生血寶合劑藥渣抗?fàn)I養(yǎng)因子特征分析及其對新西蘭兔生產(chǎn)性能的影響

賀 宇，唐志書,2，宋忠興， 于金高*，朱華旭,3*，劉紅娜，周建平，曹兆軍

1陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點實驗室(培育)，咸陽 712046； 2中國中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700；3南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省植物藥深加工工程研究中心 江蘇省中藥資 源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 2100223；4清華德人西安幸福制藥有限公司，西安 710043

隨著我國社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人們對畜牧產(chǎn)品需求逐漸增大，畜牧業(yè)也進(jìn)入了快速發(fā)展階段。飼料中所含的營養(yǎng)物質(zhì)影響著畜禽的生存、生長和繁衍性能?？?fàn)I養(yǎng)因子(anti-nutritional factors，ANFs)又稱“毒性因子”或“營養(yǎng)抑制因子”，指的是飼料來源植物在進(jìn)化過程中產(chǎn)生的能夠抵御外界不利因素，并能夠?qū)游锵债a(chǎn)生不利作用的特殊因子[1]。ANFs主要包含木質(zhì)素、木聚糖、果膠、單寧和植酸等，其通過不同的作用機(jī)制使動物對飼料中的營養(yǎng)成分產(chǎn)生不耐受性，使飼料本身遺失一部分營養(yǎng)價值。目前研究發(fā)現(xiàn)，飼料中過多的抗?fàn)I養(yǎng)因子能使機(jī)體發(fā)育延緩，同時還會引發(fā)機(jī)體消化代謝功能紊亂、免疫力下降和疾病的發(fā)生等一系列問題，從而使禽畜的健康受到威脅[2]。因此，ANFs是飼料成分檢測的一項關(guān)鍵指標(biāo)。

生血寶合劑是由制何首烏Polygoni Multiflori Radix Praeparata、女貞子Ligustri Lucidi Fructus、桑椹Mori Fructus、墨旱蓮Ecliptae Herba、白芍Paeoniae Radix Alba、黃芪Astragali Radix、狗脊Cibotii Rhizoma七味中藥材制成的補益類中成藥，中醫(yī)用于滋養(yǎng)肝腎、補益氣血，臨床上用來治療各類貧血性疾病[3]。藥企在制藥過程中會產(chǎn)生大量生血寶藥渣(Shengxuebao mixture drug residue，SXBR)，其資源化利用途徑主要是用于栽培基質(zhì)、廢水處理、催化裂解制取燃油、酶解發(fā)酵產(chǎn)生乙醇以及禽畜的飼料生產(chǎn)[4]。生血寶合劑的七種單味藥中以黃芪和女貞子藥渣作為飼料添加劑的研究較多，而將該復(fù)方藥渣進(jìn)行飼料化開發(fā)的研究較少，對其進(jìn)行飼料資源化開發(fā)不但能夠解決制藥企業(yè)藥渣堆放污染問題，減少中藥資源浪費，還能發(fā)展新型飼料資源，實現(xiàn)中藥行業(yè)和畜牧業(yè)協(xié)調(diào)可持續(xù)性發(fā)展。

經(jīng)過前期相關(guān)實驗，SXBR含有豐富的萜類、黃酮類和氨基酸類等活性成分，可提高動物抗氧化應(yīng)激能力。為加快其飼料化開發(fā)進(jìn)程，本研究著重探討其抗?fàn)I養(yǎng)短板，根據(jù)SXBR的性狀，首先測定了SXBR可能含有的五種抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，并與常見飼料原料進(jìn)行對比，其次表征了SXBR添加飼料營養(yǎng)水平，并探討了SXBR對新西蘭兔營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率等生產(chǎn)性能的影響，最后對SXBR高比例飼喂新西蘭兔入血毒性成分進(jìn)行鑒定。本研究旨在為后續(xù)實現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考，進(jìn)一步推動中藥資源綠色循環(huán)利用。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

紫外分光光度計(UV-2600，SHIMADZU CORPORATION)；水純化系統(tǒng)(Milli-Q，美國Millipore 公司)；飼料顆粒機(jī)(YZ-160，安徽揚子工業(yè)科技有限公司)；超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿飛行時間質(zhì)譜儀(Waters ACQUITY UPLC H-Class，Triple TOFTM 5600，美國AB SCIEX公司)。

SXBR(批號09，清華德人西安幸福制藥有限公司)；黃芪(20210202，陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司)；白芍(20210401，陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司)；狗脊(20210502，陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司)；制何首烏(20200801，陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司)；女貞子(20210518，陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司)；桑椹(202104060，陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司)；墨旱蓮(20210307，陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司)；乙二胺四乙酸二鈉(20210511，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；木糖(D17N9S74410，上海源葉生物科技有限公司)；DNS試劑(F22HR10761A，上海源葉生物科技有限公司)；二水合鎢酸鈉(20170110，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；鉬酸鈉(20220118，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；沒食子酸(1100831-201605，中國食品藥品檢定研究所)；植酸鈉(X19O10Y100753，上海源葉生物科技有限公司)。

1.2 抗?fàn)I養(yǎng)因子含量測定

對SXBR、生血寶合劑七種單味藥(白芍、黃芪、何首烏、女貞子、桑椹、狗脊、墨旱蓮)及十三種常規(guī)飼料(米糠、苜蓿草、提摩西草、豆粕、棉粕、麥麩、甘薯干、甘薯藤、玉米、玉米秸稈、小麥、小麥秸稈和水稻秸稈)進(jìn)行大分子抗?fàn)I養(yǎng)因子測定，每樣平行測定三次。

采用范氏(Van Soest)洗滌法[5]，測定各樣品酸不溶性灰分、木質(zhì)素、纖維素和半纖維素含量；參照Chen等[6]的方法測定各樣品植酸含量；采用DNS還原糖比色法測定樣品木聚糖含量[7]；采用乙醇沉淀法法測定樣品中果膠含量[8]；采用鎢酸鈉-磷鉬酸分光光度比色法測定樣品單寧含量[9]。

1.3 動物實驗設(shè)計

將預(yù)混濃縮飼料、苜蓿草、SXBR分別打成粗粉，按比例混合后用全自動飼料顆粒機(jī)制成4 mm直徑的圓柱形顆粒料，晾干備用。將12只180日齡新西蘭兔隨機(jī)分為4組，分別為對照組(Con，飼喂70%濃縮飼料，30%苜蓿草)、低比例添加組(SXBR-L，飼喂70%濃縮飼料、25%苜蓿草和5%SXBR)、中比例添加組(SXBR-M，飼喂70%濃縮飼料、20%苜蓿草和10%SXBR)及高比例添加組(SXBR-H，飼喂70%濃縮飼料、10%苜蓿草和20%SXBR)。每組3只動物，經(jīng)過7 d的適應(yīng)期，正式開始飼喂實驗，每只每天定量飼喂90 g飼料，分四次喂完，自由飲水。每天記錄每只兔子的體重，30 d后計算每組平均日增重和料重比，取糞便用于營養(yǎng)物質(zhì)消化率的測定，飼養(yǎng)結(jié)束后取肝臟、回腸進(jìn)行病理切片觀察，取血用于血清毒性代謝產(chǎn)物鑒定。

1.4 各組SXBR添加飼料營養(yǎng)物質(zhì)測定

依照《中國藥典》(2020版)對各樣品水分和灰分進(jìn)行測定，并計算干物質(zhì)和有機(jī)物含量；飼料中粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、總碳水和能量的含量依照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定和計算；依照康奈爾凈碳水化合物-蛋白質(zhì)體系(CNCPS)中碳水化合物分類和Sniffen等[10]的方法計算凈碳水(非結(jié)構(gòu)性碳水)含量。

1.5 營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率測定

在30 d飼養(yǎng)期后采用全糞法連續(xù)6 d收集每只兔子的全部糞便，以體積分?jǐn)?shù)為10%鹽酸固氮、-20 ℃保存，合并6 d糞便置65 ℃烘干至恒重，糞便中干物質(zhì)、有機(jī)物、總碳水、凈碳水、粗蛋白、粗脂肪和粗纖維含量測定方法同飼料，根據(jù)Li等[11]報道的方法計算新西蘭兔對各營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率。

1.6 血清毒性代謝產(chǎn)物鑒定

血清供試樣品制備：飼養(yǎng)結(jié)束后對Con和SXBR-H新西蘭兔進(jìn)行腹主動脈采血，離心得血清，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。配?0%甲醇溶液作為萃取液并在-80 ℃預(yù)凍30 min，取200 μL血清加入600 μL萃取液，渦旋15 s，在4 ℃環(huán)境中靜置4 h后，12 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取600 μL上清液低溫濃縮至干，加入300 μL 50%乙腈水，渦旋1 min，12 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液即得血清供試樣品。

液相條件：使用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱,流動相為0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，按梯度條件進(jìn)行洗脫：0～1.5 min，1%B；1.5～23 min，1%→60%B；23～24 min，60%→98%B；24～27 min,98%B；27～27.1 min，98%→1%B；27.1～33 min,1%B。進(jìn)樣量為5 μL，流速為0.3 mL/min。

質(zhì)譜條件：使用AB SCIEX5600+QTOF超高效液相-三重四級桿高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀，采用電噴霧離子源(ESI)、正負(fù)離子模式、信息依賴采集(IDA)、動態(tài)背景扣除(DBS，間隔30 s)和高靈敏度模式采集數(shù)據(jù)。使用PeakView 2.2軟件，將AB SCIEX master view 1.1.0.0中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫作為血清成分匹配庫[12]，以Con血清樣本數(shù)據(jù)為參照，尋找SXBR-H血清樣本中的特異代謝產(chǎn)物。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

柱形圖使用GraphPad Prism 9.0制作，聚類分析熱圖使用Microsoft Excel 2019制作。平均日增重、料重比和營養(yǎng)成分表觀消化率數(shù)據(jù)使用SPSS 26軟件中克魯斯卡爾-沃里斯檢驗(K-W檢驗)進(jìn)行組間比較，顯著性閾值設(shè)置為P< 0.05。

2 結(jié)果

2.1 SXBR抗?fàn)I養(yǎng)因子含量特征

SXBR抗?fàn)I養(yǎng)因子表征結(jié)果表明，其木質(zhì)素和植酸水平較為突出。由纖維類含量聚類分析熱圖(見圖1A)可知，SXBR總體與甘薯藤相似，但其中的木質(zhì)素含量高達(dá)9.64%，高于大部分飼料原料，僅低于米糠。SXBR纖維素、半纖維素和酸不溶性灰分含量較常見飼料原料均處于中等水平。通過對單味藥材進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)SXBR中的木質(zhì)素主要來源于配方中的狗脊、女貞子、墨旱蓮和何首烏等質(zhì)地均較為堅硬的藥材(見圖1B)。比較SXBR和常見飼料原料中的植酸含量發(fā)現(xiàn)，SXBR植酸含量與常規(guī)飼料相比也處于較高水平，為0.06%，僅低于提摩西草，其他樣品中植酸含量均低于0.05%(見圖1C)。單味藥材中僅白芍、何首烏和狗脊中存在植酸，白芍中含量最高，是SXBR中植酸的主要來源(見圖1D)。SXBR果膠和單寧含量與常規(guī)飼料相當(dāng)。其中，果膠含量測定結(jié)果表明小麥的果膠含量最高，達(dá)到約30%，其余大多數(shù)飼料原料中果膠含量基本在10%左右，SXBR果膠含量與苜蓿草和玉米相近，為11.56%(見見圖1E)。生血寶合劑單味藥中狗脊果膠含量最高，可判斷其為SXBR中果膠的主要來源(見圖1F)。單寧含量測定結(jié)果顯示，常見飼料原料中提摩西草的單寧含量最高，其余飼料單寧含量基本都在0.50%左右。SXBR單寧含量為0.70%，與玉米秸稈相近(見圖1G)。生血寶合劑各單味藥中均含有單寧，桑椹、女貞子、狗脊、何首烏及墨旱蓮單寧水平相當(dāng)，是SXBR中單寧的主要來源(見圖1H)。此外，木聚糖測定結(jié)果表明，SXBR和大部分常見飼料原料中都未檢測出木聚糖，僅提摩西草、麥麩和甘薯藤中可測出小于0.4%的木聚糖(見圖1I)。單味藥材中桑椹木聚糖含量最高，達(dá)到約1.5%，其余藥材所含木聚糖都低于0.4%(見圖1J)。圖中編號所代表的含義如表1所示。

圖1 SXBR抗?fàn)I養(yǎng)因子含量特征Fig.1 Content characteristics of SXBR anti nutritional factors

表1 圖1中編號所代表的含義Table 1 Meanings of the numbers in Fig.1

2.2 各組SXBR添加飼料營養(yǎng)水平

對各組飼料營養(yǎng)成分進(jìn)行測定，結(jié)果如表2所示，SXBR添加飼料干物質(zhì)、有機(jī)物、總碳水、凈碳水、粗脂肪和能量含量隨SXBR的增加而增大，粗蛋白隨SXBR的增加而減少；各組飼料粗纖維水平相當(dāng)。

表2 各組飼料營養(yǎng)水平Table 2 Feed nutrition level of each group

2.3 SXBR對新西蘭兔生產(chǎn)性能的影響

30 d后各組新西蘭兔平均日增重和料重比如表3所示，隨著SXBR的增加，各組新西蘭兔平均日增重和料重比均無顯著差異，且SXBR-H和SXBR-L平均日增重大于Con，料重比小于Con。可見，新西蘭兔對SXBR添加飼料適口性良好，盡管SXBR抗?fàn)I養(yǎng)因子水平較為突出，但并未阻礙新西蘭兔生長。各組兔子糞便含水量無顯著差異(P>0.05)，可見SXBR不會造成動物腹瀉。

營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率是飼料資源開發(fā)中表征飼料生產(chǎn)性能的重要指標(biāo)，反應(yīng)動物對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的消化程度。對各組動物營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的測定如表4所示，SXBR-H粗蛋白的表觀消化率顯著低于Con(P= 0.003)，SXBR各處理組粗蛋白的表觀消化率無顯著差異(P> 0.05)。其余營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率各組間無顯著差異(P> 0.05)，但隨著SXBR添加比例的增加，粗纖維和粗脂肪表觀消化率隨之變低。

表3 各實驗組新西蘭兔平均日增重、料重比和糞便含水率Table 3 Average daily gain,feed conversion ratio and fecal moisture content of

表4 新西蘭兔對SXBR添加飼料中各營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率Table 4 Apparent digestibility of nutrients in SXBR added feed for New Zealand rabbits

2.4 SXBR不含入血小分子抗?fàn)I養(yǎng)成分，對肝臟無毒害作用

為確定SXBR中可能殘留的毒性成分是否入血并對新西蘭兔肝臟造成損傷，本研究使用UPLC-TOF-MS技術(shù)，對比SXBR-H和Con新西蘭兔血清樣本成分一級質(zhì)譜圖、同位素峰度等信息，未見毒性成分。此外，觀察各組肝臟病理切片均無異常(圖2A)。回腸是營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場所，從各組回腸切片可見SXBR不影響腸道結(jié)構(gòu)(圖2B)。總的來說，SXBR作為飼料添加劑安全性良好。

圖2 各組新西蘭兔肝臟、回腸切片F(xiàn)ig.2 Sections of liver and ileum of New Zealand rabbits in each group

3 討論與結(jié)論

3.1 SXBR抗?fàn)I養(yǎng)因子水平及特征分析

常規(guī)飼料抗?fàn)I養(yǎng)因子的種類、分類、理化性質(zhì)、作用機(jī)制及測定方法已有學(xué)者進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究和報道?？偫w維素是由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素組成的，其中木質(zhì)素是一種難以降解且阻礙其他營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的抗?fàn)I養(yǎng)因子，它與纖維素、半纖維素的特殊交聯(lián)結(jié)構(gòu)減少了消化酶與營養(yǎng)物質(zhì)的接觸[13]；植酸是一種強絡(luò)合劑，它能結(jié)合蛋白質(zhì)和礦物元素等營養(yǎng)物質(zhì)從而阻礙營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[14]；盡管有研究證實果膠具有抗氧化、抗菌、抗炎、降血脂和促進(jìn)腸道益生菌生長等多種生物活性，但過多的果膠會增加飽腹感，吸水后也會導(dǎo)致腸道黏度增大，從而降低動物采食量及蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率[15]；單寧是一種酚類物質(zhì)，幾乎存在于所有植物中，具有抗病毒、抗炎、抗菌、促進(jìn)傷口愈合等多種藥理作用，在一定限度內(nèi)可作為飼料添加劑，但單寧味澀，過多時影響飼料適口性，它還能通過抑制酶活性、與蛋白質(zhì)等生成難溶物及螯合維生素和礦物離子等方式降低營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率[16]；木聚糖是一種非淀粉多糖，廣泛存在于植物細(xì)胞壁中，Qin等[17]的研究表明當(dāng)飼料中木聚糖含量在10%以下時不會引起動物不良反應(yīng)，但過多的木聚糖可通過增加腸道黏性，降低消化酶活性，破壞腸道菌群等方式阻礙動物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。目前對于中藥渣飼料的營養(yǎng)成分及抗?fàn)I養(yǎng)因子分析研究較少，本研究對SXBR在抗?fàn)I養(yǎng)因子方面進(jìn)行表征，并與13種常見飼料原料進(jìn)行比較。研究結(jié)果表明，在抗?fàn)I養(yǎng)因子方面，SXBR中單寧處于中等水平，但Liu等[18]的研究表明，飼料中單寧含量為0.5%時對家兔無不良影響，因此認(rèn)為單寧是SXBR中的功能性有機(jī)物，其抗?fàn)I養(yǎng)屬性在SXBR的添加比例為20%以內(nèi)表現(xiàn)不明顯。SXBR中木質(zhì)素和植酸含量偏高，可作為解決其抗?fàn)I養(yǎng)問題的主要方向。此外，本研究還對生血寶合劑的七種單味藥的抗?fàn)I養(yǎng)因子含量進(jìn)行了測定，從而分析藥渣中主要的抗?fàn)I養(yǎng)因素來源藥材，為后續(xù)進(jìn)一步降低SXBR的抗?fàn)I養(yǎng)作用提供參考。本研究確立了SXBR的抗?fàn)I養(yǎng)因子表征方法，為其他中藥渣飼料化開發(fā)的抗?fàn)I養(yǎng)因子表征提供參考。

3.2 SXBR對新西蘭兔生產(chǎn)性能的影響及解決方案

藥企在生產(chǎn)生血寶合劑的過程中會產(chǎn)生大量藥渣，進(jìn)行廢物處理會消耗大量成本，并造成嚴(yán)重的環(huán)境污染和資源浪費。將生血寶合劑藥渣進(jìn)行飼料化開發(fā)，對解決藥企資金消耗，開發(fā)新產(chǎn)業(yè)鏈，實現(xiàn)中藥資源綠色循環(huán)利用，解決飼料短缺問題具有現(xiàn)實意義。本研究基于此前得出的SXBR可提高動物抗氧化應(yīng)激功能的結(jié)果上，進(jìn)一步探索其飼料化開發(fā)短板，發(fā)現(xiàn)盡管SXBR添加飼料具有可觀的營養(yǎng)價值，但隨著SXBR比例的增加，其木質(zhì)素抗?fàn)I養(yǎng)性凸顯，盡管對兔子的體重增長無較大影響，但新西蘭兔對粗蛋白的表觀消化率呈顯著下降趨勢，該問題的解決方法主要有：(1)控制SXBR添加比例，以10%為宜；(2)將狗脊、女貞子、何首烏等木質(zhì)素含量較高的藥材挑出；(3)在飼料中添加木質(zhì)素酶以減弱木質(zhì)素對營養(yǎng)物質(zhì)吸收的阻礙作用；(4)在飼料中添加易消化的優(yōu)質(zhì)蛋白類飼料添加劑。

3.3 SXBR毒性檢測及其對肝臟、腸道的影響

已有研究表明，何首烏中的蒽醌類和二苯乙烯苷類成分可通過氧化應(yīng)激、致線粒體功能障礙、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等多種途徑造成肝臟損傷[19]。由于生血寶合劑單味藥中含有何首烏，考慮其對肝臟的毒副作用，本研究以Con組血清TOF采集數(shù)據(jù)為參照，發(fā)現(xiàn)SXBR-H組血清未見入血毒性物質(zhì)，肝臟病理切片未見異常，并且此前有學(xué)者報道以臨床用藥劑量的225倍生血寶合劑濃溶液灌胃小鼠仍求不出LD50[20]，提示本研究用量安全性可靠。

綜上，本研究通過表征SXBR抗?fàn)I養(yǎng)因子，發(fā)現(xiàn)其抗?fàn)I養(yǎng)因子中木質(zhì)素水平較為突出，可對新西蘭兔粗蛋白的表觀消化率產(chǎn)生較大影響。因此，可將減少木質(zhì)素含量、增加飼料蛋白消化率作為解決SXBR抗?fàn)I養(yǎng)問題的主要研究方向。本研究揭示了生血寶藥渣的抗?fàn)I養(yǎng)特征，對推動其飼料化開發(fā)進(jìn)程和實現(xiàn)其綠色循環(huán)利用具有積極意義。