短周期葉用林模式下不同杜仲無性系枝皮化學成分分析

孟益德，王 琦，劉攀峰，杜紅巖，杜慶鑫*

1中國林業(yè)科學研究院經濟林研究所；2經濟林種質創(chuàng)新與利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室； 3國家林業(yè)草原杜仲工程技術研究中心，鄭州 450003

杜仲(EucommiaulmoideOliv.)，是第四紀冰川侵襲后留存于我國的單種屬孑遺樹種，也是我國重要的林源藥用樹種，自古以取皮入藥而著稱[1]。杜仲皮富含木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、黃酮等化合物，例如，京尼平苷酸具有降血壓和調節(jié)血壓的功效，京尼平苷具有抗腫瘤活性和抗補體性，桃葉珊瑚苷具有較強的鎮(zhèn)痛、抗菌消炎作用[2]。而木脂素類松脂醇二葡萄糖苷則是杜仲皮中已知的、具有降血壓功效的活性成分，因此，杜仲皮作為中藥在醫(yī)療保健等方面起著十分重要的作用[3,4]。

隨著杜仲全樹綜合開發(fā)利用理念的提出，杜仲的栽培模式也由傳統(tǒng)的藥用栽培模式發(fā)展至果用杜仲栽培模式、雄花用栽培模式、材藥兼用栽培模式以及葉用栽培模式等多種經營模式[5]。杜仲葉用林栽培模式利用杜仲萌芽能力強的特性，使經營周期縮短，極大提高了杜仲葉、皮的產量和質量，經濟效益顯著[6]。有研究對傳統(tǒng)喬林和葉用林模式杜仲葉中化學成分進行了比較分析，發(fā)現(xiàn)次生代謝物可有效區(qū)分喬林與葉林[7]。此外，葉用林相較于喬林模式的杜仲葉及皮中綠原酸含量更高，確定了葉用林栽培為最佳栽培模式[8]。另有研究認為施用外源激素可顯著提高短周期葉林杜仲葉及皮的膠含量[9]。但是對葉用林栽培模式下不同杜仲無性系間枝皮化學成分研究尚未開展，限制了葉用林栽培模式下枝皮資源開發(fā)利用。

頂空固相微萃取(HS-SPME)是一種集萃取、濃縮和解吸于一體的樣品預處理技術，該方法操作簡便、用樣量少、無繁雜的前處理過程，同時可以避免樣品中不穩(wěn)定成分的氧化和分解[10]。近年來與氣相質譜(GC-MS)相結合，已被廣泛應用于植物揮發(fā)性成分的研究[11,12]。研究表明，很多揮發(fā)性物質成分不僅可直接抗蟲、入藥，或作為有機合成的先導成分，而且又是植物各代謝途徑的重要中間體，對分析植物代謝網絡和研究植物自身防御反應等具有一定的指導作用[13]。傅里葉變換紅外光譜(FTTR)也是質量評價中常用的分析方法，可對樣品進行整體上定性分析，具有快速、準確、無損的特點[14]。因此，本研究采用高效液相色譜法(HPLC)對短周期葉用林栽培模式下8個杜仲無性系枝皮7種主要活性成分的含量進行測定，結合頂空固相微萃取-氣質聯(lián)用(HS-SPME-GC-MS)技術分析其揮發(fā)性成分，找出不同無性系杜仲枝皮中差異性揮發(fā)物質，并利用紅外光譜進行比較分析。初步判定各無性系的化學特征，以期為杜仲短周期葉用林模式下枝皮的質量控制、定向培育以及資源開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以短周期葉用林栽培模式下2年生8個杜仲無性系為實驗材料，2020年10月對萌發(fā)的枝條進行平茬處理，收集平茬后的枝條剝皮，低溫冷藏帶回實驗室烘干至恒重，經中國林業(yè)科學研究院經濟林研究所孫志強研究員鑒定為杜仲科植物杜仲EucommiaulmoideOliv.的干燥枝皮。所有枝皮均采自河南省新鄉(xiāng)市原陽縣中國林業(yè)科學研究院經濟林研究所原陽試驗基地(34°55′N，113°36′E)，試驗地所屬氣候類型為暖溫帶大陸性季風氣候，四季分明，年均日照時數(shù)2 324.5 h，年平均氣溫14.4 ℃，年溫差27.6 ℃，平均年降水量571.7 mm，栽培條件以及管理方式基本一致。8個杜仲無性系編號分別為EU1、EU2、EU3、EU4、EU5、EU6、EU7、EU8。

1.2 儀器與試劑

ACQUITY Arc型高效液相色譜儀，配置2998 PDA型二極管陣列檢測器(美國Waters公司)；Trace 1310型氣相色譜聯(lián)用ISQ QD型單四級桿質譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；65 μm PDMS/DVBSPME固相微萃取針(美國Supelco公司)；XS204萬分之一電子天平(梅特勒?托利多上海儀器有限公司)；HT-300 BQ超聲波清洗機(濟寧天華超聲電子儀器有限公司)；5430 R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；Milli-Q Integral超純水機(美國Merck Millipore公司)。

兒茶素(批號：CDZE-B21722)購自上海源葉生物科技有限公司(純度≥98%)；桃葉珊瑚苷(批號：CDAA-280431)、綠原酸(批號：CDAA-280804)、京尼平苷(批號：CDAA-280017)、正構烷烴混標C10～C25(CDAA-M-690035-HD)購自上海安譜實驗科技股份有限公司(純度≥98%)；京尼平苷酸(批號：MUST-21062003)、松脂醇二葡萄糖苷(批號：MUST-21032510)、紫云英苷(批號：MUST-21022410)購自成都曼思特生物科技有限公司(純度≥98%)；乙腈和甲醇為色譜純(湖北弗頓科學技術有限公司)，甲酸為分析純(上海麥克林生化科技有限公司)，水為超純水。

1.3 主要活性成分測定

1.3.1 樣品制備

分別精密稱取干燥粉碎后的杜仲枝皮樣品粉500 mg，每份樣品中加入60%甲醇水溶液，混勻超聲提取30 min，樣品和提取液比例為1∶20，于4 ℃冰箱靜置過夜。12 000 r/min離心10 min，取上清液，過微孔濾膜(0.22 μm)，置于液相進樣瓶中待測，每個樣品制備3個生物學重復。

1.3.2 HPLC色譜條件

色譜測定條件參考孫佳等[15]的方法并稍做修改。色譜柱：賽默飛Syncronis C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.2%甲酸溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，5%→17% A；10～25 min，17%→20% A；25～30 min，20%→30% A；30～50 min，30%→50% A；50～55 min，50%→70% A；55～57 min，70%→5% A)；檢測波長：0～9 min于204 nm處測定桃葉珊瑚苷，9～11 min于239 nm處測定京尼平苷酸，11～15.4 min于325 nm處測定綠原酸，15.4～16 min于276 nm處測定兒茶素，16～17 min于239 nm處測定京尼平苷，17～18 min于276 nm處測定松脂醇二葡萄糖苷，18～50 min于364 nm處測定紫云英苷；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL?；旌蠘藴势啡芤?A)及杜仲葉片樣品溶液(B)的HPLC色譜圖見圖1。

精密稱取桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、兒茶素、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、紫云英苷的標準品各適量，置于同一量瓶中，加甲醇溶解并配制成質量濃度分別為0.4、0.5、1、0.08、0.1、0.08、0.1 mg/mL的混合標準品溶液。分別精密吸取混合標準品溶液2、4、5、6、7、8 μL進樣分析，測定其峰面積。以各待測成分進樣量(x，μg)為橫坐標、峰面積(y)為縱坐標進行線性回歸，分別得到以下回歸方程。桃葉珊瑚苷：y=3.0×106x+14 903(R2=0.999 1)，京尼平苷酸：y=1.0×107x-55 546(R2=0.999 4)，綠原酸：y=2.0×107x+2.0×106(R2=0.998 3)，兒茶素：y=2.0×107x-7 632(R2=0.999 8)，京尼平苷：y=1.0×107x+11 429(R2=0.998 4)，松脂醇二葡萄糖苷：y=4.0×106x+8 766.7(R2=0.998 8)，紫云英苷：y=1.0×107x-61 050(R2=0.999 1)[16]。

圖1 混合標準品溶液(A)及樣品溶液(B)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standard solution (A) and sample solution (B)注：1.桃葉珊瑚苷；2.京尼平苷酸；3.綠原酸；4.兒茶素；5.京尼平苷；6.松脂醇二葡萄糖苷；7.紫云英苷。Note:1.Aucubin;2.Geniposidic acid;3.Chlorogenic acid;4.Catechin;5.Geniposide;6.Pinoresinol diglucoside;7.Astragaline.

1.4 揮發(fā)性成分的測定

1.4.1 樣品處理

將粉碎后枝皮樣品粉0.7 g、飽和氯化鈉3.6 g以及12 mL水置于頂空瓶中，頂空萃取瓶置于70 ℃下平衡20 min后，插入在GC進樣口250 ℃溫度下老化1 h的萃取頭，磁力攪拌吸附萃取40 min。然后將萃取頭轉移至220 ℃的氣相色譜進樣口中以無分流方式熱解析3 min，進行GC-MS檢測分析。

1.4.2 GC-MS條件

GC條件：色譜柱型號為TG-WAXMS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。色譜條件：升溫程序：起始溫度50 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至70 ℃，然后以2 ℃/min升至160 ℃，最后以3 ℃/min升至220 ℃，保持10 min。載氣為高純氦氣(99.999%)，流速為1 mL/min，傳輸線溫度為250 ℃，進樣口溫度為220 ℃，解吸溫度為220 ℃。

MS條件：電子轟擊(EI)離子源，電子能量70 eV，燈絲延遲180 s，離子源溫度280 ℃。質量掃描范圍：m/z40～500，掃描方式為全掃描。

1.4.3 定性定量分析

將GC-MS測定后未知化合物質譜圖經AnalysisBaseFileConverter軟件轉換為分析基本文件abf格式，之后導入MS-DIAL軟件對原始圖譜進行峰檢測、峰識別、解卷積、定性、峰對齊、濾波、保留時間校正等處理，代謝物注釋基于氣相色譜保留指數(shù)(retention index，RI)以及專用代謝MoNA volatile數(shù)據(jù)庫，采用譜庫結合線性保留指數(shù)對各組分進行定性，篩選出匹配度在80%以上的化合物[17]。根據(jù)正構烷烴的保留時間計算各物質的保留指數(shù)，正構烷烴的碳原子數(shù)為C10～C25，保留指數(shù)(RI)=100n+(RTX-RTn)/(RTn+1-RTn)×100，式中n為該化合物前一正構烷烴所含碳原子數(shù)；RTX表示該物質的保留時間；RTn表示該物質前一正構烷烴的保留時間；RTn+1表示該物質后一正構烷烴的保留時間。得到原始數(shù)據(jù)矩陣后導出于Excel表中，采用峰面積歸一化法，以各揮發(fā)組分的峰面積占總峰面積之比值表示組分相對含量，結果取3次重復的平均值表示。

1.5 紅外光譜測定

取8個杜仲無性系枝皮各約2 mg與KBr 200 mg混合研磨均勻，手動壓片機壓成均勻透明薄片后掃描獲得紅外光譜圖，同一樣品測定3次重復，掃描光譜范圍4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，利用SIMCA-P軟件進行聚類分析(HCA)和主成分分析(PCA)，偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)模型計算變量重要性投影VIP值[18]。

2 結果與分析

2.1 不同杜仲無性系枝皮主要活性成分含量比較

短周期葉用林模式下不同杜仲無性系枝皮的主要活性成分含量如表1所示。環(huán)烯醚萜類物質桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸和京尼平苷在杜仲枝皮中含量較高，平均含量分別為24 807、11 524、6 252 μg/g，兒茶素含量較低為66 μg/g。桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸在無性系EU5中含量最高，京尼平苷和松脂醇二葡萄糖苷在EU4中含量最高，而苯丙素類物質綠原酸和兒茶素在EU7中含量最高，無性系EU2中黃酮類物質紫云英苷含量較高。上述結果表明，不同無性系杜仲枝皮各活性成分之間存在顯著差異。

表1 不同杜仲無性系枝皮的活性成分含量Table 1 Content of active components in the branch bark of different E.ulmoides clones(μg/g)

2.2 不同杜仲無性系枝皮揮發(fā)性成分分析

2.2.1 揮發(fā)性物質總離子流圖

短周期葉用林模式下不同杜仲無性系枝皮揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流圖如圖2所示，TIC圖提供了在不同時間點質譜中所有離子強度之和的連續(xù)描述，宏觀反映所有揮發(fā)性物質在氣相色譜分離情況。從圖2可以直觀地看出，8個無性系之間揮發(fā)性物質峰高、峰面積存在較大的差異。

圖2 不同杜仲無性系枝皮揮發(fā)性成分總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of volatile components in branch bark of different E.ulmoides clones

2.2.2 揮發(fā)性物質種類及含量

不同杜仲無性系枝皮的主要揮發(fā)性成分見表2，共在8個無性系中分離鑒定出70種揮發(fā)性成分，包括酯類(24種)，醇類(16種)，醛類(12種)，萜類(7種)，酮類(5種)，內酯(3種)，烯類(3種)。無性系EU1相對含量在1%以上的化合物共檢測出34種揮發(fā)成分，包括8種醇、11種醛、7種酯、3種萜、2種酮、2種內酯和1種烯，EU2檢測出33種揮發(fā)成分，包括7種醇、9種醛、7種酯、4種萜、3種酮、2種內酯和1種烯，無性系EU3和EU4均檢測出32種揮發(fā)成分，EU3包括9種醇、9種醛、6種酯、4種萜、1種酮、2種內酯和1種烯，EU4包括7種醇、10種醛、7種酯、3種萜、2種酮、2種內酯和1種烯，EU5檢測出33種揮發(fā)成分，包括8種醇、10種醛、7種酯、4種萜、1種酮、2種內酯和1種烯，EU6檢測出37種揮發(fā)成分，包括8種醇、10種醛、8種酯、5種萜、3種酮、2種內酯和1種烯，EU7檢測出33種揮發(fā)成分，包括8種醇、9種醛、9種酯、4種萜、1種酮和2種內酯，EU8檢測出34種揮發(fā)成分，EU8相對于其他無性系枝皮檢測出的酯類最多，為10種酯。

在檢測的相對含量在1%以上的化學成分中，8個無性系杜仲枝皮中共有18種揮發(fā)性成分。而無性系EU1特有的揮發(fā)性成分為庚醛，EU6特有乙基芳樟醇、反式-2-己烯醇2種揮發(fā)性成分，EU7特有的揮發(fā)性成分為十三硫醇，EU8特有2種揮發(fā)性成分，為10-十一烯酸己酯和甲酸薄荷酯。在檢測的相對含量在5%以上的揮發(fā)成分中，無性系EU1含有棕櫚酸異辛酯、山崳醇和月桂酸異丁酯3種揮發(fā)成分，EU2中包括異植物醇、2-(二甲氧基甲基)環(huán)戊酮、(Z)-9-庚烯、2-乙硫基乙醇和庚醛二甲基縮醛5種揮發(fā)成分，EU3包括十六醇、(Z)-9-庚烯和17-甲基十八酸甲酯3種揮發(fā)成分，EU4包括2-乙硫基乙醇、2-(二甲氧基甲基)環(huán)戊酮和庚醛二甲基縮醛3種揮發(fā)成分。無性系EU5中相對含量在5%以上的揮發(fā)成分有17-甲基十八酸甲酯、異植物醇和己醛二己基縮醛，EU7有17-甲基十八酸甲酯，EU8有異植物醇和短指軟珊瑚內酯，這些揮發(fā)成分是杜仲枝皮的主要揮發(fā)物質。EU6揮發(fā)性物質相對含量均在5%以下。上述表明，采用HS-SPME結合GC-MS能夠很好的表征不同杜仲無性系枝皮揮發(fā)性成分的組成信息。

8個杜仲無性系揮發(fā)物質含量有明顯差異，萜類物質異植物醇在EU2、EU5以及EU8無性系中相對含量均最高，分別占7.24%、9.40%、6.35%。2-(二甲氧基甲基)環(huán)戊酮和2-乙硫基乙醇在EU2和EU4中相對含量均較高，月桂酸異丁酯在EU1和EU7中相對含量較高，分別為4.94%、5.13%，十六醇在EU3中相對含量最高為9.51%，而在其他無性系中相對含量不足2%。

表2 不同杜仲無性系枝皮揮發(fā)性氣體及相對含量Table 2 Relative content of volatile gases in branch bark of different E.ulmoides clones

續(xù)表2(Continued Tab.2)

2.2.3 揮發(fā)物質類別及含量

通過比較8個杜仲無性系枝皮中不同類別的揮發(fā)物質成分相對含量發(fā)現(xiàn)，如表3所示。醇類作為普遍性揮發(fā)性物質，在無性系EU3中相對含量最高，占總揮發(fā)物質成分的26.03%。EU1、EU2、EU4和EU6均以醛類物質相對含量最高，分別占總揮發(fā)物質成分的26.82%、24.75%、28.43%、25.06%，EU5、EU7、EU8均以酯類物質相對含量最高，分別占總揮發(fā)物質成分的26.31%、31.28%、29.25%，萜類物質在EU5中相對含量較高，這表明醇、醛、酯類是不同杜仲無性系枝皮的主要揮發(fā)物質成分。

表3 不同杜仲無性系枝皮中各類別揮發(fā)性成分相對質量分數(shù)Table 3 Relative mass fraction of various types of volatile components in the branch bark of different E.ulmoides clones

2.3 不同杜仲無性系枝皮的差異化物質成分

2.3.1 基于主要活性成分的不同杜仲無性系聚類和主成分分析

為進一步比較不同杜仲無性系枝皮活性成分的差異性，利用7種主要活性成分進行聚類和主成分分析，結果如圖3、4所示。通過聚類分析可將杜仲8個無性系分為3組，分別為I組(EU1、EU4、EU5)、II組(EU3、EU4)、III組(EU2、EU6、EU8)。8個無性系主成分分析數(shù)據(jù)的總方差為97.5%，包含3種主成分，其中主成分1(PC1)的貢獻率為79.90%，主成分2(PC2)的貢獻率為9.55%，主成分3(PC3)的貢獻率為7.99%。在第一維度(PC1)上，無性系EU1、EU4、EU5位于右側，EU3、EU8位于左側，EU2、EU6、EU7位于中間，這表明PC1可明顯區(qū)分劃分出的三個組別。且在PC1上對無性系EU1、EU4、EU5有貢獻的活性成分主要是環(huán)烯醚萜類物質京尼平苷酸、京尼平苷、桃葉珊瑚苷。

2.3.2 不同無性系杜仲枝皮的差異揮發(fā)物質篩選

構建PLS-DA模型衡量不同組別之間的差異，明確不同杜仲無性系枝皮之間的差異揮發(fā)物質成分，結果如圖5所示。在交互檢驗中，原始模型的R2Y和Q2分別為0.992和0.818，均超過0.8，表明PLS-DA模型沒有過擬合，在置換檢驗中，置換后模型R2Y和Q2分別為0.964和0.225，均小于原始模型的R2Y和Q2，說明PLS-DA模型的數(shù)據(jù)可靠，可用于分析差異化揮發(fā)性物質。根據(jù)貢獻值大于1從模型結果中篩選出22種揮發(fā)性物質，如表4所示，分別為溴化香葉酯、己醛二己基縮醛、葎草烯、丁酸香茅酯、環(huán)十二酮、乙酸油酯、四氫香葉甲酸酯、戊酸香茅酯、馬來酸二丁酯、柱頭甾-5-烯-3β-醇、十六醇、順式橙花苷醋酸酯、棕櫚酸異辛酯、乙酰丙酸己酯、(Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸甲酯、十一醛、1-十一醇、順-3-己烯醛、反式-2-己烯醇、1-庚醇、反-2-癸醛、丙酸薄荷酯，可將這些揮發(fā)物質成分作為8個杜仲無性系枝皮的特征物質，其主要為酯類揮發(fā)性成分。

圖3 不同杜仲無性系的聚類分析Fig.3 Clustering analysis of different E.ulmoides clones

圖4 不同杜仲無性系的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of different E.ulmoides clones

圖5 不同杜仲無性系PLS-DA分析Fig.5 PLS-DA analysis of different E.ulmoides clones

2.4 不同杜仲無性系枝皮的紅外光譜分析

通過傅里葉紅外光譜分析8個杜仲無性系的指紋圖譜，如圖6所示，發(fā)現(xiàn)紅外信號峰部分波段的信號強度發(fā)生了改變。首先在3 400 cm-1處主要是材料中或者是空氣中的-OH伸縮振動所引起的寬峰。2 900 cm-1綠色框標記區(qū)域是由杜仲枝皮中的氨基成分引起的多峰信號，主要是N-H鍵的伸縮振動和亞甲基飽和C-H鍵的伸縮振動，這是存在揮發(fā)性成分的特征表現(xiàn)[19]。所有樣品在2 300 cm-1處都存在有個小的吸收波動，這是在紅外測試過程中外界因素所誘發(fā)的。在1 737 cm-1處的振動主要是含有C=O鍵化合物的伸縮振動吸收峰。1 654 cm-1紅外吸收峰是由杜仲枝皮中的烯烴物質造成的，歸屬于材料的C=C雙鍵的伸縮振動，此處無性系EU3吸收較強可能與較高含量的(Z)-9-庚烯相關。1 600～1 170 cm-1綠色框標記主要是C-H鍵的對稱變形振動和不對稱變形振動所導致的振動峰群，此處官能團活性差異不明顯。最后在1 053 cm-1處的紅外信號是由C-O鍵的伸縮振動所引起的，此處無性系EU1、EU4和EU5具有較強的吸收峰，這可能與含有較多的環(huán)烯醚萜苷類成分有關。

表4 不同杜仲無性系枝皮篩選的差異揮發(fā)成分Table 4 Differential volatile components screened from branch bark of different E.ulmoides clones

續(xù)表4(Continued Tab.4)

圖6 不同杜仲無性系枝皮的傅里葉變換紅外光譜Fig.6 Fourier transform infrared spectra of branch bark of different E.ulmoides clones

3 討論與結論

本研究采用HPLC和HP-SPME-GC-MS對短周期葉用林模式下不同杜仲無性系枝皮的化學成分進行了定量檢測分析，同時利用紅外光譜進行了比較，提取出了8個無性系枝皮的指紋圖譜，初步分析了化學成分和紅外圖譜的關系。發(fā)現(xiàn)8個杜仲無性系枝皮中各化學成分之間存在差異，7種主要活性成分中環(huán)烯醚萜類物質桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸和京尼平苷在不同杜仲無性系枝皮中含量均較高，環(huán)烯醚萜類具有多種生物活性[20]，因此，可對葉林模式下不同杜仲無性系枝皮中環(huán)烯醚萜類成分加以利用。Zhang等[21]發(fā)現(xiàn)杜仲枝皮中松脂醇二葡萄糖苷含量隨樹齡的增加呈而增加，故松脂醇二葡萄糖苷在老皮中含量高，新皮中含量較低。葉用林杜仲皮中標志性化合物松脂醇二葡萄糖苷平均含量相對較低，僅無性系EU1、EU4、EU7中含量大于0.1%，符合2 020版中藥藥典的要求，所以將松脂醇二葡萄糖苷作為藥用質量指標時應選擇這3個無性系杜仲枝皮加以利用。

植物特異性揮發(fā)性物質在植物信息的傳遞過程中起著重要的信號作用[22]。本研究利用植物代謝組學的策略，研究杜仲枝皮釋放揮發(fā)性物質的種類和數(shù)量，植物代謝組所得數(shù)據(jù)需對所得數(shù)據(jù)進行峰對齊、切割、濾噪等預處理，因此選擇了MS-DIAL軟件對多個樣本質譜峰進行特征峰匹配、對齊以及提取[23,24]，結合數(shù)據(jù)庫共檢測出酯類、醇類、醛類、萜類、酮類、內酯、烯類7大類70種揮發(fā)物質成分。吳婷婷等[25]發(fā)現(xiàn)在茶樹單作和花生+茶樹間作模式中，醛類和脂類化合物是茶樹總揮發(fā)物的主要組成部分，主要起著趨避害蟲和引誘天敵的作用。醇、醛、酯類是不同杜仲無性系枝皮的主要揮發(fā)化合物，可能在趨避植食性昆蟲防御中發(fā)揮著主要作用，有待進一步研究。異植物醇是由四個異戊二烯分子首尾相接而構成的雙萜類的二十碳不飽和烯叔醇，是生產維生素E的主要原料，萜類物質異植物醇在無性系EU2、EU5以及EU8中相對含量均最高，且存在四氫香葉醇、乙基芳樟醇、橙花醇和葎草烯等萜烯類揮發(fā)物，具有抗炎、抑菌和抗腫瘤等藥理[26]，這對于杜仲枝皮進一步藥用價值開發(fā)有一定的指導意義。

監(jiān)督方法是用來探索完全未知數(shù)據(jù)特征的方法，根據(jù)樣本特性對原始數(shù)據(jù)信息進行分類，將具有相似特征的目標數(shù)據(jù)歸在同源的類中，并使用相應的可視化技術直觀地表達出來，目前常見的無監(jiān)督方法有聚類分析和主成分分析等[27]。本文利用UPLC測定數(shù)據(jù)進行聚類，將杜仲8個無性系分為3個組別，主成分分析提取出3個主成分，其中在第一維度上環(huán)烯醚萜類物質京尼平苷酸、京尼平苷、桃葉珊瑚苷貢獻最大。并通過PLS-DA模型對杜仲枝皮揮發(fā)物質成分在不同無性系之間的差異作進一步分析，篩選出22種揮發(fā)性物質可將其作為差異揮發(fā)成分，主要為酯類揮發(fā)性成分。桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸等環(huán)烯醚萜類物質是葉用林杜仲枝皮中主要次生代謝物質，且其合成前體是香葉醇等單萜類物質，因此，下一步可以考慮利用GC-MS技術進行杜仲枝皮萜烯類揮發(fā)物的靶向代謝組分析。此外，杜仲在幼年期均表現(xiàn)為相同的樹皮特征，顏色呈青灰色，不開裂，皮孔顯著，沒有可以識別的形態(tài)特征[7]，后期可將傅里葉變換紅外光譜技術應用于葉用林模式下不同無性系杜仲皮的快速區(qū)分。