密花樫木根化學(xué)成分及其蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制活性研究

楊 帆，張亞梅

江西中醫(yī)藥大學(xué) 江西民族傳統(tǒng)藥現(xiàn)代科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，南昌 330004

密花樫木(Dysoxylumdensiflorum)產(chǎn)于我國云南西雙版納(勐臘、景洪)，生于海拔520～800 m的濕性熱帶季節(jié)性谷邊、河邊坡地的雨林中[1]?，F(xiàn)代研究表明，密花樫木中含有豐富的倍半萜、三萜、二萜、檸檬苦素類等化學(xué)成分，部分化合物具有良好的抗菌、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等多種藥理活性[2-5]。蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(proteintyrosine phosphatase，PTPs)是一組催化蛋白質(zhì)酪氨酸脫磷酸化的酶。蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1B(proteintyrosine phosphatase 1B，PTP-1B)通過激活的胰島素受體和下游底物蛋白去磷酸化，在調(diào)節(jié)胰島素作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-7]。因此PIP-1B是胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵的負調(diào)節(jié)蛋白，PTP-1B抑制劑是開發(fā)抗糖尿病藥物的重要選擇。課題組前期發(fā)現(xiàn)楝科樫木屬植物多脈樫木中的二萜類成分表現(xiàn)出對PTP-1B抑制作用[8]，同屬其他植物尚未見此活性研究報道。因此，為進一步探究密花樫木的活性成分，本實驗通過硅膠柱色譜、半制備色譜、制備色譜結(jié)合核磁共振波譜技術(shù)對密花樫木根提取物乙酸乙酯萃取部位進行研究，以期為抑制PTP-1B活性成分的發(fā)現(xiàn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker Avance Ⅲ 600型核磁共振儀(德國Bruker公司)；LC-3000型制備高效液相色譜儀(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)；制備型色譜柱(250 mm × 21.2 mm，10 μm)(北京慧得易科技有限責(zé)任公司)；半制備型色譜柱(Luna C-18，250 mm×10 mm，10 μm)(美國Phenomenex公司)；硅膠G(100～200，200～300目，青島海洋化工廠)；酶標儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；重組人PTP-1B蛋白(Abcam公司)；氯化鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；三羥甲基氨基甲烷Tris(Gen-view科技有限公司)；硝基苯基磷酸二鈉(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)(上海麥克林生化科技有限公司)；乙二胺四乙酸二鈉(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)(北京索萊寶科技有限公司)；二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol，DTT)(北京索萊寶科技有限公司)；半制備及制備液相所用試劑為色譜純，其他均為分析純。

密花樫木根于2020年5月采自云南勐海，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)江西民族傳統(tǒng)藥現(xiàn)代科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心張亞梅副教授鑒定為楝科蔥臭木屬植物密花樫木根(Dysoxylumdensiflorum)。憑證標本(2020-05)存放于江西中醫(yī)藥大學(xué)江西民族傳統(tǒng)藥現(xiàn)代科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心。

1.2 方法

密花樫木根10 kg，粉碎，采用回流提取法用95%乙醇提取3次，每次1 h，合并提取液，過濾后減壓濃縮得到總浸膏2400 g，將總浸膏用乙酸乙酯-水(1∶1)萃取，減壓濃縮后得到乙酸乙酯萃取物491.35 g。取乙酸乙酯浸膏150 g用硅膠色譜柱(15 cm × 15 cm)分離，以石油醚-丙酮(10∶1、7∶1、4∶1、1∶1)和95%乙醇為洗脫劑，得到3個流分(MG1～MG3)。

MG1部位分別經(jīng)兩次制備HPLC(乙腈-水80∶20→95∶5、乙腈-水80∶20)得到MZ1a和MZ1b，MZ1a分別經(jīng)正向半制備HPLC(石油醚-丙酮8∶1)、半制備HPLC(乙腈-水80∶20)得到化合物19(4.8 mg，tR= 12 min)、20(1.1 mg，tR= 17 min)。MZ1b分別經(jīng)正向半制備HPLC(石油醚-丙酮8∶1)、半制備HPLC(乙腈-水70∶30)得到化合物18(1 mg，tR= 40 min)。

MG2部位分別經(jīng)兩次制備HPLC(乙腈-水60∶40→95∶5、乙腈-水50∶50)得到化合物10(91.7 mg，tR= 25 min)、22(30.3 mg，tR= 36 min)和MZ2a～MZ2f，MZ2a分別經(jīng)正向半制備HPLC(石油醚-丙酮6∶1)、半制備HPLC(乙腈-水60∶40→95∶5)得到化合物7(1 mg，tR= 29 min)；MZ2b分別經(jīng)正向半制備HPLC(石油醚-丙酮8∶1)、半制備HPLC(乙腈-水60∶40→95∶5)得到化合物5(1 mg，tR= 13 min)；MZ2c分別經(jīng)正向半制備HPLC(石油醚-丙酮8∶1)、半制備HPLC(乙腈-水60∶40→95∶5)得到化合物11(1 mg，tR= 18 min)；MZ2d分別經(jīng)正向半制備HPLC(石油醚-丙酮10∶1)、半制備HPLC(乙腈-水60∶40)得到化合物12(5.1 mg，tR= 24 min)、14(7 mg，tR= 23 min)、15(9.2 mg，tR= 26 min)、21(4.5 mg，tR= 26 min)；MZ2e分別經(jīng)正向半制備HPLC(石油醚-丙酮10∶1)、半制備HPLC(乙腈-水60∶40)得到化合物6(1 mg，tR= 32 min)；MZ2f分別經(jīng)正向半制備HPLC(石油醚-丙酮10∶1)、半制備HPLC(乙腈-水60∶40)得到化合物8(45.1 mg，tR= 50 min)、9(2.4 mg，tR= 50 min)、13(1 mg，tR= 17 min)。

MG3部位分別經(jīng)兩次制備HPLC(乙腈-水50∶50→80∶20、乙腈-水30∶70→60∶40)得到MZ3a～MZ3c，MZ3a分別經(jīng)正向半制備HPLC(石油醚-丙酮3∶1)、半制備HPLC(乙腈-水40∶60)得到化合物17(3.3 mg，tR= 26 min)；MZ3b分別經(jīng)正向半制備HPLC(石油醚-丙酮6∶1)、半制備HPLC(乙腈-水45∶55)得到化合物1(1 mg，tR= 17 min)、2(1 mg，tR= 19 min)、3(1.5 mg，tR= 22 min)、4(1 mg，tR= 29 min)、16(1 mg，tR= 34 min)；MZ3c分別經(jīng)正向半制備HPLC(石油醚-丙酮3∶1)、半制備HPLC(乙腈-水55∶45)得到化合物23(11.4 mg，tR= 13 min)。

1.3 PTP-1B抑制活性測定

以對p-NPP作為底物，蘇拉明鈉為陽性對照，根據(jù)PTP-1B水解p-NPP 的磷酸基團而產(chǎn)生顏色反應(yīng)來測定PTP-1B的活性。測試樣品用DMSO溶解，配制為質(zhì)量濃度10 mg/mL的母液，取母液10 μL加緩沖液至質(zhì)量濃度梯度為0、0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2 mg/mL，在96孔板中加入緩沖液(180 μL緩沖體系組成為11 mmol/L Tris-HCl pH 7.5、55 mmol/L DTT、1.1 mmol/L EDTA、33 mmol/Lp-NPP)，37 ℃再回溫5 min后加入p-NPP 50 μL，37 ℃再回溫5 min后加入樣品，酶20 μL，37 ℃孵育30 min后，加入mol/L NaOH 10 μL終止反應(yīng)。以不含樣品的系統(tǒng)為空白對照，利用SpectraMax MD5酶標儀測定405 nm處吸光度(A)[9]。應(yīng)用Graphpad軟件計算半抑制濃度(IC50)。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1淡黃色膠狀;分子式為C20H34O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.38(1H，t，J= 6.9 Hz，H-14)，4.14(2H，d，J= 7.1 Hz，H-15)，3.45(1H，d，J= 11.0 Hz，H-3)，1.67(3H，s，H-16)，1.04(3H，s，H-18)，0.96(3H，s，H-19)，0.84(3H，d，J= 6.8 Hz，H-20)，0.82(3H，s，H-17)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：25.2(C-1)，27.4(C-2)，76.3(C-3)，34.1(C-4)，136.3(C-5)，25.5(C-6)，27.1(C-7)，33.3(C-8)，40.5(C-9)，131.7(C-10)，39.8(C-11)，34.5(C-12)，140.9(C-13)，122.7(C-14)，59.4(C-15)，16.0(C-16)，16.5(C-17)，24.0(C-18)，20.1(C-19)，21.1(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道基本一致，故鑒定化合物1為5(10),13E-halimadiene-3α,15-diol。

化合物2白色粉末;分子式為C20H34O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.38(1H，tq，J= 6.9，1.3 Hz，H-14)，4.83(2H，dd，J= 36.5，1.5 Hz，H-18)，4.33(1H，t，J= 3.1 Hz，H-3)，4.13(2H，d，J= 6.9 Hz，H-15)，1.67(3H，d，J= 1.3 Hz，H-16)，1.24(3H，s，H-20)，0.81(3H，d，J= 6.4 Hz，H-17)，0.76(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：16.5(C-1)，27.0(C-2)，74.6(C-3)，160.8(C-4)，39.7(C-5)，38.1(C-6)，32.8(C-7)，36.7(C-8)，39.1(C-9)，48.5(C-10)，36.4(C-11)，34.6(C-12)，140.6(C-13)，122.8(C-14)，59.4(C-15)，16.5(C-16)，16.0(C-17)，109.4(C-18)，22.9(C-19)，18.2(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道基本一致，故鑒定化合物2為(-)-agbanindiol A。

化合物3白色結(jié)晶;分子式為C21H36O4。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.67(1H，q，J= 1.2 Hz，H-14)，3.68(3H，s，15-OCH3)，3.58(1H，m，H-3)，2.16(3H，d，J= 1.2 Hz，H-16)，1.25(3H，s，H-18)，1.12(3H，s，H-19)，0.79(3H，d，J= 6.2 Hz，H-17)，0.74(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：16.5(C-1)，30.6(C-2)，76.6(C-3)，76.5(C-4)，41.5(C-5)，32.5(C-6)，26.6(C-7)，36.4(C-8)，38.9(C-9)，41.0(C-10)，36.9(C-11)，34.9(C-12)，161.9(C-13)，115.0(C-14)，167.4(C-15)，19.3(C-16)，16.1(C-17)，21.7(C-18)，17.4(C-19)，18.5(C-20)，51.0(15-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道基本一致，故鑒定化合物3為polylauioid H。

化合物4白色結(jié)晶;分子式為C20H34O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.68(1H，d，J= 1.5 Hz，H-3)，3.61(2H，m，H-15)，1.85(3H，d，J= 1.3 Hz，H-18)，1.08(3H，s，H-19)，0.86(3H，d，J= 6.6 Hz，H-20)，0.79(3H，m，H-16)，0.76(3H，s，H-17)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：35.5(C-1)，200.7(C-2)，172.7(C-3)，125.3(C-4)，39.5(C-5)，34.8(C-6)，26.8(C-7)，35.7(C-8)，38.4(C-9)，45.5(C-10)，29.9(C-11)，34.7(C-12)，29.3(C-13)，39.7(C-14)，60.7(C-15)，19.6(C-16)，15.6(C-17)，18.2(C-18)，18.9(C-19)，17.9(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道基本一致，故鑒定化合物4為2-oxopopulifolic acid。

化合物5透明膠狀;分子式為C20H32O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.89(1H，m，H-3)，1.98(3H，d，J= 1.4 Hz，H-20)，1.13(3H，s，H-19)，0.91(9H，dt，J= 6.8，4.2 Hz，H-16，17，18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：48.3(C-1)，199.0(C-2)，128.9(C-3)，159.6(C-4)，74.6(C-5)，34.2(C-6)，40.3(C-7)，25.3(C-8)，35.9(C-9)，40.1(C-10)，33.5(C-11)，48.1(C-12)，210.7(C-13)，52.7(C-14)，24.9(C-15)，22.9(C-16)，23.0(C-17)，17.2(C-18)，21.4(C-19)，19.7(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道基本一致，故鑒定化合物5為dysoxydenone C。

化合物6白色結(jié)晶;分子式為C21H32O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.73(1H，m，H-3)，5.62(1H，d，J= 1.4 Hz，H-13)，3.67(3H，s，15-OCH3)，1.88(3H，d，J= 1.3 Hz，H-16)，1.87(3H，d，J= 1.4 Hz，H-18)，1.11(3H，m，H-19)，0.89(3H，d，J= 6.7 Hz，H-17)，0.81(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：34.8(C-1)，200.2(C-2)，125.6(C-3)，172.4(C-4)，39.8(C-5)，35.5(C-6)，26.9(C-7)，35.9(C-8)，38.9(C-9)，45.4(C-10)，35.8(C-11)，26.8(C-12)，160.5(C-13)，115.7(C-14)，166.6(C-15)，25.3(C-16)，15.7(C-17)，18.9(C-18)，18.4(C-19)，17.7(C-20)，50.9(15-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道基本一致，故鑒定化合物6為2-oxo-ent-cleroda-3,13Z-dien-15-oic acid。

化合物7透明膠狀;分子式為C20H32O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.86(1H，m，H-14)，5.71(1H，m，H-3)，5.19(1H，dt，J= 17.3，1.8 Hz，H-15a)，5.07(1H，dd，J= 10.8，1.8 Hz，H-15b)，1.87(3H，d，J= 1.3 Hz，H-18)，1.26(3H，s，H-16)，1.10(3H，s，H-19)，0.82(3H，d，J= 6.2 Hz，H-17)，0.80(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：34.9(C-1)，200.4(C-2)，125.5(C-3)，172.5(C-4)，39.8(C-5)，35.5(C-6)，26.8(C-7)，35.9(C-8)，38.3(C-9)，45.6(C-10)，31.2(C-11)，34.7(C-12)，73.1(C-13)，144.7(C-14)，112.1(C-15)，30.0(C-16)，15.6(C-17)，18.9(C-18)，18.3(C-19)，18.0(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道基本一致，故鑒定化合物7為nakamurol B。

化合物8白色粉末;分子式為C21H32O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.68(1H，t，J= 1.2 Hz，H-3)，5.61(1H，q，J= 1.3 Hz，H-14)，3.63(3H，s，15-OCH3)，2.10(3H，d，J= 1.2 Hz，H-16)，1.85(3H，d，J= 1.2 Hz，H-18)，1.07(3H，s，H-19)，0.80(3H，d，J= 6.1 Hz，H-17)，0.78(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：34.8(C-1)，199.8(C-2)，125.3(C-3)，172.2(C-4)，39.7(C-5)，35.4(C-6)，26.7(C-7)，35.9(C-8)，38.6(C-9)，45.5(C-10)，35.4(C-11)，33.9(C-12)，160.2(C-13)，115.0(C-14)，166.9(C-15)，19.0(C-16)，15.5(C-17)，18.8(C-18)，18.2(C-19)，17.7(C-20)，50.6(15-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道基本一致，故鑒定化合物8為methyl (13E)-2-oxoneocleroda-3,13-dien-15-oate。

化合物9白色結(jié)晶;分子式為C22H34O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.72(1H，q，J= 1.1 Hz，H-3)，5.31(1H，td，J= 7.3，1.6 Hz，H-14)，4.52(1H，m，H-15)，2.04(3H，s，OAc)，1.88(3H，s，H-18)，1.74(3H，m，H-16)，1.11(3H，s，H-19)，0.85(3H，d，J= 6.3 Hz，H-17)，0.80(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：36.3(C-1)，200.4(C-2)，125.9(C-3)，172.7(C-4)，40.2(C-5)，35.4(C-6)，27.2(C-7)，36.5(C-8)，39.2(C-9)，45.9(C-10)，35.9(C-11)，25.5(C-12)，143.5(C-13)，119.2(C-14)，61.1(C-15)，24.1(C-16)，16.1(C-17)，19.3(C-18)，18.7(C-19)，18.2(C-20)，21.5(CH3COO)，171.4(CH3COO)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道基本一致，故鑒定化合物9為15-acetoxy-ent-3,13E-clerodadien-2-one。

化合物10白色結(jié)晶;分子式為C20H34O3。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：5.34(1H，m，H-14)，4.06(2H，d，J= 6.8 Hz，H-15)，3.48(1H，q，J= 3.2 Hz，H-3)，1.85(1H，dd，J= 12.4，2.0 Hz，H-10)，1.67(3H，d，J= 1.3 Hz，H-16)，1.19(3H，s，H-18)，1.11(3H，s，H-19)，0.79(3H，d，J= 5.9 Hz，H-17)，0.74(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：17.6(C-1)，31.0(C-2)，76.8(C-3)，77.3(C-4)，42.5(C-5)，33.5(C-6)，27.9(C-7)，37.3(C-8)，39.7(C-9)，41.7(C-10)，38.4(C-11)，34.1(C-12)，140.7(C-13)，124.2(C-14)，59.4(C-15)，16.6(C-16)，16.5(C-17)，21.3(C-18)，17.9(C-19)，19.0(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道基本一致，故鑒定化合物10為(3α,4β,13E)-neoclerod-13-ene-3,4,15-triol。

化合物11透明膠狀;分子式為C20H34O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.89(1H，dd，J= 17.4，10.8 Hz，H-14)，5.20(1H，dd，J= 17.4，1.2 Hz，H-15a)，5.05(1H，dd，J= 10.8，1.2 Hz，H-15b)，1.27(3H，s，H-16)，1.04(3H，s，H-18)，0.95(3H，s，H-19)，0.82(6H，d，J= 6.4 Hz，H-17，20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：25.4(C-1)，27.7(C-2)，76.5(C-3)，40.1(C-4)，136.4(C-5)，27.4(C-6)，27.6(C-7)，33.5(C-8)，40.4(C-9)，111.9(C-10)，30.1(C-11)，36.6(C-12)，73.5(C-13)，145.4(C-14)，100.1(C-15)，24.1(C-16)，16.1(C-17)，25.8(C-18)，20.4(C-19)，21.5(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道基本一致，故鑒定化合物11為5(10),14-halimadiene-3α,13ξ-diol。

化合物12白色結(jié)晶;分子式為C20H32O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.87(1H，m，H-3)，1.89(3H，d，J= 1.5 Hz，H-20)，0.91(9H，m，H-12，17，18)，0.84(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：54.6(C-1)，199.4(C-2)，127.0(C-3)，163.3(C-4)，47.9(C-5)，26.1(C-6)，43.5(C-7)，24.5(C-8)，40.2(C-9)，37.8(C-10)，33.8(C-11)，16.9(C-12)，48.0(C-13)，210.9(C-14)，52.6(C-15)，24.7(C-16)，22.8(C-17)，22.7(C-18)，17.2(C-19)，22.1(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道基本一致，故鑒定化合物12為dysokusone A。

化合物13淡黃色膠狀;分子式為C18H28O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.72(1H，s，H-3)，2.12(3H，m，H-16)，1.88(3H，d，J= 2.0 Hz，H-18)，1.11(3H，d，J= 2.6 Hz，H-19)，0.83(6H，m，H-17，20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：35.1(C-1)，200.3(C-2)，125.7(C-3)，172.6(C-4)，40.0(C-5)，35.7(C-6)，27.0(C-7)，36.4(C-8)，38.4(C-9)，46.2(C-10)，30.9(C-11)，37.2(C-12)，208.6(C-13)，30.3(C-16)，15.9(C-17)，18.4(C-18)，19.1(C-19)，17.9(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]報道基本一致，故鑒定化合物13為14,15-dinorclerod-3-ene-2,13-dione。

化合物14透明膠狀;分子式為C20H32O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.67(1H，s，H-14)，2.93(1H，d，J= 1.8 Hz，H-3)，2.16(3H，s，H-16)，1.17(3H，s，H-18)，1.04(3H，s，H-19)，0.79(3H，d，J= 6.3 Hz，H-17)，0.66(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：19.8(C-1)，28.2(C-2)，62.3(C-3)，66.6(C-4)，37.4(C-5)，35.2(C-6)，28.4(C-7)，37.2(C-8)，39.3(C-9)，48.1(C-10)，36.2(C-11)，36.5(C-12)，164.0(C-13)，115.2(C-14)，171.9(C-15)，17.0(C-16)，16.1(C-18)，15.5(C-17)，18.7(C-19)，19.5(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[21]報道基本一致，故鑒定化合物14為3,4-epoxyclerodan-13E-en-15-oic acid。

化合物15透明膠狀;分子式為C20H30O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.03(1H，s，H-13)，5.87(1H，m，H-3)，2.27(3H，s，H-12)，2.12(1H，m，H-16)，1.86(3H，d，J= 1.6 Hz，H-20)，0.93(3H，s，H-17)，0.92(3H，s，H-18)，0.90(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：53.8(C-1)，199.4(C-2)，126.9(C-3)，163.2(C-4)，47.5(C-5)，24.8(C-6)，40.8(C-7)，27.6(C-8)，39.7(C-9)，37.5(C-10)，161.5(C-11)，21.3(C-12)，124.6(C-13)，201.0(C-14)，54.5(C-15)，25.2(C-16)，22.8(C-17)，22.8(C-18)，16.9(C-19)，22.0(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[22]報道基本一致，故鑒定化合物15為dysokusone G。

化合物16透明膠狀;分子式為C22H38O4。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.32(1H，t，J= 7.4 Hz，H-14)，4.54(2H，m，H-15)，3.58(1H，t，J= 2.9 Hz，H-3)，2.04(3H，s，OAc)，1.24(3H，s，H-18)，1.12(3H，s，H-19)，0.80(3H，d，J= 6.0 Hz，H-17)，0.72(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：16.6(C-1)，21.3(C-2)，76.6(C-3)，76.5(C-4)，41.5(C-5)，32.5(C-6)，26.6(C-7)，36.3(C-8)，39.0(C-9)，40.9(C-10)，37.4(C-11)，26.0(C-12)，144.4(C-13)，118.4(C-14)，61.1(C-15)，23.9(C-16)，16.1(C-17)，21.6(C-18)，17.4(C-19)，18.4(C-20)，171.3(CH3COO)，30.6(CH3COO)。以上數(shù)據(jù)與文獻[23]報道基本一致，故鑒定化合物16為15-acetyloxyl-3α,4β-dihydroxy-neoclerod-13Z-ene。

化合物17透明膠狀;分子式為C20H36O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.40(1H，t，J= 7.0 Hz，H-14)，4.14(2H，d，J= 6.9 Hz，H-15)，1.68(3H，s，H-16)，1.28(3H，s，H-18)，1.02(3H，s，H-19)，0.79(3H，d，J= 5.4 Hz，H-20)，0.72(3H，s，H-17)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：27.3(C-1)，32.0(C-2)，33.1(C-3)，42.1(C-4)，76.2(C-5)，37.1(C-6)，37.1(C-7)，23.5(C-8)，43.2(C-10)，38.9(C-11)，36.8(C-12)123.2(C-13)，40.9(C-14)，59.6(C-15)，21.2(C-16)，18.4(C-17)，16.7(C-18)，16.2(C-19)，14.9(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[24]報道基本一致，故鑒定化合物17為[1α(E),2β,4aβ,8aα]-5-(decahydro-4a-hydroy-1,2,5,5-tetra-methyl-1-naphthalenyl)-3-methl-2-penten-1-ol。

化合物18淡黃色膠狀;分子式為C20H34O。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.38(1H，tq，J= 6.9，1.3 Hz，H-14)，5.17(1H，ddt，J= 4.2，2.7，1.2 Hz，H-3)，4.12(2H，d，H-15)，1.66(3H，m，H-16)，1.57(3H，d，J= 3.1 Hz，H-20)，0.98(3H，d，J= 0.7 Hz，H-19)，0.79(3H，d，J= 6.4 Hz，H-17)，0.70(3H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：36.8(C-1)，27.0(C-2)，120.5(C-3)，144.6(C-4)，38.3(C-5)，36.9(C-6)，27.6(C-7)，36.4(C-8)，38.7(C-9)，46.5(C-10)，18.4(C-11)，32.9(C-12)，140.9(C-13)，123.0(C-14)，59.5(C-15)，16.6(C-16)，18.5(C-17)，18.1(C-18)，20.0(C-19)，16.1(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[25]報道基本一致，故鑒定化合物18為kolavenol。

化合物19無色結(jié)晶;分子式為C20H32O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.71(1H，m，H-3)，5.37(1H，tq，J= 6.9，1.3 Hz，H-14)，4.12(2H，m，H-15)，1.88(3H，d，J= 1.3 Hz，H-18)，1.66(3H，m，H-16)，1.11(3H，d，J= 0.7 Hz，H-19)，0.83(3H，dd，J= 4.2，1.9 Hz，H-17)，0.80(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：35.1(C-1)，200.6(C-2)，125.6(C-3)，172.8(C-4)，40.0(C-5)，35.9(C-6)，27.0(C-7)，36.1(C-8)，138.9(C-9)，45.8(C-10)，35.7(C-11)，32.4(C-12)，40.0(C-13)，123.5(C-14)，59.5(C-15)，16.8(C-16)，15.9(C-17)，19.1(C-18)，18.5(C-19)，18.1(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道基本一致，故鑒定化合物19為(13E)-2-oxoneocleroda-3,13-dien-15-ol。

化合物20透明膠狀;分子式為C20H34O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.42(1H，tq，J= 7.0，1.3 Hz，H-3)，5.35(1H，dt，J= 4.6，1.5 Hz，H-14)，4.15(1H，s，H-2)，4.13(2H，d，J= 7.0 Hz，H-15)，1.64(3H，s，H-16)，0.94(3H，s，H-19)，0.81(3H，d，J= 6.6 Hz，H-18)，0.73(3H，s，H-17)，0.73(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：27.6(C-1)，65.5(C-2)，150.1(C-3)，122.2(C-4)，38.5(C-5)，36.4(C-6)，36.6(C-7)，36.4(C-8)，38.9(C-9)，41.0(C-10)，28.1(C-11)，32.4(C-12)，141.2(C-13)，122.9(C-14)，59.6(C-15)，16.7(C-16)，16.0(C-17)，18.2(C-18)，18.7(C-19)，18.5(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[26]報道基本一致，故鑒定化合物20為2β-hydroxykolavenol。

化合物21透明膠狀;分子式為C20H34O2。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.39(1H，ddq，J= 7.0，5.5，1.3 Hz，H-14)，4.14(2H，d，J= 6.9 Hz，H-15)，2.92(1H，d，J= 1.9 Hz，H-3)，1.67(3H，d，J= 1.3 Hz，H-16)，1.17(3H，s，H-18)，1.04(3H，s，H-19)，0.78(3H，m，H-17)，0.64(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：15.5(C-1)，28.4(C-2)，62.4(C-3)，66.6(C-4)，37.4(C-5)，37.3(C-6)，28.3(C-7)，36.2(C-8)，39.2(C-9)，48.0(C-10)，37.0(C-11)，33.2(C-12)，140.7(C-13)，123.1(C-14)，59.6(C-15)，16.7(C-16)，16.1(C-17)，17.0(C-18)，19.9(C-19)，18.8(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[27]報道基本一致，故鑒定化合物21為ent-3β,4β-epoxyclerod-13E-en-15-ol。

化合物22透明膠狀;分子式為C22H36O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.69(1H，p，J= 1.1 Hz，H-3)，4.05(2H，m，H-15)，2.02(3H，s，OAc)，1.86(3H，d，J= 1.4 Hz，H-16)，1.08(3H，m，H-18)，0.87(3H，d，J= 6.5 Hz，H-20)，0.79(3H，d，J= 6.2 Hz，H-17)，0.77(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：35.6(C-1)，200.5(C-2)，125.6(C-3)，171.3(C-4)，39.9(C-5)，35.0(C-6)，27.0(C-7)，35.6(C-8)，38.6(C-9)，45.7(C-10)，34.7(C-11)，30.3(C-12)，29.5(C-13)，35.9(C-14)，62.9(C-15)，19.4(C-16)，15.8(C-17)，18.5(C-18)，19.1(C-19)，18.1(C-20)，172.7(CH3COO)，21.1(CH3COO)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道基本一致，故鑒定化合物22為2-oxodihydrokolavenol acetate。

化合物23透明膠狀;分子式為C22H40O3。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.41(1H，m，H-14)，4.13(2H，d，J= 7.0 Hz，H-15)，3.79(1H，t，J= 2.9 Hz，H-3)，3.34(2H，2dq，J= 11.0，7.0 Hz，4-OCH2CH3)，3.11(3H，d，J= 7.0 Hz，4-OCH2CH3)，1.68(3H，s，H-16)，1.15(3H，s，H-18)，1.09(3H，s，H-19)，0.76(3H，d，J= 6.3 Hz，H-17)，0.70(3H，s，H-20)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：16.2(C-1)，30.7(C-2)，72.0(C-3)，79.4(C-4)，42.4(C-5)，32.0(C-6)，26.9(C-7)，36.1(C-8)，38.6(C-9)，39.5(C-10)，37.3(C-11)，33.2(C-12)，141.5(C-13)，123.0(C-14)，59.6(C-15)，16.3(C-16)，16.6(C-17)，14.5(C-18)，17.7(C-19)，18.5(C-20)，57.0(4-OCH2CH3)，16.3(4-OCH2CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道基本一致，故鑒定化合物23為(3α,4β,13E)-4-ethoxyneoclerod-13-ene-3,15-diol。

2.2 PTP-1B抑制活性篩選結(jié)果

本文對分離得到的23個化合物進行PTP-1B抑制活性篩選，結(jié)果見表1，與陽性藥蘇拉明鈉對比(抑制率62.31%，IC50值為134.81±8.36 μmol/L)，化合物3、12、16、21表現(xiàn)出PTP-1B抑制活性，IC50值分別為31.25±0.64、0.30±0.56、0.64±0.51、78.50±0.59 μmol/L。

表1 化合物對PTP-1B的影響Table 1 Effects of the compounds on PTP-1B

3 討論與結(jié)論

本項研究從密花樫木根乙酸乙酯萃取物中共分離得到23個成分，并且進行PTP-1B抑制活性篩選，在此基礎(chǔ)上對構(gòu)效關(guān)系進行初步探討?；衔?、16、21均為clerodane型，化合物12為prenyleudesmane型，且抑制效果最好，提示prenyleudesmane型二萜抑制活性強于clerodane型；化合物3、21均為E構(gòu)型，化合物16為Z構(gòu)型，而化合物16表現(xiàn)出較強的抑制活性，僅次于化合物12，提示Z型二萜類化合物抑制活性較強；化合物3、16結(jié)構(gòu)中含有乙?；?，且抑制活性均較好，乙酰基是否與抑制活性有關(guān)還需進一步探討。

二萜類成分在小分子天然PTP-1B抑制劑開發(fā)中發(fā)揮了不錯的潛力，樫木屬植物是二萜類成分的豐富來源[28]，從該屬植物中挖掘天然來源的抗糖尿病候選藥物是值得進一步探索。