趙 煥,吳絲雨,段瑞軍,曾 軍, 戴好富,梅文莉,許鳳清*,黃圣卓*
1中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 海南省黎藥資源天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海口 571101; 2安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,合肥 230012;3中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 海南熱帶農(nóng)業(yè)資源研究院,???571101
農(nóng)業(yè)農(nóng)村部“南鋒專項(xiàng)”考察團(tuán)隊(duì)調(diào)查發(fā)現(xiàn)大戟科(Euphorbiaceae)大戟屬EuphorbiaLinn.多年生草本植物海濱大戟Euphorbiaatoto為西沙群島島礁特色植物,并且是永樂群島和宣德群島的主要海岸帶優(yōu)勢植物[1,2]。西沙群島藥用植物資源較為豐富,其中大戟屬的藥用植物也相對較多,且多可作為清熱類草藥[3]。海南沿海當(dāng)?shù)鼐用駥⒑I大戟作為清熱解毒藥物,用于治療痢疾和泄瀉等癥[4]。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)海濱大戟的粗提物具有較好的抗炎活性,體外能夠抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7產(chǎn)生NO(200 μg/mL濃度下,抑制率為83.97%)。為了了解海濱大戟的主要活性物質(zhì),本研究對海濱大戟地上部分進(jìn)行化學(xué)成分及其體外抗炎活性和細(xì)胞毒活性研究。
Bruker AV-500型超導(dǎo)核磁共振儀(德國Bruker公司);ESI-MS質(zhì)譜儀(德國Bruker amazon SL公司);CA-1111冷卻水循環(huán)裝置(上海愛朗儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph Laborota公司);MCP 5100旋光儀(奧地利Anton Paar公司);FDS-2000冷凍干燥機(jī)(日本東京理化器械株式會(huì)社);METTLER TOLEDO ME204精密和分析天平[萬分之一,梅特勒-托力多儀器(上海)公司];Varioskan LUX酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司);GALAXYR CO2培養(yǎng)箱(英國RSBiotech公司);HHB11360-S普通培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);SW-40超凈工作臺(tái)(河流科技有限公司);UNIQUE-R20純水系統(tǒng)(廈門銳思捷科學(xué)儀器有限公司)。
色譜硅膠板G/H/G254、柱色譜硅膠(青島海洋化工廠);Rp-18(20~45 μm,日本Fuji Silysia Chemical Ltd公司);Sephadex LH-20(美國GE Healthcare公司);常用有機(jī)試劑為國產(chǎn)AR級試劑(天津市康科德科技有限公司);氘代試劑(美國Merck公司);DMSO(西隴化工股份有限公司);濃硫酸(山東淄博濱嶺化工有限公司);精碘(上海SUNHEAT化工公司);碘顯色劑和5%~10%硫酸-乙醇顯色劑。
小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW 264.7)(中國科學(xué)院干細(xì)胞庫);人胃癌細(xì)胞株(SGC-7901)、人慢性髓原白血病細(xì)胞株(K562)、人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、人肺癌細(xì)胞株(A549)和人肝癌細(xì)胞株(BEL-7402)(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫);脂多糖(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號S-1732)、4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷(上海源葉生物科技有限公司,批號K22J9B64113)、槲皮素(美國默克公司,批號SLBZ4289)、Griess試劑(上海源葉生物科技有限公司,批號L01N10G101815)和四甲基偶氮唑藍(lán)(廣州賽國生物科技有限公司,批號EZ2811E134);DMEM培養(yǎng)基(賽默飛世爾科技公司,批號8120459)、胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司,批號11011-8611)、丙酮酸鈉(美國賽默飛世爾科技公司,批號2323639)和谷氨酰胺(美國賽默飛世爾科技公司,批號2323475)。
取新鮮海濱大戟地上部分全草10 kg切碎、晾干、粉碎后,浸泡在95%乙醇(20 L)液中,每3小時(shí)回流提取(78 ℃)1次,共提取3次,合并減壓濃縮后得乙醇浸膏(1.23 kg)。浸膏加水混懸,乙酸乙酯萃取3次,減壓濃縮回收溶劑得乙酸乙酯萃取物347 g。乙酸乙酯萃取物340 g,經(jīng)硅膠柱色譜(200~300目),石油醚-丙酮(V/V,30∶1→0∶1,每個(gè)梯度4 L)梯度洗脫,得12個(gè)流份Fr.1~Fr.12。
Fr.3(37.0 g)經(jīng)Rp-18反相柱色譜梯度洗脫得4個(gè)流分Fr.3.1~Fr.3.4。Fr.3.1(2.3 g)經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)洗脫得10個(gè)流分Fr.3.1.1~Fr.3.1.10。Fr.3.1.5(70.0 mg)經(jīng)硅膠柱色譜石油醚-丙酮(9∶1)洗脫得化合物6(1.8 mg)。Fr.3.3(2.3 g)經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)洗脫得4個(gè)流分Fr.3.3.1~Fr.3.3.4。Fr.3.3.1(383.4 mg)經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜石油醚-丙酮(15∶1)洗脫,再經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)分離純化得化合物5(8.4 mg)。Fr.4(42.0 g)經(jīng)Rp-18反相柱色譜梯度洗脫得7個(gè)流分Fr.4.1~Fr.4.7。Fr.4.3(670 mg)經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜,石油醚-丙酮(40∶1)洗脫,再經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)分離純化得化合物1(3.1 mg)。Fr.5(29.0 g)經(jīng)Rp-18反相柱色譜梯度洗脫得3個(gè)流分Fr.5.1~Fr.5.3。Fr.5.2(4.3 g)經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜,石油醚-丙酮(10∶1)洗脫,再經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)分離純化得化合物16(4.9 mg)和15(5.7 mg)。Fr.5.3(11.7 g)經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜,石油醚-丙酮(8∶1)洗脫,再經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)分離純化得化合物17(2.1 mg)。Fr.6(5.8 g)經(jīng)Rp-18反相柱色譜梯度洗脫得5個(gè)流分Fr.6.1~Fr.6.5。Fr.6.3(1.1 g)經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)洗脫得3個(gè)流分Fr.6.3.1~Fr.6.3.3。Fr.6.3.3(73.7mg)經(jīng)硅膠柱色譜,石油醚-丙酮(3∶1)洗脫,再經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇),重結(jié)晶得到化合物2(7.8 mg)。Fr.8(3.1 g)經(jīng)Rp-18反相柱色譜梯度洗脫得6個(gè)流分Fr.8.1~Fr.8.6。Fr.8.3(40.3 mg)經(jīng)硅膠柱色譜,石油醚-丙酮(10∶1)洗脫得化合物4(1.8 mg)。Fr.8.5(96 mg)經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)洗脫得4個(gè)流分Fr.8.5.1~Fr.8.5.4。Fr.8.5.1(130 mg)經(jīng)硅膠柱色譜,石油醚-氯仿-丙酮(10∶10∶1)洗脫,再經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)純化分離得到化合物10(8.8 mg)。Fr.9(4.2 g)經(jīng)Rp-18反相柱色譜梯度洗脫得3個(gè)流分Fr.9.1~Fr.9.3。Fr.9.2(142.3 mg)經(jīng)硅膠柱色譜,氯仿-甲醇(50∶1)洗脫得化合物9(3.3 mg)和11(3.9 mg)。Fr.9.3(132.2 mg)經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)洗脫得3個(gè)流分Fr.9.3.1~Fr.9.3.3。Fr.9.3.2(78 mg)經(jīng)硅膠柱色譜,石油醚-氯仿-丙酮(3∶1∶1)洗脫,再經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)純化分離得到化合物18(7.6 mg)和3(2.6 mg)。Fr.9.3.3(16.3 mg)經(jīng)硅膠柱色譜,石油醚-氯仿-丙酮(5∶1∶1)洗脫,再經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)純化分離得到化合物14(4.2 mg)、13(4.3 mg)和7(3.6 mg)。Fr.10(2.3 g)經(jīng)Rp-18反相柱色譜梯度洗脫得5個(gè)流分Fr.10.1~Fr.10.5。Fr.10.2(341 mg)經(jīng)硅膠柱色譜,氯仿-甲醇(50∶1)洗脫得化合物8(2.3 mg)。Fr.10.3(63.2 mg)經(jīng)硅膠柱色譜,氯仿-甲醇(60∶1)洗脫得化合物12(3.3 mg)。
體外抗炎活性實(shí)驗(yàn)以槲皮素為陽性對照,采用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW 264.7),分別設(shè)置LPS誘導(dǎo)組、空白對照組和實(shí)驗(yàn)組。將待測樣品分為5個(gè)濃度梯度:100、75、50、25和12.5 μmol/L。選取生長良好的RAW 264.7細(xì)胞,取100 μL細(xì)胞液以5 × 104個(gè)/mL密度接種于96孔板上,于37 ℃、5% CO2、90%以上濕度條件下培養(yǎng)24 h,分別加入50 μL LPS(終濃度0.5 μg/mL)和50 μL待測化合物溶液(100~12.5 μmol/L)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔取100 μL上清液于新的96孔板中,之后向每孔加入100 μL的Griess試劑。在酶標(biāo)儀540 nm波長下檢測并記錄每孔的OD值(吸光度),采用Griess法測定化合物對NO釋放的抑制率,繪制化合物濃度-抑制率曲線圖,計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50值)[5-7]。
采用MTT法對化合物的細(xì)胞毒活性進(jìn)行篩選:實(shí)驗(yàn)所用腫瘤細(xì)胞系為K562、BEL-7402、SGC-7901、A549及Hela,以鹽酸阿霉素為陽性對照,DMSO為陰性對照。根據(jù)初篩抑制率設(shè)置待測化合物濃度(100、50、25、12.5和6.25 μmol/L)。分別在96孔板上接種100 μL濃度約5 × 104個(gè)/mL的待測細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后(培養(yǎng)條件:37 ℃、5% CO2、90%以上濕度,含有10%小牛血清的四甲基偶氮唑藍(lán)培養(yǎng)),加入100 μL待測化合物溶液培養(yǎng)72 h后觀察細(xì)胞形態(tài)。再向每孔細(xì)胞中加入15 μL(5 mg/mL)的MTT溶液,37 ℃條件下反應(yīng)4 h后吸棄上清液,繼續(xù)向每孔加入100 μL的DMSO,使其充分溶解。在酶標(biāo)儀490 nm波長下檢測并記錄每孔的OD值(吸光度),計(jì)算腫瘤細(xì)胞生長抑制率及半數(shù)抑制濃度(IC50值)[8]。
比較文學(xué)的理論和方法,新加坡學(xué)界其實(shí)并不陌生。早在1973年,本地學(xué)者王潤華教授便已在南洋大學(xué)開設(shè)了“比較文學(xué)概論”和“西方漢學(xué)研究”的課程,向中文系學(xué)生介紹比較文學(xué)的學(xué)科理論和研究方法,進(jìn)而引導(dǎo)學(xué)生將它們應(yīng)用到中國文學(xué)的研究上?;仡欉@段教學(xué)經(jīng)歷,王潤華教授有這樣的描述:
表1 化合物1的核磁1H和13C NMR數(shù)據(jù)(500和125 MHz,CDCl3)Table 1 The 1H and 13C NMR date of compound 1(500 and 125 MHz,CDCl3)
圖1 化合物1的關(guān)鍵2D NMR相關(guān)信號Fig.1 Key 2D NMR correlations of compound 1
化合物3黃色粉末(MeOH);ESI-MS:m/z287.1 [M+H]+,分子式C15H10O6;1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:8.11(2H,d,J= 8.8 Hz,H-2′,-6′),7.93(2H,d,J= 8.8 Hz,H-3′,-5′),6.42(1H,s,H-8),6.21(1H,s,H-6);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:146.9(C-2),136.5(C-3),176.1(C-4),160.8(C-5),98.3(C-6),165.4(C-7),94.0(C-8),158.8(C-9),103.5(C-10),121.9(C-1′),129.2(C-2′,-6′),115.8(C-3′,-5′),159.7(C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物3為山柰酚。
化合物4白色粉末(CHCl3);ESI-MS:m/z413.3 [M+H]+,分子式C28H44O2;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:5.38(1H,d,J= 5.5 Hz,H-7),5.25(1H,dd,J= 15.1,7.4 Hz,H-23),5.18(1H,dd,J= 15.1,8.2 Hz,H-22),1.11(3H,s,H-19),1.05(3H,d,J= 6.6 Hz,H-28),0.94(3H,d,J= 6.9 Hz,H-27),0.88(3H,d,J= 6.2 Hz,H-26),0.87(3H,d,J= 7.5 Hz,H-21),0.62(3H,s,H-18);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:31.7(C-1),31.0(C-2),67.9(C-3),39.6(C-4),37.3(C-5),73.8(C-6),117.7(C-7),144.2(C-8),76.1(C-9),43.9(C-10),23.1(C-11),39.4(C-12),43.6(C-13),54.9(C-14),22.8(C-15),28.1(C-16),56.1(C-17),12.5(C-18),19.0(C-19),40.6(C-20),22.2(C-21),132.3(C-22),135.5(C-23),43.0(C-24),33.2(C-25),19.8(C-26),20.1(C-27),17.7(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物4為6,9-環(huán)氧-麥角甾-7,22-二烯-3-醇。
化合物11白色粉末(CHCl3);ESI-MS:m/z566.4 [M+H]+,分子式C30H55N5O5;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:7.34~8.01(5H,m,-NH-7,-14,-21,-28,-35),4.58(1H,m,H-30),4.47(1H,m,H-23),4.17(1H,m,H-2),4.13(1H,m,H-16),0.97(3H,s,H-34),0.96(3H,s,H-27),0.96(3H,s,H-20),0.95(3H,s,H-13),0.95(3H,s,H-6),0.94(3H,s,H-19),0.93(3H,s,H-33),0.91(3H,s,H-26),0.90(3H,s,H-5),0.89(3H,s,H-12);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:172.4(C-1),57.1(C-2),38.9(C-3),25.0(C-4),10.9(C-5),15.8(C-6),173.7(C-8),59.4(C-9),36.4(C-10),25.5(C-11),10.8(C-12),15.7(C-13),172.3(C-15),54.0(C-16),39.9(C-17),25.4(C-18),22.4(C-19),22.8(C-20),172.5(C-22),52.4(C-23),41.7(C-24),25.3(C-25),23.0(C-26),22.1(C-27),173.6(C-29),51.9(C-30),39.7(C-31),25.2(C-32),22.9(C-33),22.0(C-34)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物11為viscumamide。
化合物13黃色粉末(MeOH);ESI-MS:m/z193.1 [M+H]+,分子式C10H8O4;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:7.88(1H,d,J= 9.4 Hz,H-4),7.13(1H,s,H-8),6.79(1H,s,H-5),6.23(1H,d,J= 9.4 Hz,H-3),3.90(3H,s,6-OCH3);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:164.1(C-2),112.6(C-3),146.1(C-4),108.1(C-5),146.5(C-6),147.1(C-7),104.0(C-8),151.4(C-9),110.0(C-10),56.8(6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物13為scopoletin。
化合物14白色粉末(MeOH);ESI-MS:m/z225.1 [M+H]+,分子式C13H20O3;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:5.77~5.90(3H,m,H-4,-7,-8),4.34(1H,m,H-9),2.50(1H,d,J= 16.9 Hz,H-2b),2.18(1H,d,J= 16.9 Hz,H-2a),1.93(3H,d,J= 1.3 Hz,H-11),1.26(3H,d,J= 6.5 Hz,H-10),1.06(3H,s,H-13),1.04(3H,s,H-12);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:42.4(C-1),50.7(C-2),201.2(C-3),127.1(C-4),167.5(C-5),80.0(C-6),136.9(C-7),130.0(C-8),68.7(C-9),23.8(C-10),19.6(C-11),23.5(C-12),24.5(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物14為corchoionol C。
化合物15淡黃色粉末(MeOH);ESI-MS:m/z176.1 [M+H]+,分子式C10H9O2N;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:8.07(1H,d,J= 6.7 Hz,H-4),7.98(1H,s,H-2),7.43(1H,d,J= 6.9 Hz,H-7),7.23(1H,dd,J= 7.2,5.7 Hz,H-5),7.20(1H,dd,J= 7.0,5.8 Hz,H-6),3.90(3H,s,-OCH3);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:133.2(C-2),108.2(C-3),121.9(C-4),122.5(C-5),123.7(C-6),112.9(C-7),168.8(C-8),127.3(C-3′),138.1(C-7′),51.4(9-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物15為吲哚-3-甲酸甲酯。
化合物16褐色固體(CHCl3);ESI-MS:m/z195.1 [M+H]+,分子式C10H10O4;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:11.01(1H,s,-OH),7.57(1H,dd,J= 8.4,7.4 Hz,H-5),7.05(1H,d,J= 7.4 Hz,H-4),7.01(1H,d,J= 8.4 Hz,H-6),4.65(1H,m,H-3),4.64(1H,m,H-1′),1.54(3H,d,J= 5.7 Hz,H-2′);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:168.7(C-1),69.3(C-3),116.3(C-4),137.0(C-5),118.0(C-6),162.2(C-7),106.8(C-8),141.3(C-9),80.1(C-1′),18.1(C-2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物16為3ξ-(1ξ-羥基)-7-羥基-1-苯并異呋喃酮。
化合物17白色粉末(CHCl3);ESI-MS:m/z145.1 [M+Na]+,分子式C7H6O2;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:9.91(1H,s,-CHO),7.83(2H,d,J= 8.5 Hz,H-2,-6),7.01(2H,d,J= 8.5 Hz,H-3,-5);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:161.2(C-1),116.1(C-2,-6),132.5(C-4),130.4(C-3,-5),190.8(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物17為對羥基苯甲醛。
化合物18白色針晶(MeOH);ESI-MS:m/z317.3 [M+H]+,分子式C18H36O4;1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:3.39(2H,m,9,10-OH),2.29(2H,t,J= 7.4 Hz,H-2),0.97~1.56(28H,m),0.92(3H,t,J= 7.0 Hz,H-18);13C MR(125 MHz,CDCl3)δ:177.7(C-1),33.9(C-2),27.0(C-3),34.0(C-8),75.3(C-9/10),75.2(C-9/10),35.0(C-11),33.1(C-12),30.2~30.8(C-4,-7,-13,-14),27.1(C-15),26.2(C-16),23.7(C-17),14.4(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]報(bào)道基本一致,故鑒定化合物18為9,10-二羥基十八烷酸。
化合物1~18的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2。
圖2 化合物1~18的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structures of compounds 1-18
實(shí)驗(yàn)初期對海濱大戟的粗提物進(jìn)行抗炎活性測試,發(fā)現(xiàn)提取物具有較好的體外抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7產(chǎn)生NO的活性(200 μg/mL濃度下,抑制率為83.97%),同時(shí)其對小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性(200 μg/mL濃度下,細(xì)胞毒性為96.55%),說明在海濱大戟中可能同時(shí)存在具有抗炎癥活性成分和細(xì)胞毒活性成分。
化合物1~18進(jìn)行體外抗炎活性測試,除化合物2具有較好的抑制LPS誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7產(chǎn)生NO的活性(IC5024.81 ± 1.58 μmol/L)外,其他化合物均沒有此活性,陽性對照IC50為15.23 ± 0.65 μmol/L;MTT法測試了18個(gè)化合物對K562、BEL-7402、SGC-7901、A549和Hela五種腫瘤細(xì)胞系的體外生長抑制作用(以鹽酸阿霉素為陽性對照:K562 IC500.07 ± 0.01 μmol/L、BEL-7402 IC500.47 ± 0.01 μmol/L、SGC-7901 IC500.22 ± 0.01 μmol/L、A549 IC500.47 ± 0.03 μmol/L和Hela IC500.28 ± 0.01 μmol/L),顯示所篩選的化合物對以上五種腫瘤細(xì)胞均無活性。
在前期研究基礎(chǔ)上[27],我們對海濱大戟的化學(xué)成分及藥理活性進(jìn)行了研究,從乙醇提取物的乙酸乙酯部位中分離到包括倍半萜、黃酮、甾體、三萜、肽類以及其他結(jié)構(gòu)類型化合物共計(jì)18個(gè),并發(fā)現(xiàn)了一個(gè)抗炎癥活性化合物6β-羥基肉桂內(nèi)酯(2)。本研究得到的18個(gè)化合物均為首次從海濱大戟中分離得到,其中除化合物10、13、14和17外,其他化合物還是首次在大戟屬分離得到,化合物1為一個(gè)新天然產(chǎn)物,本文中對該化合物的相關(guān)核磁數(shù)據(jù)進(jìn)行了補(bǔ)充。通過本研究,基本了解了海濱大戟乙酸乙酯提取物的主要化學(xué)成分,為海濱大戟在民間藥用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。
致謝:化合物的波譜數(shù)據(jù)由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所海南省黎藥資源天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室測試中心測定。