α-倒捻子素通過激活ROS/p38 MAPK/Bax級聯(lián)反應誘導B淋巴瘤Ramos細胞凋亡的機制研究

蔡紫微，孫毅松，汪 林， 廖玉嬌，余 歡，黃 敏，李潤滋，李敏惠

1成都醫(yī)學院基礎醫(yī)學院；2成都醫(yī)學院生物科學與技術學院；3成都醫(yī)學院藥學院； 4成都醫(yī)學院科研實驗中心，成都 610500

B淋巴瘤(B lymphoma)是血液系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，化療是B淋巴瘤的主要治療手段，臨床常用藥物包括環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿等?；熌苡行Ц纳屏馨土龌颊叩纳媛始邦A后，但仍存在高毒性、高副作用和易耐藥等缺點[1,2]。從天然產物中尋找安全低毒的有效藥物是抗腫瘤領域的研究熱點。研究學者們從植物來源的中藥中分離并鑒定具有抗淋巴瘤活性的天然化合物，同時探究其分子作用機制，如從紅豆蔻、黃芩中分離得到黃酮類化合物楊梅素和黃芩素，經(jīng)驗證二者分別通過靶向bruton tyrosine kinase(BTK)及PI3K/AKT信號通路發(fā)揮抗淋巴瘤作用[3]。莽吉柿(GarciniamangostanaL.)俗稱山竹、倒捻子等，素有"水果皇后"的美譽。山竹果殼含有黃酮類化合物、呫噸酮類化合物、花色苷、原花青素等活性成分，在某些東南亞地區(qū)常作為傳統(tǒng)藥物用于治療腹瀉、痢疾、感染等疾病[4,5]。α-倒捻子素(α-mangostin，α-Ma)是一種氧雜蒽酮類化合物，具有多種生物學活性，是山竹果殼主要活性成分之一。研究顯示，α-Ma具有潛在抗癌性能，對胃癌、乳腺癌、肝癌、膠質母細胞瘤等均表現(xiàn)出抑制活性[6]。然而，α-Ma對B淋巴瘤的增殖抑制作用及其分子作用機制尚未見報道?；诖?，本研究以人B淋巴瘤Ramos細胞為研究對象，觀察α-Ma對Ramos細胞增殖、凋亡的影響，旨在探討α-Ma對B淋巴瘤的增殖抑制作用及其潛在分子作用機制，為α-Ma的抗腫瘤活性提供新見解，為基于α-Ma的類似物改造及臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥物

α-倒捻子素(Cat.No.A0406，純度≥98%)購自成都曼思特生物科技公司，化學結構和分子式見圖1。

圖1 α-Ma的化學結構Fig.1 Chemical structure of α-Ma

1.2 主要試劑

胎牛血清(Cat.No.10100147)、RPMI-1640基礎培養(yǎng)基(Cat.No.72400047)購自美國Gibco公司；CCK-8檢測試劑盒(Cat.No.CK04)購自日本同仁化學研究所；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(Cat.No.C1062L)、線粒體膜電位檢測試劑盒(Cat.No.C2006)、ROS檢測試劑盒(Cat.No.S0033M)、RIPA強效裂解液(Cat.No.P0013B)購自上海碧云天生物技術有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(Cat.No.BL521A)購自中國白鯊(Biosharp)科技有限公司；ECL發(fā)光液(Cat.No.WBULS0500)購自美國Millipore公司；caspase-9(Cat.No.9502)、cleaved caspase-9(Cat.No.9505)、caspase-3(Cat.No.9662)、cleaved caspase-3(Cat.No.9664)、cleaved PARP(Cat.No.5625)、Bim(Cat.No.2933)、Bax(Cat.No.5023)、p-p38 MAPK(Cat.No.4511)、GAPDH(Cat.No.5174)、偶聯(lián)辣根過氧化物酶的anti-rabbit IgG(Cat.No.7074)購自美國CST公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

人B淋巴瘤Ramos細胞(成都醫(yī)學院鄒強教授饋贈)，保存于成都醫(yī)學院科研實驗中心，其STR鑒定結果與ATCC一致。根據(jù)ATCC推薦的培養(yǎng)方法，用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。

1.4 細胞增殖抑制實驗

Ramos細胞以2×104個/孔的密度接種在96孔細胞培養(yǎng)板中；加入供試的α-Ma，藥物作用濃度分別為0、7.5、10、15、20、30、40 μmol/L，每個濃度設置三個復孔，同時設置空白孔；藥物作用24 h和48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑；孵育2～4 h后，用酶標儀(BioTek Powerwave XS，美國)檢測450 nm處的OD值。按照以下公式計算相應藥物濃度下細胞的抑制率。通過GraphPad Prism 9.0軟件繪制細胞生長抑制曲線，并計算α-Ma對Ramos細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.5 活性氧檢測

Ramos細胞以6×105個/孔的密度接種在6孔細胞培養(yǎng)板中；加入α-Ma(0、10、15、20 μmol/L)處理12 h后，收集細胞并用DCFH-DA熒光探針37 ℃避光染色20 min；磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)離心洗滌兩次，使用流式細胞儀(ACEA NovoCyte，美國)檢測DCF熒光并分析細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平。

1.6 細胞凋亡檢測

α-Ma(0、10、15、20 μmol/L)作用Ramos細胞24 h后，于倒置顯微鏡20×物鏡下(Olympus，日本)觀察Ramos細胞的形態(tài)變化；觀察到細胞有明顯凋亡樣形態(tài)改變后，離心收集所有細胞，用含Annexin V-FITC/PI兩種熒光染料的結合液重懸細胞，避光染色20 min；流式細胞儀檢測并分析細胞凋亡情況。

1.7 線粒體膜電位檢測

α-Ma處理Ramos細胞24 h后，離心收集細胞；用含有JC-1熒光探針的染色液重懸細胞，37 ℃避光染色20 min；離心洗滌兩次，PBS重懸，用流式細胞儀采集染色后的細胞并分析線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的改變情況。

1.8 蛋白免疫印跡

α-Ma處理Ramos細胞24 h后，用RIPA強效裂解液(已加蛋白酶及磷酸酶抑制劑)裂解細胞，4 ℃離心收集蛋白上清，通過BCA法測定蛋白濃度；采用蛋白免疫印跡技術(Western blot，WB)分析細胞凋亡相關信號通路蛋白caspase-3/-9、cleaved caspase-3/-9、cleaved PARP、Bim、Bax、p-p38 MAPK的表達情況。以GAPDH為內參，用Image Lab軟件(美國Bio-Rad公司)分析結果。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 實驗結果

2.1 α-Ma抑制Ramos細胞增殖

α-Ma作用Ramos細胞24 h和48 h后，通過CCK-8法檢測細胞活力；利用GraphPad Prism 9.0軟件繪制細胞生長抑制曲線，并計算α-Ma對Ramos細胞的IC50值。結果發(fā)現(xiàn)，α-Ma以藥物濃度依賴和時間依賴的方式抑制Ramos細胞增殖，其24 h和48 h的IC50值分別為14.84 μmol/L和8.087 μmol/L(見圖2)。

圖2 α-Ma對B淋巴瘤Ramos細胞的生長抑制作用Fig.2 Growth inhibitory effect of α-Ma on B lymphoma Ramos cells

2.2 α-Ma誘導 Ramos細胞內活性氧水平增加

α-Ma(0、10、15、20 μmol/L)作用Ramos細胞12 h后，利用流式細胞儀檢測經(jīng)DCFH-DA熒光探針染色的細胞，結果發(fā)現(xiàn)Ramos細胞內ROS水平以α-Ma濃度依賴的方式增加，分別為(2.05±0.26)%、(6.38±0.05)%、(13.20±0.14)%、(20.71±0.5)%，和0 μmol/Lα-Ma組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(見圖3)。

2.3 α-Ma誘導Ramos細胞凋亡

α-Ma作用Ramos細胞24 h后，采用倒置顯微鏡觀察Ramos細胞形態(tài)的變化。結果發(fā)現(xiàn)，α-Ma誘導Ramos細胞形態(tài)發(fā)生典型的凋亡樣改變，0 μmol/Lα-Ma組Ramos細胞形態(tài)分明，飽滿透亮，15 μmol/Lα-Ma組Ramos細胞胞體收縮、出泡，細胞拉長出現(xiàn)釘狀突起，部分細胞細胞膜破裂，細胞溶解(見圖4)。

細胞凋亡是細胞程序性死亡的方式之一。α-Ma(0、10、15、20 μmol/L)作用Ramos細胞24 h后，對細胞進行Annexin V-FITC/PI雙染，流式細胞儀檢測分析發(fā)現(xiàn)位于Q4-2區(qū)(表示晚期凋亡細胞)和Q4-4區(qū)(表示早期凋亡細胞)的總凋亡細胞比例分別為(5.92±0.25)%、(12.58±1)%、(42.84±2.05)%、(71.9±1.78)%，和0 μmol/Lα-Ma組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(見圖5A)。同時，WB結果顯示α-Ma下調caspase-3/-9的表達，上調cleaved caspase-3/-9和cleaved PARP的表達，差異具有統(tǒng)計學意義(見圖5C)。結果提示α-Ma可誘導Ramos細胞凋亡。

圖3 α-Ma對B淋巴瘤Ramos細胞內ROS水平的影響Fig.3 Effect of α-Ma on intracellular ROS level in B lymphoma Ramos cells注：A：流式細胞儀檢測并分析5 000個經(jīng)DCFH-DA染色的Ramos細胞；B：和0 μmol/L α-Ma組比較， **P<0.01。Note:A:Analysis of 5 000 DCFH-DA-stained Ramos cells by flow cytometry.B:Compared with 0 μmol/L α-Ma group,**P<0.01.

圖4 α-Ma作用后Ramos細胞形態(tài)學成像Fig.4 Morphological imaging of Ramos cells induced by α-Ma

圖5 α-Ma對B淋巴瘤Ramos細胞的凋亡誘導效應Fig.5 Apoptosis-inducing effect of α-Ma on B lymphoma Ramos cells注：A：流式細胞儀檢測并分析5 000個經(jīng)Annexin V-FITC/PI雙染的Ramos細胞；C：WB檢測α-Ma對Ramos細胞凋亡相關蛋白表達的影響；B和D：和0 μmol/L α-Ma組比較， *P<0.05，***P<0.001。Note:A:5 000 Ramos cells double-stained with Annexin V-FITC/PI was detected by flow cytometry;C:The effect of α-Ma on apoptosis-related protein expression of Ramos cells was detected by WB;B and D:Compared with 0 μmol/L α-Ma group,*P<0.05,***P<0.001.

2.4 線粒體途徑參與α-Ma誘導Ramos細胞凋亡

MMP的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件，JC-1熒光探針從紅色熒光到綠色熒光的轉變可以反映細胞MMP的改變。使用流式細胞儀檢測JC-1染色后的Ramos細胞，結果發(fā)現(xiàn)，α-Ma(0、10、15、20 μmol/L)誘導細胞MMP分別降低(4.17±0.49)%、(44.02±2.5)%、(69.76±3.50)%、(92.64±3)%，和0 μmol/Lα-Ma組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(見圖6A)。同時，通過WB檢測線粒體途徑相關蛋白的表達發(fā)現(xiàn)，α-Ma誘導促凋亡蛋白Bim、Bax表達增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖6C)。提示線粒體途徑參與α-Ma誘導Ramos細胞凋亡。

圖6 α-Ma通過線粒體途徑誘導B淋巴瘤Ramos細胞凋亡Fig.6 α-Ma induces apoptosis in B lymphoma Ramos cells via the mitochondrial pathway注：A：流式細胞儀檢測分析5 000個JC-1熒光染色的Ramos細胞；C：WB檢測α-Ma對Ramos細胞線粒體途徑相關蛋白表達的影響；B和D：和0 μmol/L α-Ma組比較， *P<0.05，***P<0.001。Note:A:5 000 Ramos cells stained with JC-1 fluorescent probe were detected and analyzed by flow cytometry;C:The effect of α-Ma on the expression of mitochondrial pathway-related proteins in Ramos cells was detected by WB;B and D:Compared with 0 μmol/L α-Ma group,*P<0.05,***P<0.001.

2.5 p38 MAPK參與α-Ma對Ramos細胞的凋亡誘導過程

p38 MAPK參與細胞多種生理和病理過程，包括細胞凋亡、細胞應激、細胞周期和機體的炎癥反應等。通過WB檢測發(fā)現(xiàn)α-Ma能誘導p38 MAPK活化，即上調p-p38 MAPK的表達，和0 μmol/Lα-Ma組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(見圖7)。研究結果提示p38 MAPK參與α-Ma對Ramos細胞的凋亡誘導過程。

圖7 α-Ma對B淋巴瘤Ramos細胞p38 MAPK的影響Fig.7 Effect of α-Ma on p38 MAPK in B lymphoma Ramos cells注：A：WB檢測α-Ma對Ramos細胞p38 MAPK表達的影響；B：和0 μmol/L α-Ma組相比， *P<0.05。Note:A:The effect of α-Ma on the expression of p38 MAPK in Ramos cells was detected by WB.B:Compared with 0 μmol/L α-Ma group,*P<0.05.

3 討論與結論

從天然產物中分離提取的未經(jīng)修飾的化合物有著多靶點、安全性高、廣泛易得等優(yōu)點，在治療腫瘤方面展示出良好的優(yōu)勢[7,8]。據(jù)統(tǒng)計，現(xiàn)有抗腫瘤藥物中約60%是天然產物或來源于天然產物，如紫杉醇、長春新堿[9]。α-Ma來源于天然產物山竹，已被報道通過多種機制發(fā)揮抗腫瘤作用。α-Ma通過JNK和AKT通路誘導軟骨肉瘤細胞凋亡[10]；通過ERK和p38通路誘導口腔癌細胞凋亡[11]；通過JNK和p38通路抑制乳腺癌增殖[12]；通過自噬促進胃癌細胞的化學敏感性[13]等。在本項研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)了α-Ma對B淋巴瘤Ramos細胞的增殖抑制作用，α-Ma以藥物濃度依賴和時間依賴的方式抑制淋巴瘤Ramos細胞增殖。

ROS水平過高，可引起機體DNA氧化損傷和蛋白質的表達異常，進而誘導細胞凋亡。p38 MAPK是MAPK家族中的重要成員，p38 MAPK的活化在多種抗腫瘤藥物誘導癌細胞凋亡的過程發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，ROS可以磷酸化激活p38 MAPK，進而誘導Bcl-2家族成員Bax從細胞質轉位到線粒體外膜[14,15]。Bax轉位至線粒體膜可擴大通透性孔道，改變線粒體內外室的質子梯度，降低線粒體跨膜電位，釋放促凋亡物質(如AIF和Cyt-c)。Cyt-c釋放到細胞質后，與凋亡酶激活因子(Apaf-1)相互作用，并在ATP和dATP的協(xié)助下形成凋亡復合體，凋亡復合體招募并激活pro-caspase-9，活化的caspase-9進一步激活caspase-3/7，啟動caspase級聯(lián)反應，切割PARP等底物，最終誘導細胞凋亡[16]。Bim作為Bcl-2家族另一成員，通過直接結合或競爭結合兩種方式促進Bax的活化[17]。我們的研究結果發(fā)現(xiàn)α-Ma能增加Ramos細胞內ROS水平，降低MMP，同時能上調p-p38、Bax、Bim的表達，活化caspase-3/9和PARP，誘導Ramos細胞凋亡。

根據(jù)以上結果，我們推測α-Ma抑制淋巴瘤Ramos細胞增殖的可能機制是α-Ma活化ROS/p38 MAPK/Bax級聯(lián)反應誘導B淋巴瘤細胞凋亡。研究闡述了α-Ma的抗B淋巴瘤活性及其可能機制，為以α-Ma為基礎的抗腫瘤藥物的研發(fā)提供新思路。