電化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)研究進(jìn)展

唐艷

（桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，廣西 桂林，541199）

電化學(xué)發(fā)光（Electrochemiluminescence，ECL）又被成為電致化學(xué)發(fā)光，是將電化學(xué)與化學(xué)發(fā)光結(jié)合的技術(shù)，是化學(xué)發(fā)光的一門分支學(xué)科[1]。化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)發(fā)展較快，特異性較強(qiáng)，靈敏度高，線性范圍寬，操作簡單，檢測時(shí)間短，易于實(shí)現(xiàn)自動化等優(yōu)點(diǎn)[2]。本文通過綜述電化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)，報(bào)道如下。

1. 化學(xué)發(fā)光劑

標(biāo)記用的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)可滿足以下條件：①能進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；②偶聯(lián)抗體或抗原后可轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定試劑；③偶聯(lián)后仍然保留高的反應(yīng)動力和量子產(chǎn)率；④應(yīng)不影響或極少影響被標(biāo)記物的理化性質(zhì)，尤其是免疫靈敏度。常見的化學(xué)發(fā)光劑如下[3]。吖啶酯類發(fā)光物質(zhì)：該類發(fā)光物質(zhì)是一種具有三環(huán)結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物，具有一定氧化能力，氧化過程無需催化劑。咋堿性環(huán)境中氧化，分子中共價(jià)鍵發(fā)生斷裂，形成一個(gè)二氧酮中間體，產(chǎn)生電激發(fā)的N- 甲基吖啶酮，N-甲基吖啶酮返回到基態(tài)時(shí)，于430nm 處發(fā)射光子[4]。魯米諾類發(fā)光物質(zhì)：魯米諾及異魯米諾可在6-氨基進(jìn)行烷基取代，制得各種衍生物，其中氨丁基乙基異魯米諾、氨己基乙基異魯米諾和5-氨丁基乙基-2，3- 二氫-1，4- 酞嗪二酮用于化學(xué)發(fā)光免疫測定已取得較理想的結(jié)果[5]。咪唑類發(fā)光物質(zhì)：以咯吩堿為代表，咯吩堿首先在堿性二甲基亞砜水溶液中反應(yīng)，生成過氧化物中間體，進(jìn)而重排，降解，釋放光子信號[6]。苯酚類發(fā)光物質(zhì)：以鄰苯三酚為代表，屬于強(qiáng)還原劑，在催化劑血紅素的催化下，與H2O2 反應(yīng)釋放光子信號[7]。芳基草酸酯類發(fā)光物質(zhì)：該類物質(zhì)發(fā)光反應(yīng)期間，在體系中加入特殊熒光染料，形成熒光載體，在經(jīng)過氧化草酸酯中間體獲取化學(xué)能，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢姽?，熒光染料的加入極大地提高了發(fā)光效率[8]。

2. 化學(xué)發(fā)光免疫分析

2.1 熒光化學(xué)發(fā)光免疫分析法 熒光化學(xué)發(fā)光免疫分析（FIA）法由于帶檢樣品基質(zhì)干擾限制，靈敏度出現(xiàn)降低。引入內(nèi)源光源作為熒光免疫測定的終點(diǎn)檢測信號，可改善外源光源散射產(chǎn)生的背景噪聲，提高信噪比，改善熒光檢測的靈敏度[9]。但由于TCPO 水溶性較差，需要選擇適宜的有機(jī)溶劑，影響了方法的精密度。該方法目前并未有實(shí)際報(bào)道，仍停留在研究階段[10]。

2.2 化學(xué)發(fā)光免疫分析法 化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）法，是在抗體或抗原上標(biāo)記化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)，通過獲取標(biāo)記物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)時(shí)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，推斷被標(biāo)記抗體或抗原的含量[11]。目前常用的化學(xué)標(biāo)記無，包括魯米諾、異魯米諾及其衍生物，其優(yōu)勢在于：①準(zhǔn)確性和精密度高，均可與放射免疫分析（RIA）法相媲美；②靈敏度高，甚至超越RIA；③檢測時(shí)間短[12]；④反應(yīng)試劑無毒，性質(zhì)穩(wěn)定；⑤易實(shí)現(xiàn)自動化測定；⑥適用性廣。缺點(diǎn)在于抗原或抗體被標(biāo)記過發(fā)光物質(zhì)后，會改變免疫反應(yīng)性能，且發(fā)光劑標(biāo)記率重現(xiàn)性較差[13]。

2.3 電化學(xué)發(fā)光免疫分析法 電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）屬于新型檢測方式，與傳統(tǒng)免疫分析法存在不同，但與普通化學(xué)發(fā)光分析法不同[14]。ECLIA 法將化學(xué)發(fā)光法與電化學(xué)法巧妙地結(jié)合，優(yōu)勢在于高效、特異、靈敏、準(zhǔn)確和適用性廣。與CLIA法不同，ECLIA 法為電催化化學(xué)發(fā)光，是在電極表面發(fā)生的由穩(wěn)定的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)變形成的具有高反應(yīng)活性的發(fā)光反應(yīng)，將電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的底物作為電化學(xué)發(fā)光免疫測定中的標(biāo)記物[15]。ECLIA 法測定模式與酶聯(lián)免疫分析（ELISA）法相似。

2.4 化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法 在傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析方法中，酶的活性一般通過熒光法或催化發(fā)光度法檢測，近年來人們通過化學(xué)發(fā)光反應(yīng)法，檢測酶的活性[16]。從標(biāo)記免疫測定來看，化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析（CLEIA）法，屬于酶免疫測定范疇，靈敏度優(yōu)于放射免疫分析法[17]。與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析相比，CLEIA 法通過化學(xué)發(fā)光檢測酶活性，而不是通過熒光法或催化光度法測定。

3. 電化學(xué)發(fā)光免疫檢測的研究

近年來，人們通過各種方法提高電化學(xué)發(fā)光的檢測靈敏度，包括新的多種標(biāo)記物。今您來，通過各種方法提高電化學(xué)發(fā)光的檢測，包括新的或多種標(biāo)記物[18]。近年來，臨床通過多種方式提高電化學(xué)發(fā)光檢測靈敏度，包括新的或多種標(biāo)記物。在中性溶液中，魯米諾在納米金修飾的電極上可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的化學(xué)發(fā)光。發(fā)光強(qiáng)度不僅和納米金有關(guān)，還受電極的影響，金電極和玻璃碳電極是比較好的電極，而且納米金修飾的金電極和玻璃碳電極還具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，并且不需要對電極做預(yù)處理。電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度還受納米金顆粒大小的影響，用直徑為16 nm 的納米金修飾電極可以產(chǎn)生較強(qiáng)烈的電化學(xué)發(fā)光。無論在中性還是堿性溶液中，魯米諾在銀納米修飾的金電極上都可以產(chǎn)生很強(qiáng)烈的發(fā)光，并且重復(fù)性良好[19]。

納米材料主要以其獨(dú)特的性質(zhì)，開發(fā)新型的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器提供新的思路。由于碳納米管是與適當(dāng)?shù)纳锓肿?、酶、氧化還原媒介物結(jié)合，可提高其選擇性和靈敏度，在生物傳感器的應(yīng)用研究中得到人們的重視[20]。自制的含碳納米作為工作電極，將生物素化的甲胎蛋白抗體在自制的含碳納米管片狀物表面，加入甲胎蛋白與標(biāo)記有發(fā)光物質(zhì)的甲胎蛋白抗體，進(jìn)行免疫反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物。

磁微球由于其獨(dú)特的性質(zhì)在電化學(xué)發(fā)光免疫檢測中獲得了廣泛應(yīng)用，有較大的表面積，可同定較高濃度的抗體、易于分離等。使用磁微球作為固相載體進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光免疫檢測生物標(biāo)志物，進(jìn)一步證明了使用磁微球檢測不僅速度快，而且靈敏度高，可以在相關(guān)領(lǐng)域得到廣泛地應(yīng)用[21]。

4. 小結(jié)

電化學(xué)發(fā)光免疫分析法具有靈感度高且特異性強(qiáng)的優(yōu)勢，已經(jīng)廣泛在抗原、抗體中獲得檢測。由于其線性范圍較寬，符合臨床檢驗(yàn)需求，受到臨床諸多學(xué)者青睞，電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在臨床提供了超微量的非同位素免疫檢測手段，在諸多方面均有廣闊的應(yīng)用前景。

目前電化學(xué)發(fā)光免疫分析已經(jīng)取得了諸多成就，在部分體系中，不僅對探針的電化學(xué)發(fā)光性有一定影響，還會影響抗原抗體的特異性結(jié)合。電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的發(fā)展趨勢在于合成新的發(fā)光標(biāo)記物，建立新的免疫分析方法等，關(guān)于新的研究臨床仍在不斷開發(fā)。