，TAR)的結(jié)合穩(wěn)定了低填充激發(fā)態(tài)，強(qiáng)調(diào)了動(dòng)力學(xué)在核酸中的重要作用[42-45]。

通過核磁共振波譜研究配體-目標(biāo)結(jié)合相互作用有兩種主要方法[46,47]：配體觀察法和目標(biāo)觀察法。前者依賴于配體NMR信號中的結(jié)合誘導(dǎo)變化，傳統(tǒng)上由飽和轉(zhuǎn)移差譜NMR(saturation transfer difference NMR,STD NMR)實(shí)驗(yàn)表示，另一方面，目標(biāo)觀察方法研究同位素標(biāo)記目標(biāo)中的結(jié)合誘導(dǎo)信號變化，異核單量子相關(guān)譜(heteronuclear single quantum coherence，HSQC)最能代表這個(gè)類別，它提供了常用的配體和靶點(diǎn)觀察技術(shù)的信息。實(shí)驗(yàn)方法和標(biāo)記方案的改進(jìn)以及最新的生物學(xué)發(fā)現(xiàn)將繼續(xù)激發(fā)人們對新的藥物靶點(diǎn)的興趣。STD NMR譜是最靈敏的檢測配體結(jié)合的實(shí)驗(yàn)，如圖2所示[12]，采用STDNMR實(shí)驗(yàn)觀測配體與蛋白結(jié)合的行為，(a)結(jié)合配體(藍(lán)色)在束縛態(tài)和自由態(tài)之間進(jìn)行緩慢翻轉(zhuǎn)處于平衡狀態(tài)，而非結(jié)合配體(紅色)不受目標(biāo)存在的影響。(b)核磁共振氫譜顯示了結(jié)合和非結(jié)合配體的信號。(c)對于結(jié)合配體，NMR信號變寬，而對于非結(jié)合配體，信號不受影響。(d)在STD-NMR實(shí)驗(yàn)中，利用一系列選擇性脈沖使蛋白質(zhì)飽和擴(kuò)散到靶區(qū)，最終通過結(jié)合平衡轉(zhuǎn)移到自由配體。(e)STD-NMR譜僅反映屬于結(jié)合配體的信號，而未觀察到來自非結(jié)合配體的信號。(f)在WaterLOGSY(Water-ligand observed via gradient)實(shí)驗(yàn)中，樣品利用水分子通過NOE選擇性轉(zhuǎn)移使得結(jié)合配體的信號與非結(jié)合配體的信號相反。(g)WaterLOGSY譜顯示非結(jié)合配體與相關(guān)的結(jié)合配體的信號正好反向。該研究揭示了通過NMR觀察生物分子的溶液行為可以獲得有關(guān)其結(jié)構(gòu)、動(dòng)力學(xué)和相互作用的信息，這對于配體與靶點(diǎn)相互作用的新穎識別至關(guān)重要。

圖2 利用STD NMR實(shí)驗(yàn)觀測配體的結(jié)合行為Fig.2 The binding behavior of ligands was observed using STD NMR experiment

3 核磁共振技術(shù)在藥物代謝組學(xué)中的應(yīng)用

磁共振波譜可作為藥物治療反應(yīng)評估的定量方法，能提供溶液里藥物代謝組學(xué)的結(jié)構(gòu)信息，如原子水平上的修飾位點(diǎn)、區(qū)域和立體異構(gòu)體特征、動(dòng)態(tài)物理性質(zhì)以及如何測量這些參數(shù)[48,49]。事實(shí)上，該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于不同領(lǐng)域的代謝物的無創(chuàng)體內(nèi)分析，例如癌癥中一些內(nèi)源性代謝物的31P、13C、19F和1H磁共振波譜[50-52]信號可以被觀察到。例如，19F NMR已經(jīng)成功地應(yīng)用于評估氟化藥物的藥代動(dòng)力學(xué)[53]。根據(jù)時(shí)間過程，這些測定與二維和更高維方法相結(jié)合以區(qū)分藥物信號與不可避免的重疊共振，并獲得更多信息，當(dāng)然這些例子基本上僅限于高濃度給藥的癌癥治療藥物。一般來說核磁共振波譜在藥理學(xué)研究中的作用是研究藥物對組織形態(tài)、生理學(xué)和生物化學(xué)的影響，而不是研究藥物本身在機(jī)體中的去向[54,55]。可見，核磁共振是一種無損地表征多種元素的重要方法。

氫核磁共振波譜已成功應(yīng)用于心力衰竭患者的可靠診斷方法。Kang等[56]從尿苷1H NMR測量中獲得代謝產(chǎn)物抑制了酮體水平的增加，同時(shí)降低了三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物的水平，表明能量代謝改變，包括三羧酸循環(huán)和脂肪酸代謝的改變，這些是通過樣品的氫譜在規(guī)定化學(xué)位移處出現(xiàn)特征峰信號的方法進(jìn)行鑒別。觀察到涉及甲基丙二酸和核苷酸代謝的代謝途徑中的擾動(dòng)。1H NMR光譜已經(jīng)成為植物代謝信息處理的一項(xiàng)強(qiáng)有力的技術(shù)，主要是因?yàn)榕c其他分析技術(shù)相比，該技術(shù)對樣品需求量小，無破壞性，定量準(zhǔn)確。核磁共振波譜將繼續(xù)成為藥物代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)闡明工具的重要組成部分，它提供的信息類型與從藥物代謝工作中使用的主要分析工具HPLC-MS獲得的信息可完美互補(bǔ)[57]。

4 固態(tài)核磁共振技術(shù)在固態(tài)藥物分析中的應(yīng)用

固態(tài)核磁共振(solid state nuclear magnetic resonance，ssNMR)在宏觀和微觀尺度上獲得的分子特性為藥物和藥物產(chǎn)品的物理化學(xué)穩(wěn)定性提供了關(guān)鍵信息，能夠確定藥物作為純物質(zhì)或在配方產(chǎn)品中的狀態(tài)，而無需從配方中提取。該藥物通常表現(xiàn)出與賦形劑不同的共振，從而有可能在制劑中識別藥物。定量碳譜交叉極化魔角旋轉(zhuǎn)(cross polarisation-magic angle spinning，CP-MAS)固態(tài)核磁共振方法已廣泛用于量化原料藥和固體劑量中的多晶型和形態(tài)轉(zhuǎn)化百分比。13C-CP-MAS NMR可以量化物理混合物中API多晶型、水合物、溶劑化物、鹽和無定形形式的相對數(shù)量[58-60]。Kumar等[61]采用固態(tài)核磁共振技術(shù)研究一組抗癌藥物(5-氟尿嘧啶、阿霉素和柔紅霉素)在ZnO納米粒上的吸附行為，ssNMR數(shù)據(jù)闡述了自由和氧化鋅表面吸附藥物樣品的13C CP-MAS NMR譜顯示出明顯的譜線展寬和化學(xué)位移變化，表明了可能的吸附模式。弛豫測量證實(shí)了ZnO表面5-氟尿嘧啶的剛性結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)特性的變化，它證明了固態(tài)核磁共振波譜在獲取基于納米顆粒的詳細(xì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)信息方面的有效性和針對性。

魔角旋轉(zhuǎn)固態(tài)核磁共振波譜也可用于闡明脂膜中功能重要的蛋白質(zhì)-配體相互作用。固態(tài)核磁共振方法[62]包括多核檢測以獲得全面的結(jié)構(gòu)信息，距離測量以定位配體結(jié)合位點(diǎn)以及動(dòng)態(tài)核極化和1H檢測以提高光譜靈敏度。固態(tài)核磁共振波譜技術(shù)最近用于表征酶與藥物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，Vasa等[63]展示了一個(gè)29 kDa碳酸酐酶乙酰唑胺復(fù)合物，非氘化的500 μm樣品通過固態(tài)核磁共振波譜技術(shù)，獲得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)以及氨基酸側(cè)鏈中的生化參數(shù)。因此，這些研究為蛋白質(zhì)-配體相互作用、跨膜信號、底物轉(zhuǎn)運(yùn)、抗菌作用和許多其他生物過程的機(jī)制提供了新的見解和前期的研究基礎(chǔ)。特別的是，高靜態(tài)場強(qiáng)、基于同核雙極解耦序列的實(shí)驗(yàn)以及基于動(dòng)態(tài)核極化(DNP)的實(shí)驗(yàn)，在固體藥物材料中得到了越來越多的應(yīng)用。

5 結(jié)語與展望

近三十多年來，核磁共振技術(shù)的發(fā)展促使了藥物研究速度顯著加快，它可獲得無與倫比的結(jié)構(gòu)信息，成為結(jié)構(gòu)解析的“金標(biāo)準(zhǔn)”。雖然HPLC-MS可以在有利條件下檢測給定分析物至飛摩爾級別，但即使是最現(xiàn)代的核磁共振設(shè)備也需要在合理時(shí)間內(nèi)使用數(shù)納摩爾的樣品進(jìn)行分析。實(shí)際上，所有現(xiàn)代高分辨率核磁共振光譜儀都是脈沖傅里葉變換儀器，可同時(shí)激發(fā)給定類型的所有原子核，并以自由感應(yīng)衰變的形式收集原始數(shù)據(jù)，這使得將多個(gè)自由感應(yīng)衰變瞬態(tài)相加以提高頻譜信噪比成為可能，因此，低靈敏度一直是(并將繼續(xù)是)核磁共振生物分析應(yīng)用的致命弱點(diǎn)，而提高核磁共振靈敏度一直是過去四十年來大多數(shù)技術(shù)發(fā)展的焦點(diǎn)。目前，全球首個(gè)1.2 GHz最高磁場在瑞士聯(lián)邦理工學(xué)院安裝，預(yù)計(jì)未來將逐漸出現(xiàn)更多大于1 GHz的NMR譜儀，通過提高磁體的磁場強(qiáng)度將使藥物大分子的結(jié)構(gòu)研究有重大突破。隨著核磁共振譜在生物大分子結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用，核磁共振技術(shù)所提供的結(jié)構(gòu)信息的數(shù)量和復(fù)雜性呈幾何級數(shù)增加，將發(fā)展三維核磁共振技術(shù)。對三維空間的構(gòu)象和大分子與小分子之間的相互作用等，二維核磁共振已顯得無能為力，因此要發(fā)展分子建模技術(shù)，利用NOE所提供的分子中質(zhì)子間的距離信息來計(jì)算三維空間結(jié)構(gòu)。同時(shí)也將提高核磁共振信號的內(nèi)在敏感性和35 kDa以上生物分子固有的廣泛和重疊信號的分辨率，我們期望核磁共振能繼續(xù)為藥物領(lǐng)域的研究做出貢獻(xiàn)。特別是固態(tài)核磁共振的發(fā)展，可提供獨(dú)特和全面的視角，其固有的定量性質(zhì)、區(qū)分單個(gè)化學(xué)品的高靈敏度、闡明局部結(jié)構(gòu)和復(fù)雜相互作用的原子分辨率、探測非晶態(tài)材料的分子填料的能力以及在不同時(shí)間尺度上研究分子運(yùn)動(dòng)的能力，使核磁共振成為更加有力的分析工具。在未來，核磁共振可能與其他分析技術(shù)(如質(zhì)譜和X射線晶體學(xué))結(jié)合使用，便于更快地控制、更好的動(dòng)態(tài)范圍以及更大的靈活性和可擴(kuò)展性，提供最領(lǐng)先的結(jié)構(gòu)分析方法。