瑤藥尖尾楓果實活性部位篩選及其化學成分研究

鄒芷琪，于玲玲，潘爭紅*，寧德生，符毓夏，李連春

1廣西中醫(yī)藥大學藥學院，南寧 530200； 2廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所廣西植物功能物質(zhì)與資源持續(xù)利用重點實驗室，桂林 541006

尖尾楓Callicarpalongissima(Hemsl.) Merr為馬鞭草科紫珠屬植物，又名粘手風、赤藥子、穿骨風(廣西)、牛舌廣(福建)等，有祛風濕、祛瘀消腫、止血鎮(zhèn)痛之功效[1,2]，是廣西特色瑤藥“七十二風”之一，在壯、瑤等少數(shù)民族地區(qū)有廣泛應用，常以全株入藥。目前，關于尖尾楓的研究主要集中在枝葉的化學成分分離[3,4]、含量分析[5]、揮發(fā)油提取[6]及藥理活性[7，8]等方面，研究顯示其枝葉中含有豐富的萜類、苯丙素類、木脂素類、黃酮類、甾醇類及揮發(fā)油等成分，而且在抗炎、抗氧化、美白等方面具有良好的生物活性。然而對于資源量豐富的尖尾楓果實，尚未見其化學成分及生物活性報道。本課題組前期對尖尾楓果實進行了精油制備并發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗炎、美白作用[9]。為了進一步明確尖尾楓的活性部位及其物質(zhì)基礎，本實驗以尖尾楓果實為研究對象，通過NO生成抑制模型與多種抗氧化方法進行活性評價，篩選出尖尾楓果實的活性部位，并對其開展化學成分研究，研究結(jié)果將闡明尖尾楓果實抗炎、抗氧化作用的物質(zhì)基礎，為尖尾楓資源高效合理利用提供科學依據(jù)和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

LC-MS-IT-TOF液相質(zhì)譜聯(lián)用儀、LC-2030C 3D高效液相色譜儀(日本島津公司)；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱、-80 ℃超低溫冰箱(Thermo Forma公司)；全波長多功能酶標儀(Biotek公司)；倒置顯微鏡(舜宇光學科技有限公司)；紫外-可見分光光度計T6(北京普析通用儀器有限公司)；超導核磁共振波譜儀(瑞士Brucker公司)；HyClone胎牛血清(HyClone公司)；LPS、MTT、DMSO(Sigma公司)；DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司)；NO檢測試劑盒(Promege公司)；總抗氧化能力檢測試劑盒(碧云天生物技術有限公司)；2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)(麥克林生化科技有限公司)；色譜純試劑(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；氘代試劑(安諾倫(北京)生物科技有限公司)；分析純試劑(廣東光華科技股份有限公司)。

細胞株：小鼠單核巨噬細胞(RAW 264.7細胞)，購買于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

植物樣品采集于廣西桂林植物園，經(jīng)廣西植物研究所黃俞淞副研究員鑒定為植物尖尾楓Callicarpalongissima(Hemsl.) Merr的果實。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品提取

取干燥粉碎后的尖尾楓果實5.0 kg，用95%乙醇于室溫下浸提5次，每次48 h，減壓回收得到粗提物浸膏802.1 g(Fr.1)。將浸膏與水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，得到石油醚(Fr.2)、乙酸乙酯(Fr.3)、正丁醇(Fr.4)、水(Fr.5)4個部位。

1.2.2 抗氧化活性測定

1.2.2.1 DPPH法測定自由基清除能力[10]

精密稱取DPPH 9.859 mg，加無水乙醇配置成0.1 mmol/L的DPPH儲備液待用。精密稱取Vc(抗壞血酸)樣品1 mg，加甲醇配置得到濃度為0.2 g/L的標準溶液。吸取一系列濃度的待測樣品和Vc溶液于10 mL的具塞試管中，加水至2 mL，再加2 mL的DPPH儲備液，混勻后，避光反應20 min，在517 nm下測定其吸光值。以樣品濃度為橫坐標，對應的清除率為縱坐標，作回歸曲線，并計算出IC50值。以Vc作為陽性對照，實驗重復3次。

1.2.2.2 FRAP法測定總抗氧化能力

參照FRAP試劑盒方法，每孔加入FRAP工作液180 μL，5 μL待測樣品，混勻，37 ℃反應4 min后測定A593 nm。以一系列不同濃度的FeSO4標準溶液繪制標準曲線，以每1 g待測樣品相當于FeSO4的mmol數(shù)為該待測樣品的FRAP值(FeSO4mmol/g)。實驗以Vc為陽性對照，重復3次。

1.2.2.3 ABTS法測定總抗氧化能力

參照ABTS試劑盒方法，每孔加入200 μL的ABTS工作液，待測樣品10 μL，室溫下反應3 min后測定A734 nm。以一系列不同濃度的Trolox標準溶液繪制標準曲線，以TEAC(Trolox等效物抗氧化能力)來表示樣品的抗氧化活性，該值越大，其抗氧化活性越強。實驗以Vc為陽性對照，重復3次。

1.2.3 抗炎活性篩選

部位抗炎活性篩選：利用脂多糖(LPS)誘導小鼠巨噬細胞RAW 264.7作為抗炎活性篩選模型，采用Griess法來檢測NO的釋放量[11]。取對數(shù)生長期的RAW 264.7細胞接種于24孔板中，設加藥組和LPS組，各組加入終濃度為25 μg/mL的藥物和終濃度為0.2 μg/mL的LPS，經(jīng)培養(yǎng)后取其上清液，加入Griess試劑，混勻反應后于波長570 nm處測定其吸光值。

化合物抗炎活性篩選：加藥組各組加入濃度為25 μmol/L的化合物，其余步驟同“部位抗炎活性篩選”。

1.2.4 化合物的分離

Fr.3(351.5 g)經(jīng)MCI初步分離，用甲醇-水(70%→100%)進行洗脫，得到A1～A5五個組分。A1組分經(jīng)甲醇反復重結(jié)晶得到化合物1(6.6 mg)；A2組分經(jīng)硅膠柱分離，以石油醚-丙酮(50∶1→1∶1)進行洗脫，經(jīng)TLC檢測后合并得到F1～F5共5個組分。F3經(jīng)凝膠柱色譜(氯仿-甲醇1∶1)和HPLC(乙腈∶水=60∶40→70∶30，40 min，3.0 mL/min)純化得到化合物3(1.5 mg)、7(2.9 mg)、8(4.1 mg)、9(2.4 mg)；F2經(jīng)硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯(100∶1→10∶1)進行梯度洗脫，得到化合物6(24.2 mg)；A3組分經(jīng)硅膠柱，以石油醚-丙酮(20∶1→2∶1)進行梯度洗脫，再通過HPLC(乙腈∶水=60∶40，2.0 mL/min)進行進一步的分離純化，得到化合物2(3.4 mg)、4(4.8 mg)、5(3.5 mg)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 26數(shù)據(jù)分析軟件進行單因素ANOVA顯著性分析，實驗數(shù)據(jù)表示為“平均數(shù)±標準差”，P< 0.01表示有極顯著差異，有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 抗氧化實驗結(jié)果

2.1.1 DPPH自由基清除能力評價

如表1所示，尖尾楓各部位均具有一定的DPPH自由基清除能力，其中乙酸乙酯部位(Fr.3)的DPPH自由基清除能力最強。

表1 尖尾楓各部位的DPPH自由基清除能力Table 1 The DPPH radical scavenging ability of C.longissima

2.1.2 總抗氧化能力評價

FRAP、ABTS法實驗結(jié)果一致顯示(見圖1)，尖尾楓果實的乙酸乙酯萃取部位(Fr.3)的總抗氧化效果最好，總抗氧化能力分別為4.192 8(FeSO4mmol/g)、1.744 0(Trolox mmol/g)。

2.2 抗炎活性實驗

2.2.1 部位抗炎活性

尖尾楓不同部位對LPS誘導的RAW 264.7細胞NO釋放的影響結(jié)果如表2所示，與對照組相比，模型組的NO含量顯著升高(P< 0.01)；與模型組相比，濃度為25 μg/mL的粗提物及各個萃取部位均能顯著抑制NO的釋放(P< 0.01)，表現(xiàn)出一定程度上的抗炎活性，在同一質(zhì)量濃度下，乙酸乙酯部位(Fr.3)的活性最強。

圖1 尖尾楓各部位總抗氧化能力(n = 3)Fig.1 Total antioxidant capacity of C.longissima in each fraction ( n = 3)

表2 尖尾楓各部位的抗炎活性Table 2 The anti-inflammatory activity of C.longissima

2.2.2 化合物抗炎活性

從尖尾楓乙酸乙酯部位(Fr.3)分離得到的化合物1～9對LPS誘導的RAW 264.7細胞NO釋放的影響結(jié)果如表3所示，與空白對照組比較，模型組的NO含量顯著升高(P< 0.01)；與模型組比較，濃度為25 μmol/L的化合物1～9均能顯著抑制NO的釋放(P< 0.01)，表現(xiàn)出不同程度的抗炎活性，在相同濃度水平下，化合物3、4的活性強于其他化合物。

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1黃色線狀晶體；ESI-MS：m/z373.12 [M-H]-，分子式為C19H18O8；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.71(1H，d，J= 1.5 Hz，H-2′)，7.67(1H，dd，J= 8.5，1.5 Hz，H-6′)，7.05(1H，d，J= 8.5Hz，H-5′)，6.50(1H，s，H-8)，3.98(3H，s，3′-OCH3)，3.96(3H，s，7-OCH3)，3.92(3H，s，6-OCH3)，3.86(3H，s，3-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：156.1(C-2)，138.9(C-3)，179.0(C-4)，152.9(C-5)，132.5(C-6)，158.9(C-7)，90.5(C-8)，152.8(C-9)，106.7(C-10)，122.6(C-1′)，111.1(C-2′)，146.6(C-3′)，148.5(C-4′)，114.7(C-5′)，122.8(C-6′)，60.3(3-OCH3)，61.0(6-OCH3)，56.5(7-OCH3)，56.3(3′-OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻[12]報道基本一致，因此化合物1鑒定為貓眼草黃素。

表3 化合物1～9的抗炎活性篩選 s，n = 3)Table 3 Anti-inflammatory activity screening of compounds 1-9

圖2 化合物1～9的化學結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structures of compounds 1-9

化合物2黃色無定形粉末；ESI-MS：m/z345.12 [M+H]+，分子式為C18H16O7；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.73(1H，s，H-2′)，7.68(1H，d，J= 8.5 Hz，H-6′)，6.96(1H，d，J= 8.5 Hz，H-5′)，6.64(1H，s，H-8)，6.34(1H，s，H-6)，3.95(3H，s，3′-OCH3)，3.89(3H，s，7-OCH3)，3.81(3H，s，3-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：163.3(C-2)，124.7(C-3)，185.0(C-4)，160.1(C-5)，96.2(C-6)，158.7(C-7)，95.5(C-8)，151.4(C-9)，104.4(C-10)，123.5(C-1′)，113.0(C-2′)，149.5(C-3′)，148.4(C-4′)，116.2(C-5′)，110.2(C-6′)，51.3(3-OCH3)，56.5(7-OCH3)，56.1(3′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道基本一致，故化合物2鑒定為藿香黃酮醇。

化合物3無色針狀晶體；ESI-MS：m/z329.03 [M-H]-，分子式為C20H26O4；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：6.77(1H，s，H-14)，5.43(1H，dd，J= 4.0，1.5 Hz，H-7)，3.30(1H，sept，J= 6.0 Hz，H-15)，2.83(1H，m，H-1b)，2.54(1H，td，J= 13.5，4.0 Hz，H-1a)，2.18(1H，ddd，J= 14.0，5.5，4.0 Hz，H-6a)，1.94(1H，m，H-2b)，1.85(1H，ddd，J= 14.0，10.5，1.5 Hz，H-6b)，1.71(1H，dd，J= 10.5，5.5 Hz，H-5)，1.58(1H，m，H-2a)，1.49(1H，m，H-3b)，1.31(1H，td，J= 13.5，3.5 Hz，H-3a)，1.19(3H，d，J= 7.0 Hz，H-17)，1.18(3H，d，J= 7.0 Hz，H-16)，0.88(3H，s，H-18)，0.87(3H，s，H-19)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：29.9(C-1)，19.7(C-2)，41.8(C-3)，35.1(C-4)，46.3(C-5)，30.6(C-6)，78.2(C-7)，133.6(C-8)，123.1(C-9)，49.2(C-10)，144.0(C-11)，143.4(C-12)，135.1(C-13)，112.4(C-14)，27.5(C-15)，23.1(C-16)，23.1(C-17)，32.0(C-18)，20.0(C-19)，176.0(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道基本一致，故化合物3鑒定為鼠尾草酚。

化合物4白色粉末；ESI-MS：m/z347.16 [M+H]+，分子式為C20H26O5；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.85(1H，s，H-14)，4.60(1H，d，J= 3.5 Hz，H-7)，4.53(1H，d，J= 3.5 Hz，H-6)，3.24(1H，sept，J= 6.5 Hz，H-15)，2.82(1H，m，H-1b)，2.26(1H，s，H-5)，1.30(1H，m，H-3a)，1.20(3H，d，J= 6.5 Hz，H-17)，1.17(3H，d，J= 6.5 Hz，H-16)，1.02(3H，s，H-18)，0.90(3H，s，H-19)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：28.6(C-1)，20.1(C-2)，39.4(C-3)，32.5(C-4)，51.6(C-5)，79.9(C-6)，69.1(C-7)，129.4(C-8)，124.9(C-9)，48.3(C-10)，145.3(C-11)，143.3(C-12)，137.4(C-13)，120.4(C-14)，27.9(C-15)，23.0(C-16)，23.2(C-17)，31.7(C-18)，22.3(C-19)，180.9(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道基本一致，故化合物4鑒定為迷迭香酚。

化合物5白色粉末；ESI-MS：m/z361.21 [M+H]+，分子式為C21H28O5；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.76(1H，s，H-14)，4.80(1H，d，J= 3.0 Hz，H-6)，4.27(1H，d，J= 3.0 Hz，H-7)，3.65(3H，s，7-OCH3)，3.21(1H，sept，J= 6.5 Hz，H-15)，2.17(1H，s，H-5)，1.96(1H，td，J= 14.0，5.5 Hz，H-1a)，1.60(1H，m，H-2a)，1.24(1H，m，H-3a)，1.21(3H，d，J= 7.0 Hz，H-17)，1.19(3H，d，J= 7.0 Hz，H-16)，0.92(3H，s，H-19)，0.89(3H，s，H-18)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：28.6(C-1)，20.2(C-2)，39.4(C-3)，32.4(C-4)，52.3(C-5)，76.1(C-6)，78.9(C-7)，127.7(C-8)，125.1(C-9)，48.8(C-10)，145.3(C-11)，143.7(C-12)，137.4(C-13)，120.9(C-14)，27.9(C-15)，22.9(C-16)，23.1(C-17)，22.4(C-18)，32.0(C-19)，180.9(C-20)，58.6(7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道基本一致，故化合物5鑒定為7-甲氧基迷迭香酚。

化合物6無色晶體；ESI-MS：m/z397.20 [M+Na]+，分子式為C22H30O5；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.78(1H，s，H-14)，6.06(1H，s，11-OH)，5.51(1H，s，12-OH)，4.66(1H，d，J= 3.5 Hz，H-6)，4.36(1H，d，J= 3.5 Hz，H-7)，3.86(2H，m，H-21)，3.18(1H，br d，J= 13.5 Hz，H-1a)，3.06(1H，sept，J= 7.0 Hz，H-15)，2.28(1H，s，H-5)，1.99(1H，td，J= 13.5，5.5 Hz，H-1b)，1.68(1H，m，H-2a)，1.56(1H，m，H-2b)，1.46(1H，m，H-3a)，1.33(3H，t，J= 7.0 Hz，H-22)，1.23(3H，d，J= 7.0 Hz，H-17)，1.21(3H，d，J= 7.0 Hz，H-16)，1.19(1H，m，H-3b)，1.01(3H，s，H-18)，0.92(3H，s，H-19)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：27.4(C-1)，19.0(C-2)，38.0(C-3)，31.4(C-4)，50.9(C-5)，75.3(C-6)，75.8(C-7)，126.8(C-8)，124.4(C-9)，47.0(C-10)，142.3(C-11)，141.7(C-12)，134.6(C-13)，120.7(C-14)，27.5(C-15)，22.2(C-16)，22.4(C-17)，31.4(C-18)，22.1(C-19)，178.9(C-20)，66.3(C-21)，15.8(C-22)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道基本一致，故化合物6鑒定為7-乙氧基迷迭香酚。

化合物7白色粉末；ESI-MS：m/z347.31 [M+H]+，分子式為C21H30O4；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.51(1H，s，H-14)，3.73(3H，s，11-OCH3)，3.53(1H，br d，J= 13.5 Hz，H-1b)，3.16(1H，sept，J= 7.0 Hz，H-15)，2.83(2H，m，H-7)，2.28(1H，m，H-5)，1.82(1H，m，H-1a)，1.22(3H，d，J= 7.5 Hz，H-17)，1.20(3H，d，J= 7.5 Hz，H-16)，0.97(3H，s，H-18)，0.86(3H，s，H-19)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：32.1(C-1)，20.1(C-2)，41.6(C-3)，34.0(C-4)，61.8(C-5)，20.1(C-6)，34.2(C-7)，134.7(C-8)，125.6(C-9)，47.8(C-10)，142.4(C-11)，139.6(C-12)，118.2(C-13)，26.6(C-14)，24.0(C-16)，23.6(C-17)，32.9(C-18)，18.6(C-19)，181.8(C-20)，54.4(11-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道基本一致，故化合物7鑒定為carnosic acid-11-methylether。

化合物8白色粉末；ESI-MS：m/z343.21 [M-H]-，分子式為C20H24O5；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：9.76(1H，s，H-7)，9.66(1H，s，H-6)，7.40(1H，s，H-14)，4.09(1H，s，H-5)，3.34(1H，sept，J= 7.0 Hz，H-15)，2.27(1H，td，J= 13.5，4.0 Hz，H-1a)，2.10(1H，m，H-2a)，1.89(1H，m，H-3a)，1.70(1H，m，H-1b)，1.61(1H，m，H-3b)，1.56(1H，m，H-2b)，1.50(3H，s，H-18)，1.28(3H，s，H-19)，1.28(3H，d，J= 7.0 Hz，H-17)，1.27(3H，d，J= 7.0 Hz，H-16)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：31.6(C-1)，16.7(C-2)，40.3(C-3)，34.0(C-4)，61.2(C-5)，201.1(C-6)，192.0(C-7)，124.1(C-8)，136.0(C-9)，48.3(C-10)，142.6(C-11)，141.2(C-12)，131.7(C-13)，131.3(C-14)，27.1(C-15)，22.2(C-16)，22.3(C-17)，33.4(C-18)，23.9(C-19)，177.1(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道基本一致，故化合物8鑒定為迷迭香雙醛。

化合物9白色粉末；ESI-MS：m/z317.79 [M+H]+，分子式為C20H28O3；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.59(1H，s，H-14)，4.67(1H，dd，J= 3.5，1.5 Hz，H-7)，4.32(1H，dd，J= 16.0，8.5 Hz，H-20a)，3.25(1H，sept，J= 7.0 Hz，H-15)，3.02(1H，dd，J= 8.5，1.5 Hz，H-20b)，2.74(1H，td，J= 14.0，4.5 Hz，H-1a)，1.43(1H，m，H-5)，1.29(1H，m，H-3b)，1.21(3H，d，J= 7.0 Hz，H-17)，1.20(3H，d，J= 7.0 Hz，H-16)，1.14(3H，s，H-19)，0.86(3H，s，H-18)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：38.9(C-1)，20.1(C-2)，42.5(C-3)，34.9(C-4)，44.7(C-5)，31.4(C-6)，72.7(C-7)，134.8(C-8)，129.7(C-9)，41.1(C-10)，141.9(C-11)，143.5(C-12)，133.9(C-13)，112.9(C-14)，27.9(C-15)，23.4(C-16)，23.3(C-17)，33.5(C-18)，21.6(C-19)，69.9(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道基本一致，故化合物9鑒定為20-去氧鼠尾草酚。化合物1～9的結(jié)構(gòu)見圖2。

3 討論與結(jié)論

本實驗通過多種模型篩選出尖尾楓果實抗氧化、抗炎活性的最佳部位——乙酸乙酯部位，并從中分離鑒定出一系列二萜酚成分。通過抗炎活性結(jié)果與結(jié)構(gòu)關系分析發(fā)現(xiàn)，二萜酚類化合物中的鄰二酚羥基(C-11和C-12)是其抗炎活性的關鍵基團；C-7上的羥基若被甲氧基或乙氧基取代(化合物5、6)，抗炎活性顯著降低；另外，若C-20與C-6或C-7形成含氧環(huán)，抗炎活性提高。

鼠尾草酚(3)、迷迭香酚(4)是尖尾楓乙酸乙酯部位的主要活性成分。研究表明，鼠尾草酚、迷迭香酚不僅抗氧化活性顯著[20]，而且可通過抑制MAPK、NF-kB、STAT3等信號通路，抑制iNOS、COX-2的表達，緩解炎癥損傷[21,22]。新近，我們在抗類風濕性關節(jié)炎(RA)研究中發(fā)現(xiàn)，從尖尾楓枝葉中獲得的鼠尾草酚、迷迭香酚具有協(xié)同增效作用，它們通過阻斷TLR4/NF-kB/MAPK通路，抑制炎癥反應，改善RA[23]，提示鼠尾草酚、迷迭香酚抗炎活性好，具備開發(fā)治療RA新藥的潛力。因此，通過本實驗，進一步闡明了尖尾楓果實抗氧化、抗炎活性部位及其物質(zhì)基礎，這將為尖尾楓資源綜合開發(fā)利用提供科學依據(jù)。