膠原蛋白肽對男性頭發(fā)質(zhì)量及HaCaT細(xì)胞增殖的影響

劉利格，閆 征，宋 萃，李志國，劉愛青，王海燕

（1.北京盛美諾生物技術(shù)有限公司，北京 100062；2.北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院食品技術(shù)系，北京 100176）

膠原蛋白肽（collagen peptide）直接影響皮膚細(xì)胞代謝，可促進(jìn)胞外基質(zhì)蛋白如成纖維蛋白、彈性蛋白和糖蛋白的合成，并通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增強(qiáng)皮膚逆轉(zhuǎn)，對于改善皮膚健康具有積極影響[1，2]。頭發(fā)同為皮膚的附屬器，目前多數(shù)研究注重關(guān)注外部局部應(yīng)用膠原蛋白產(chǎn)品對頭發(fā)產(chǎn)生的影響，而對口服膠原蛋白肽對頭發(fā)的影響缺乏系統(tǒng)研究。一項(xiàng)研究報道灌胃和皮膚涂抹膠原蛋白肽的小鼠，血液和皮膚中的羥脯氨酸含量接近，兩種補(bǔ)充方式均利于促進(jìn)小鼠毛發(fā)生長，提高毛發(fā)質(zhì)量，使毛發(fā)更光滑更有光澤[3]。同樣，一項(xiàng)交叉研究也表明膠原蛋白肽能夠改善頭發(fā)干枯，提升頭發(fā)色澤[4]。毛發(fā)的循環(huán)和毛囊再生是表皮與真皮層之間多種信號分子參與的過程，是多種細(xì)胞因子等生物活性蛋白相互作用的過程，生長因子是參與調(diào)控毛發(fā)生長循環(huán)啟動和停止的關(guān)鍵分子[5]。人永生化表皮細(xì)胞屬于成人表皮細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞）自發(fā)轉(zhuǎn)化而來的細(xì)胞系，與人體正常的角質(zhì)形成細(xì)胞有相同的增殖、分化特性和遺傳穩(wěn)定性[6]。體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞分泌的表皮生長因子（EGF）能促進(jìn)角阮細(xì)胞的遷移和增殖，促進(jìn)毛囊和汗腺細(xì)胞的增殖，正常水平的EGF生能刺激表皮基底層和外毛根鞘的生理性生長[7]。因此研究者常利用HaCaT細(xì)胞來進(jìn)行毛發(fā)再生的體外功效研究。本研究旨在分析口服膠原蛋白肽對男性頭發(fā)直徑和脫落根數(shù)的影響，并初步研究了膠原蛋白肽對HaCaT細(xì)胞增殖和EGF合成的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取47名男性受試者為本研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡30～40歲；中輕度脫發(fā)者；Hamilton分級為Ⅰ～Ⅳ型；無基礎(chǔ)疾??；試驗(yàn)前1個月無其他相關(guān)用藥史；未參加其他臨床試驗(yàn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：受試物及相關(guān)物過敏者。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為試驗(yàn)組26名和安慰劑組21名。試驗(yàn)組年齡30～40歲，平均年齡（35.12±3.61）歲。安慰劑組年齡30～40歲，平均年齡（34.38±3.32）歲。兩組年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），研究可比。本研究所有受試者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)方法 兩組受試者分別給予膠原蛋白肽（安徽盛美諾生物技術(shù)有限公司）6 g和麥芽糊精（山東西王糖業(yè)有限公司）6 g，按要求溶于水，分早晚2次服用，連續(xù)服用5個月。分別在第1周末和第1、2、3、4、5月末對受試者進(jìn)行電話隨訪，研究其對產(chǎn)品的依從性和耐受性。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 使用完全培養(yǎng)基（10%FBS+RPMI-1640+雙抗）在10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞，待細(xì)胞密度增殖至90%時進(jìn)行傳代；0.25%胰酶室溫消化，將計(jì)數(shù)后的細(xì)胞按照（1～2）×105密度接種至新的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 觀察指標(biāo) 比較兩組頭發(fā)直徑、頭發(fā)脫離根數(shù)、不同型號膠原蛋白肽對HaCaT細(xì)胞增殖的影響。

1.3.1 頭發(fā)直徑 從每位受試者左顳側(cè)區(qū)域選取20根剪取近頭皮處頭發(fā)1段約1 cm，測量頭發(fā)直徑。

1.3.2 頭發(fā)脫離根數(shù) 在服用前1周和服用后1周，按要求1周內(nèi)洗頭2次，洗頭后第2天進(jìn)行梳發(fā)試驗(yàn)（由前向后梳30次，記錄脫落頭發(fā)根數(shù)，取兩次均值即為頭發(fā)脫落根數(shù)）[8]。

1.3.3 不同型號膠原蛋白肽對HaCaT細(xì)胞增殖的影響 按2×104/ml細(xì)胞數(shù)鋪至六孔板中，密度約70%；加入不同濃度膠原蛋白肽：CP-01（魚來源膠原蛋白肽，平均分質(zhì)量約500 Da，產(chǎn)品型號CP-01，盛美諾）、CF-1000（魚來源膠原蛋白肽，平均分質(zhì)量約1000 Da，產(chǎn)品型號CF-1000-S-02，盛美諾）、CF-2000（魚來源膠原蛋白肽，平均分質(zhì)量約2000 Da，產(chǎn)品型號CF-2000-S-02，盛美諾）溶液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)12 h；CCK8檢測細(xì)胞活力，蛋白提取和Western blotting。

1.3.4 細(xì)胞因子EGF的表達(dá)將多肽處理后細(xì)胞和對照孔細(xì)胞加入0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞，加入200 μl RIPA細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，離心后取上清作為待測樣品。BCA法蛋白定量，調(diào)整蛋白濃度，加入5×還原樣品緩沖液后樣品終濃度為1 mg/ml，煮沸變性后用10%分離膠和5%濃縮膠分離轉(zhuǎn)膜，山羊抗鼠、兔抗體檢測EGF。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用OriginPro 8統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析和作圖，計(jì)量資料以（±s）表示，行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組頭發(fā)直徑比較 試驗(yàn)組服用后頭發(fā)直徑大于安慰劑組（P＜0.05），見表1。

表1 兩組頭發(fā)直徑比較（ ，μm）

2.2 兩組頭發(fā)脫落根數(shù)比較 試驗(yàn)組服用后頭發(fā)脫落根數(shù)少于安慰劑組（P＜0.05），見表2。

表2 兩組頭發(fā)脫落根數(shù)比較（ ，根）

2.3 膠原蛋白肽對HaCaT細(xì)胞活力及EGF合成的影響 膠原蛋白肽CP-01對HaCaT細(xì)胞具有增殖作用，濃度為25 mg/ml時效果最佳，見圖1。對比其他型號膠原蛋白肽對HaCaT細(xì)胞增殖活性，膠原蛋白肽CP-01（魚來源平均分子量約500 Da）、CF-1000（魚來源平均分子量約1000 Da）和CF-2000（魚來源平均分子量約2000 Da）對HaCaT細(xì)胞增殖提高的最適濃度分別為25.0μg/ml、25.0μg/ml和100μg/ml，見表3。

表3 不同濃度膠原蛋白肽對HaCaT細(xì)胞活力的影響（%）

圖1 不同濃度的膠原蛋白肽對HaCaT細(xì)胞活力的影響

2.4 細(xì)胞因子EGF的表達(dá) 以 β-actin作為內(nèi)參，Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，添加不同濃度的三種膠原蛋白肽，EGF相對灰度均有不同程度地增加，即各膠原蛋白肽對HaCaT細(xì)胞中EGF表達(dá)均具有一定上調(diào)作用，其中CP-01在較低濃度6.25 μg/ml和12.5 μg/ml兩個濃度時，EGF的相對灰度較大；CF-1000在25 μg/ml時EGF相對灰度較大；CF-2000在100 μg/ml時相對灰度最大，見圖2。不同膠原蛋白肽對HaCaT細(xì)胞及其合成EGF水平的促進(jìn)作用可能與分子量有關(guān)。

圖2 CP-01、CF-1000及CF-2000對HaCaT細(xì)胞中EGF表達(dá)的影響

3 討論

膠原蛋白中存在能引起機(jī)體生物學(xué)效應(yīng)的活性肽，如抗氧化肽、抗菌肽、生長因子肽、免疫因子肽等。膠原蛋白肽是通過限制酶切技術(shù)產(chǎn)生的活性肽，分子量遠(yuǎn)小于蛋白質(zhì)，易溶解、低粘度、抗凝膠形成，在體內(nèi)以多肽形式被吸收轉(zhuǎn)運(yùn)至靶器官，生物利用率高，具有營養(yǎng)強(qiáng)化作用。不同的酶切技術(shù)，得到的膠原肽生物學(xué)活性存在差異。脫發(fā)和頭發(fā)生長出現(xiàn)問題的原因主要包括油脂分泌過多、頭皮屑增加、頭皮炎癥等頭皮微生態(tài)失衡，以及毛囊生長受到抑制等問題，改善這些問題就有可能在一定程度上改善脫發(fā)和頭發(fā)生長問題[9]。膠原蛋白肽改善皮膚水油平衡、皮膚炎癥，可為頭發(fā)生長提供較好的微環(huán)境。膠原蛋白肽干預(yù)可改善老化皮膚膠原蛋白斷裂，使皮膚分層明顯，膠原纖維和附屬器排列更為整齊，使真皮膠原厚度增加，抑制表皮局部增厚[10]。毛囊周期性生長，毛發(fā)周期性脫落，是由上皮細(xì)胞和下面的真皮細(xì)胞相互作用、激素調(diào)節(jié)等影響的結(jié)果[11]。本研究采用隨機(jī)雙盲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證膠原蛋白肽對頭發(fā)質(zhì)量的改善作用，并通過體外細(xì)胞培養(yǎng)初步探討了膠原蛋白肽對表皮細(xì)胞細(xì)胞的增殖作用。

本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組服用后頭發(fā)直徑大于安慰劑組（P＜0.05）；試驗(yàn)組服用后頭發(fā)脫落根數(shù)少于少于安慰劑組（P＜0.05），表明服用盛美諾CP-01膠原蛋白肽與安慰劑相比，能夠增加頭發(fā)的直徑，減少頭發(fā)脫落根數(shù)。HaCaT細(xì)胞是人類永生表皮細(xì)胞系，也稱為表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，是非種類來源的正常人皮膚永生角質(zhì)形成的細(xì)胞株，與正常人角質(zhì)形成細(xì)胞分化相似，被廣泛用來研究角質(zhì)細(xì)胞。角質(zhì)細(xì)胞屬于上皮細(xì)胞系。在脫發(fā)及生發(fā)研究中HaCaT細(xì)胞用來代替毛囊角質(zhì)細(xì)胞、毛囊上皮細(xì)胞，通過體外試驗(yàn)研究受試物對毛囊上角質(zhì)細(xì)胞、毛囊上皮細(xì)胞的影響[12]。體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞分泌的EGF能促進(jìn)角阮細(xì)胞的遷移和增殖，促進(jìn)毛囊和汗腺細(xì)胞的增殖，正常水平的EGF能刺激表皮基底層和外毛根鞘的生理性生長。EGF在皮膚中廣泛表達(dá)，其對毛囊發(fā)育和生長調(diào)節(jié)有重要作用。EGF具有調(diào)控毛囊分化和細(xì)胞特異性的功能，毛發(fā)生長的啟動需要EGF受體的激活[13]。此外，EGF還能促進(jìn)毛囊外根鞘細(xì)胞的生長和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞群分化成外根鞘表型[14，15]。另有研究表明[16]，膠原蛋白肽能夠改善血液微循環(huán)，改善皮膚（頭皮）及其附屬器營養(yǎng)。夠在本研究中，膠原蛋白肽能夠促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖，且EGF合成增強(qiáng)，CP-01相較于其他同樣來源的膠原蛋白肽效果更明顯。

綜上所述，膠原蛋白肽能夠使頭發(fā)變粗，減少頭發(fā)脫落。這可能與膠原蛋白肽促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖增強(qiáng)EGF合成有關(guān)。